r
7
INSTITUT ZA HISTOLOGIJU I EMBRIOLOGIJU MEDICINSKOG FAKULTETA UNIVERZE U LJUBLJANI
MODIFICIRAJUCI UTICAJ STRESA NA NEKE ENDOKRINE ŽLEZDE MIŠA KOD KASNIH POSLEDICA SUBLETALNOG JONIZACIONOG ZRAČENJA*
Kališnik, M., O. Vraspir-Porenta, M. Logonder-Mlinšek, M. Zorc, T. Lejko-Zupanc, A. Rus, D. Stiblar, J. Skrk
Sažetak: Za studij interakcije stresa i zračenja na miševima oba spola bila su napravljena dva eksperimenta. U prvom pokusu, 6 meseci nakon početka zračenja zracima s dvadeset dnevnih doza po 50 rada, bile su stereoloski analizirane neke endokrine žlezde u 24 miša, od kojih je polovina bila dražena u pravilnim intervalima s kombi-nacijom optičkog signala i blagog električnog udara. U drugom pokusu 120 miševa živelo je do spontane smrti nakon što su bili draženi i/ili zračeni. Stres i zračenje smanjili su aktivaciju štitnjače, te sinergistički uzrokovali atrofiju Leydigovih inter-sticijskih celija. U ovariju je interakcija obiju faktora okrepila hiperplaziju intersticijskih celija. U nadbubrežni žlezdi draženje je povečalo, a zračenje smanjilo vakuolizaciju celija. Oba faktora zajedno smanjila su pojavu involutivnih gigantskih celija u kori. Životinje ispostavljene zračenju bile su lakše, a draženju teže. Zračenje im je skratilo preživljavanje, draženje produžilo. Prema torne je eustres ublažio štetne, katabolične posledice zračenja.
UDK 616-092.9-001.2
Deskriptori: miši, učinki sevanja, stres, električna stimulacija, endokrine žleze, de-reološka analiza.
Radiol. lugosl., 13; 507-512, 1979
L
Uvod — ■ O dejstvu stresa na endokrine žlezde izvestili smo u seriji članaka (1, 2, 3, 4, 5, 6). Pokazali smo, s kvantificiranim histološkim podacima, da stres aktivira nadbubrežnu žlezdu i deprimira štitnjaču kao i gonade.
0	kasnom dejstvu subletalnog ionizacionog zračenja na iste organe izvestili smo u drugoj studiji (7) i prikazali prilično različite efekte, koji su pre svega posledica vece ili manje destrukcije, kojoj je sledila više ili manje uspešna regeneracija odnosno rediferencijacija. Neke strukturne promene nakon iradiacije mogli bi tumačiti kao po-sledicu promjene centralne neuroendokrine regulacije ili postradijacionog stresa. Tako je glandula thyroidea bila manje aktivirana. Testis je bio jedva alteriran. Najvece promene pokazale su se na ovariju: bio je bez oocita i folikla, uključno atretičnih, intersticijske celije bile su hipertrofične i hiperplastične. Kora nadbubrežne žlezde bila je zadebljana. Zona fascikulata bila je manje vakuolizirana nego normalno i hipertrofična, pre svega na račun drugih dviju zona.
U toj studiji zanimala nas je interakcija stresa
1	jonizirajučeg zračenja: da li su učinci sinergi-
* Prikazano na Simpoziju o nervnom i endokrinom sistemu Društva anatoma SR Srbije 10. novembra 1978 u Beogradu.
stični ili antagonistični i da li se mogu pojaviti nove kvalitete kod učinka oba faktora? Ako se radi o disocijaciji učinaka na razne endokrine žlezde, kakav je efekat kombinovanog delovanja stresa i zračenja na vitalne funkcije organizma kao celine?
