Strokovni prispevek/Professional article
KAKOVOST BLASTOCIST IN VITRO IN VEČPLODNA
NOSEČNOST
QUALITY OF BLASTOCYST IN VITRO AND MULTIPLE PREGNANCIES
Borut Kovačič, Mojca Čižek-Sajko, Veljko Vlaisavljevic
Oddelek za reproduktivno medicino in ginekološko endokrinologijo, Služba za ginekologijo in perinatologijo, Splošna
bolnišnica Maribor, Ljubljanska 5, 2000 Maribor
Prispelo 2003-05-14, sprejeto 2003-06-19; ZDRAV VESTN 2003; 72: Supl. II: 89-92
Ključne besede: morfologija blastocist; oploditev in vitro; im-plantacija; večplodna nosečnost
Izvleček - Izhodišča. Blastociste, kijih dobimo v postopku oploditve z biomedicinskopomočjo (OBMP), imajo različne morfološke značilnosti. Namen raziskave je ugotoviti, kako morfologija blastocist, prenesenih v maternico, vpliva na zanositev in večplodno zanositev.
Metode. Kakovost blastocist smo ocenjevali s štirimi parametri: deležem zarodka, preoblikovanega v blastocisto, razširjenostjo blastocela, obliko notranje skupine celic in z razrastjo celic trofektoderma. V prvo skupino smo uvrstili blastociste, ki so imele optimalne vse parametre, v drugo skupino blasto-ciste z enim neoptimalnim parametrom in v tretjo skupino blastociste z več neoptimalnimi parametri. Retrospektivno smo analizirali rezultate 175 prenosov dveh blastocist iz prve skupine, 65 prenosov dveh blastocist iz druge skupine in 20 prenosov dveh blastocist iz tretje skupine.
Rezultati. Delež blastocist, ki so se ugnezdile v maternici, je bil najvišji v prvi skupini in se je statistično značilno razlikoval v primerjavi z drugo in tretjo skupino (54,7% oz. 31,5% oz. 7,5%; p < 0,05). Po prenosu dveh optimalnih blastocist smo v primerjavi z ostalima skupinama dosegli največ zanositev (62,3% oz. 40% oz. 15%;p <0,05). Delež večplodnih nosečnosti je bil v prvi skupini 56,9%, v drugi 23%, v tretji skupini pa večplodne nosečnosti ni bilo.
Zaključki. Pri izboru blastocist za prenos v maternico je koristno upoštevati njihove morfološke značilnosti. Z našo ocenjevalno lestvico je možno izbrati blastociste z najvišjo kakovostjo. Ker je pri njih verjetnost ugnezditve več kot 50%, lahko brez tveganja vrnemo samo eno takšno blastocisto in se izognemo večplodnim nosečnostim.
Key words: blastocyst morphology; in vitro fertilization; implantation; multiple pregnancy
Abstract - Background. The blastocysts, obtained from in vitro fertilization, have different morphologic characteristics. The aim of the study is to investigate the effect of morphology of transferred blastocysts on pregnancy and multiple pregnancy rate.
Methods. The quality of blastocysts was evaluated by four parameters: amount of embryo mass transformed into the blastocyst, blastocoel expansion, shape of inner cell mass and proliferation of trophectoderm cells. In the first group the blastocysts with four optimal parameters were arranged. The second group was formed from blastocysts with one nonoptimal parameter and the third group from blastocysts with more nonoptimal parameters. The results of 175 transfers of two blastocysts from first group, 65 transfers of two blastocysts from second and 20 transfers of two blastocysts from third group were analysed retrospectively.
Results. Implantation rate was the highest in the first group of transfers and differed significantly in comparison to second and third group (54.7% vs. 31.5% vs. 7.5%; p < 0.05). Most pregnancies were achieved after the transfer of two optimal blastocysts in comparison to other groups of transfers (62.3% vs. 40% vs. 15%; p < 0.05). Multiple pregnancy rate was 56.9% in the first group, 23% in the second group, while in the third group of transfers there was no multiple pregnancy.