Materijal i metode — Na miševima oba spola napravili smo dva eksperimenta. U prvo-me smo 24 miša soja CBA, od kojih je bila polovica muškog i polovica ženskog spola u starosti 1,5 meseci, razdelili u tri grupe po 8 živo-tinja. U svakoj grupi bila je polovica životinja dražena u pravilnim intervalima kombinacijom optičnog signala i blagog električnog udara na dno kaveza; druga polovina bila je nedražena kontrola. Prva takva grupa bila je žrtvovana na-kon jednomesečnog draženja u starosti 2,5 meseca. Ujedno smo počeli s totalnim zračenjem gama zracima sa 20 uzastopnih dnevnih doza po 50 rada (140 rad/min) tako, da je ukupna doza dostigla 1000 rada. Životinje su bile zračene u šupljim kotačima iz pleksi stakla, koji su bili podeljeni u 16 odvojenih, 2,7 cm visokih i 7 cm dugih prostora. Od stajice do mesta zračenja konfinirali smo i prevozili i nezračene životinje tako, da su sve bile zatvorene u tim kotačima približno jedan sat dnevno (sl. 1). Zra-
Rad primljen: 20. 12. 1978.
507
Kališnik M., O. Vraspir-Porenta, M. Logonder-Mlinšek, M. Zorc, T. Lejko-Zupanc, A. Rus, D. Stiblar, J. !:;<rk
Slika 1 - Šuplji kotači iz pleksi stakla u kojima Slika 2 - Kavez za miševe ureden za zračenje. Omo-se konfiniraju miševi za vreme zračenja.	gucava proizvoljno kretanje u vodoravnom smeru,
a sprečava puzanje.
čenu, kao i nezračenu skupinu miševa žrtvovali smo 6 meseci nakon početka zračenja u starosti od 8,5 meseci. Nakon žrtvovanja u ete-rovoj narkozi oduzeli smo nadbubrežnu žlezdu, štitnjaču, ovarij i testis, te ih fiksirali u Bouinovi tekučini, zalili parafinom, rezali u stepenaste serije ca. 6 ^.m debelih rezova i bojili hemato-ksilinom-eozinom. Sa sistematičkom stereolo-škom analizom kod povečanja objektiva 10x i 63 x odredili smo volumensku gustoču i apso-lutni volumen, površinsku gustoču i apsolutnu površinu, dužinsku gustoču i apsolutnu dužinu, te brojnu gustoču i apsolutni broj pojedinih tkivnih i čelijinih sastojaka u proučavanim orga-nima. Analizom varijance studirali smo uticaj draženja, zračenja i njihove interakcije; o poslednjem izveštavamo u ovom članku.
U drugom eksperimentu 120 miševa soja Balb/C, polovicu mužjaka i polovicu ženki, podelili smo na 4 jednake grupe od kojih su 2 bile dražene od trečeg meseca starosti dalje na isti način kao u prvom eksperimentu, a 2 nedra-žene kontrole. Po jedna dražena i nedražena grupa u starosti od 4 meseci, bila je ispostav-ljena zračenju na jednak način kao u prvom eksperimentu s tom razlikom, da životinje nisu bile konfinirane u šuplje kotače, več u kavezima pokrivenim perforiranom pločom iz pleksi sta-kla, koje je omogučavalo kretanje životinja samo u vodoravnom pravcu, dok je penjanje po kavezu bilo sprečeno. Po jedna dražena i nedražena grupa bile su prividno zračena (sl. 2). Životinje su jednom sedmično vagane, a odredivana je
i potrošnja hrane. Živele su do spontane smrti, nakon koje smo ih obducirali. Za statističku ana-lizu upotrebili smo Študentov test.
Rezultati — Na štitnu žlezdu delovali su stres kao i iradijacija (sl. 3) u istom smislu tj.
/um 11
10
P< O ,02
N
Slika 3 — Zračenje (1) signifikantno snizuje (P < 0,02) prosečnu visinu epitela štitnjače (x ± SEM) u pore-denju sa nezračenim životinjama (N).
508
Modificirajuci uticaj stresa na neke endokrine žlezde miša kod kasnih posledica
smanjili su aktiviranost; interakcija oba faktora nije imala signifikantnog dodatnog uticaja.
Na Leydigove intersticijske celije testisa stres i iradijacija imali su sinergističko dejstvo, njihova volumenska gustoca dodatno se je smanjila u grupi, koja je dražena i iradiirana (sl. 4).
*Vh
|mm'J 0,8
0-7 0.6 05 0-4 0.3 0.2 O.1
o
P,<0, 02 P, < 0.00S P..,<O, 005
N
K
s
Va 1,4
l,J
1.2
1, <
P|< 1,114 Pj < <,1111 P||< 1,114
N 1 K
N
s
Slika 5 — Apsolutni volumen atretičkih folikula u prvom pokusu (oznake kao na slici 4).
7V|
Slika 4 — Volumenska gustoca Leydigovih intersti-cijskih stanica testisa životinja pod uticajem stresa (S) te kod nedraženih kontrola (K), kao i kod zračenih (l) i nezračenih (N) životinja. Upisani su nivoji rizika za odbijanje nulte hipoteze za učinak stresa (S), iradija-cije (1) i interakcije (S, 1).
Na ovariju stresor je signifikantno povečao apsolutni volumen atretičkih folikula (što smo tumačili kao posledicu kočenja ovulacije i devi-jaciju sazrevanja folikula u pravcu atrezije). U jajnicima zračenih miševa, suprotno, uopče nismo našli atretične folikule (niti druge oblike ovarijskih folikla). Interakcija stresa i radijacije na atretičkim foliklima bila je signifikantno divergentna (sl. 5). Na drugoj strani samo u ova-rijima zračenih životinja pojavile su se intersti-cijske celije. Interakcija stresa i iradiacije ovde je delovala sinergistički, tj. zapreminska gustoca intersticijskih celija bila je najveca u grupi životinja, koje su bile zračene i dražene (sl. 6).
U nadbubrežnoj žlezdi stresor i iradijacija antagonistički su delovali na volumensku gu-stocu vakuola u celijama nadbubrežne žlezde,
1,4
1,1
1, 2
P| < 1,11
Pl < 1,11 P||< 1,11
J
N	N
K	S
Slika 6 — Volumenska gustoca intersticijskih stanica u prvom pokusu (oznake kao na slici 4).
N
Radio!. lugosl., 13; 507-512, 1979
509
Kališnik M., O. Vraspir-Porenta, M. Logonder-Mlinšek, M. Zorc, T. Lejko-Zupanc, A. Rus, D. Stiblar, J. !:;<rk
napose kore. Stresor je povečao, a iradijacija smanjila vakuolizaciju, kod čega je dejstvo interakcije takoder signifikantno (sl. 7). Na drugoj
'Vv
[Si
1.14
P, < 1,1111 P; < Ulll P,,< 1,1111
; N
s
N
K
M
j
■n
MRIJ 1,111
1,111 1,111 1,111 1,114 1,11? 1,111
P,- < 1,1111 P, < 1,1111 P,,; < 1,1111
N
s
N
K
Slika 8 — Volumenska gustoča mnogojedarnih slanica u kori nadbubrežne žlezde u prvom pokusu (oznake kao na slici 4).
Slika 7 — Volumenska gustoča vakuola u slanicama nadbubrežne žlezde u prvom pokusu (oznake kao na slici 4).
strani sam stres signifikantno je povečao volu-mensku gustocu žila, dok je iradijacija imala disocijirano dejstvo: kod životinja pod stresom smanjila je, a kod nedraženih povečala iriga-ciju. Konačno su stres i iradijacija sinergistički signifikantno smanjili volumensku gostocu mno-gojezgrenih gigantskih celija, kod čega je bila takode interakcija dodatno signifikantna (sl. 8).
Težina zračenih miševa oba spola, napose ženski, je od 3. meseca nakon zračenja dalje, skoro celo vreme signifikantno zaostajala za te-žinom nezračenih miševa (sl. 9). Težina draže-nih životinja oba spola skoro za čitavo vreme eksperimenta, signifikantno je prevazilazila te-žinu nedraženih kontrola (sl. 1O). Kod nedra-ženih, zračenih životinja težina je zaostajala za težinom nezračenih životinja, dok kod dra-ženih životinja razlika u težini zračenih i nezračenih nije bila tako očita; opisane razlike nisu signifikantne, vec su istosmislene kod oba pola.
Slika 9 — Težina zračenih (1) i nezračenih (N) životinja za vreme drugog opita. Na apscisi su navedeni meseci nakon završenog zračenja (O). Znak + znači P < 0,05, ++ P < 0,01, + + + P < 0,001.
Slika 10 — Težina životinja koje su bile pod uticajem stresa (S) i bez njega (N) u drugom pokusu (oznake kao na slici 9).
U potrošnji hrane nije bilo signifikantne razlike medu grupama.
Preživljavanje zračenih miševa oba spola je od 9. meseca nakon zračenja dalje signifikantno smanjeno (sl. 11). Preživljavanje draženih ženki očito je produženo, dok preživljavanje draženih
510
Modificirajuci uticaj stresa na neke endokrine žlezde miša kod kasnih posledica
mužjaka nije, se je zbog toga razlika u preživ-Ijavanju kod oba spola signifikantna samo u 11. mesecu nakon zračenja (sl. 12).
"t	I	a	F	4	•	I	I	1	|- H- |r' m
Slika 11 — Kumulativna smrtnost iradiiranih (1) i ne-iradiiranih (N) miševa u drugom pokusu (oznake kao na slici 9).
*r
• ' i i i i i t * i i
Slika 12 — Kumulativna smrtnost životinja, koje su bile pod uticajem stresa (S) i nedraženih kontrolnih životinja (N) u drugom pokusu (oznake kao na slici 9).
Diskusija — Mehanizam delovanja stresa i iradiacije samih za sebe na endokrine žlezde dosta je dobro objasnjen (8, 9). Literatura o interakciji oba faktora prilično je škrta. U našem primeru podražaj, koji je delovao stresogeno bio je blag i pojavljivao se u pravilnim intervalima. Zato mislimo, da je bila postignuta faza adaptacije, odnosno stanje eustresa prema Selyeju (10), što bi prema našim očekivanjima povečalo nespecifičnu otpornost prema raznim noksama, uključivo jonizacionim.
Mehanizam inhibitornog dejstva stresa i zračenja na štitnjaču bio bi isti, tj. smanjenje sekre-cije TSH zbog povečanja sekrecije ACTH; bu-duči da oba činioca zajedno nisu signifikantno povečali taj učinak, možemo zaključiti, da je bio učinak svakog za sebe več maksimalan. lnhibi-torno delovanje kombinacije stresa i iradijacije na Leydigove intersticijske čelije u testisima, kao producente androgena, moglo bi biti posledica poremečene centralne neuroendokrine regulacije, koja bi dovela do smanjene sekrecije LH, dok gotovo intaktni semeni epitel govori da
sekrecija FSH nije bila poremečena. U suprot-nosti s testisima, u kojima vidimo postiradijacij-sku restituciju skoro ad integrum, kasne promene u zračenim ovarijima vrlo su teške. Mišji oociti zapravo vrlo su radiosenzitivni te su u našim pokusnim uslovima bili skoro posve uni-šteni, zajedno s pripadajučim foliklima, čija funkcija u normalnim prilikama je takode sekrecija estrogena. To je verovatno bio dovoljan razlog za kompenzacijsku hiperplaziju intersticijskih čelija, kojima takode pripisuju sekreciju estro-gena. Draženje je očito ubrzalo tu kompenza-cijsku pojavu, koja je verovatno posledica joni-zacione povrede. Posledica interakcije draženja i zračenja na nadbubrežnu žlezdu su kontra-verzne. Delovanje stresa je očito stimulatorno, što se izražava u povečanoj vakuolizaciji čelija i jačoj krvnoj irigaciji, na drugoj strani kočena je involucija, koju označava porast mnogojezgre-nih gigantskih čelija, znakovima piknoze u jezgri-ma. Postiradijaciono smanjenje vakuolizacije moglo bi da bude znak nedovoljne rediferencija-cije ili moguče »iscrpljene« hiperaktivnosti zbog iradijacijonog stresa. Kočenje pojava involucij-skih gigantskih čelija radi postiradiacijske regeneracije je razumljivo delovalo sinergistički stresu radi draženja.
Iz kretanja telesne težine miševa u drugom poskusu možemo zaključiti, da su posledice zračenja katabolične; smrtnost životinja nakon zračenja bila je takode ubrzana. Nasuprot torne draženje je delovalo anabolički i sprečavalo smrtnost. Prema torne je blago draženje u pravilnim intervalima delovalo na metabolizam antagonistički zračenju; s draženjem bio je do-stignut eustres, koji je blažio štetne posledice jonizacijonog zračenja. Zanimljivo je, da je bila reaktivnost ženki veča nego mužjaka; to je u skladu s večim promenama u strukturi ovarija u usporedbi s testisima.
Potrebno je dodati, da se pokusne okolnosti prvog i drugog pokusa razlikuju u tri točke: u prvom pokusu bili su miševi soja CBA na po-četku zračenja stari 2,5 meseca, a za vreme zračenja bili su konfinirani (to bi mogao biti dodatni stresor), u drugom, bili su miševi soja Balb/C na početku zračenja stari 4 meseca i za vreme zračenja nisu bili konfinirani; tirne smo želeli smanjiti preveliku opču smrtnost, koja nam je pokvarila neki raniji tovrsni pokus. Za-pravo, zanima nas takode radijacijska karcino-geneza kod draženih životinja, što če biti sadržaj drugog izveštaja.
Radiol. lugosl.. 13: 507-512. 1979
511
Kališnik M., O. Vraspir-Porenta, M. Logonder-Mlinšek, M. Zorc, T. Lejko-Zupanc, A. Rus, D. Stiblar, J. !:;<rk
Summary
MODIFYING ACTION OF STRESS ON EFFECTS OF SUBLETHAL IONIZING
RADIATION OBSERVED IN SOME ENDOCRINE GLANDS OF MICE
Two experiments were carried out on mice of both sexes in view of studying the interaction of stress and irradiation. In the first experiment 24 mice of CBA strain were distributed into 3 groups; half of the animals of each group were irritated by an optic signal followed by a mild electric shock repeated at equal intervals, whereas the other half were not subjected to stress. The animals of group 1 were sacrificed one month after the beginning of the experiment, when group 2 was subjected to gamma irradiation with 20 successive daily doses of 50 rad (140 rads/min), the total dosage amounting to 1000 rad. Group 3 comprised the nonirradiated animals. Groups 2 and 3 were sacrificed 6 month after the initiation of irradiation. From the animals, thyroid gland, testis, ovary and adrenal were taken tor the systematic stereological analysis using light microscope. — In the second experiment, 120 mice of Balb/C strain were distributed into 4 groups: 2 irritated and 2 nonirritated groups, of which one irritated and one nonirritated group were exposed to irradiation using the same schedule as in the first experiment. The animals were weighed weekly and the food intake was measured through-hout. They lived until their spontaneous death.
Both, stres and irradiation diminished the activity of the thyroid gland, the interaction of the two, however, entailed no significant additional effect. — In the testes, stress and irradiation caused a synergistic decrease in the volume density of the Leydig's interstitial cells. — In ovaries, stress brought about an increase in the absolute volume of the atretic follicles whereas irradiation destroyed all the follicles including the atretic ones and induced hyperplasia of the interstitial cells. Animals exposed to both, stress and irradiation showed a greater volume density of the interstitial cells, which spoke tor a synergistic interaction of stress and irradiation. — The effects entailed on the adrenal were dissociated. Stress promoted the vacuolization, while irradiation decreased it, the effect of interaction being additionally significant. Stress, per se, increased the volume density of the blood vessels and irradiation showed results of opposite direction in irritated and nonirritated animals. Both, stress and irradiation diminished the volume density of multinucleate giant cells in the adrenal cortex, the results of interaction were additionally significant and had the same direction. — The irradiated mice had lower body weight as compared to the nonirradiated animals, whereas the irritated mice were heavier than the non-irritated ones. The survival of the irradiated mice was shortened as compared to the nonirradiated ones, while the irritated mice had prolonged survival times as compared to the nonirritated animals.
Mild stress applied at equal intervals induced the state of eustress, which had an anabolic and anta-gnostic action against the catabolic effect of irradiation. Eustress was found to reduce the ill late effects of ionizing radiation.
Literatura
1.	Kališnik M. et al.: Vpliv psihosomatskega stresa na nekatere endokrine žleze seva CBA. Zdrav. vestn. 45 (1976), 567-570.
2.	Logonder-Mlinšek M., M. Kališnik, D. Štiblar: Uticaj psihosomatskog stresa i presadenog Ehrlicho-vog ascitesnog tumora na štitnjaču miševa. Folia anat. iugosl. 6 (1977), 51-56.
3.	Vraspir-Porenta O., M. Kališnik, R. Pleskovič-Zorc: Uticaj psihosomatskog stresa i Ehrlichovog ascitesnog tumora (EAT) na jajnike kod miševa. Folia anat. iugosl. 6 (1977), 57-62.
4.	Zorc M., M. Kališnik, D. Štiblar: Utjecaj psiho-somatskog stresa i presadenog Ehrlichovog asci-tesnog tumora na suprarenalnu žlezdu miša soja CBA. Folia anat. iugosl. 7 (1978), 57-64.
5.	Zorc M., M. Logonder-Mlinšek, M. Kališnik: Uticaj stresa na suprarenealnu i štitastu žlezdu miša. lnternational Symposium on Neuroendocrine Regulatory Mechanisms. Proc. serb. Acad. Sci. (u štampi).
6.	Kališnik M., A. Rus, T. Lejko: Uticaj stresa na testis miša. lnternational Symposium on Neuroendocrine Regulatory Mechanisms. Proc. serb. Acad. Sci. (u štampi).
7.	Kališnik M. et al.: Histological and stereological analysis of some endocrine and lymphatic organs of mice after total body irradiation. lnternational symposium on the late biological effects of ionizing radiation, Vienna, 13—17, March 1978 (in press).
8.	Mason J. W.: Organization of the multiple endocrine responses to avoidance in the monkey. Psychosom. Med. 30 (1968), 774—788.
9.	Sommers S. C.: Effects of ionizing radiation upon endocrine glands. U: Berdjis C. C. (ed.), Pathology of irradiation. Williams and Wilkinson, Baltimore 1971, 408—446.
10. Selye H.: Stress without distress. World Health, December 1974, 3—11.
Zahvale
Autori zahvaljuju Raziskovalnoj skupnosti Slovenije za subvencioniranje tog rada u okviru projekta Endo-krinij i malignomi, nadalje tehničnim saradnicima Instituta za histologiju i embriologiju, pre svega labo-rantima Ivanu Mavriču i Nadi Plevnik, slikarici Veri Fettich, abs. med. Tomu Brezovaru iz Instituta za pa-tološku morfologiju MF u Ljubljani za fotografije.
Adresa autora: Prof. dr. Miroslav Kališnik, Inštitut za histologijo in embriologijo MF, 61105 Ljubljana, p. p. 10.
512