Conclusions. By selecting the blastocysts for transfer into the uterus it is advantageous that blastocsyt morphology characteristics are taken into the consideration. Using our blastocyst scoring system it is possible to select out the high quality bla-stocysts. The probability of implantation by them is more than 50%, for that reason only one such blastocyst could be transferred without any effect on pregnancy rate.
Uvod
Razvoj novih gojišč za kulture in vitro je omogočil spremljanje razvoja zarodkov zunaj telesa matere do petega dneva od njihovega spočetja, tj. do stadija blastociste (1). Zarodke gojimo dalj časa v pogojih in vitro z namenom, da bi med njimi
lahko izbrali najprimernejše za prenos v maternico. Izbor ne temelji zgolj na morfoloških merilih, temveč delno tudi na osnovi vitalnosti, saj se do blastociste uspe razviti samo od 40 do 70% spočetih zarodkov (2).
Prenos blastocist v maternico je omogočil višjo ali vsaj enako stopnjo zanositve v primerjavi s prenosom zgodnejših embri-
onalnih stadijev. Razlika pa je nastala v številu vrnjenih zarodkov, saj smo v preteklosti vračali tudi štiri zarodke, sedaj pa samo eno ali dve blastocisti (2). Kljub temu se večplodnim nosečnostim ne moremo izogniti.
Vrnjene blastociste imajo višjo sposobnost vgnezditve v primerjavi z zgodnjimi zarodki, vendar pa se ta sposobnost razlikuje tudi med blastocistami samimi. Verjetnost vgnezditve posamezne blastociste je za terapevta pomemben podatek, še zlasti ko se med več razpoložljivimi blastocitami odloča za prenos samo ene.
Različne metode za izbiro optimalne blastociste z dobrimi razvojnimi sposobnostmi so že bile objavljene, od biokemijskih do morfometrijskih. Določanje koncentracij posameznih rastnih faktorjev in hormonov, ki bi jih naj v svojo okolico izločale blastociste, so obetavne, vendar zapletene in drage ter za vsakdanjo rabo še neuporabne metode (3-6). Ocenjevanje morfologije je zato zaenkrat še vedno najpogosteje uporabljena metoda pri izbiri blastocist za prenos v maternico, vendar pa se morfološka merila med posameznimi centri IVF zelo razlikujejo.
Najenostavnejši ocenjevalni sistem uporablja le eno merilo, tj. prisotnost blastocela. Ta ocenjevalni sistem je poznan iz testa za določanje kakovosti pogojev laboratorijskega dela postopka OBMP z mišjimi zarodki, ki se morajo v čim večjem deležu razviti do blastocist (7-8).
Najpogosteje je za oceno morfologije blastocist uporabljen Gardnerjev model ocenjevanja velikosti blastocela, oblike notranje skupine celic (ICM) in razrasti celic trofektoderma hkrati (1). Model opredeljuje optimalno blastocisto, ne vemo pa, kakšna je biološka kakovost ostalih tipov blastocist.
V	naši raziskavi smo uporabili različico Gardnerjevega modela ocenjevanja. Retrospektivno smo ugotavljali, kakšna je sposobnost vgnezditve treh morfoloških tipov blastocist. Zanimalo nas je tudi, kakšna je vrednost našega modela ocenjevanja kakovosti blastocist pri napovedovanju zanositve in večplo-dne nosečnosti po prenosu dveh blastocist.
Material in metode
Zasnova raziskave
V	statistiko smo zajeli vse zaporedne hormonsko spodbujane cikle IVF/ICSI (n = 260) v letih 2001 in 2002, v katerih smo opravili prenos 2 enako kakovostnih blastocist. Kakovost pre-nešenih blastocist smo ocenili po modificiranih Gardnerjevih merilih in oblikovali tri razrede, v katere smo jih razvrstili. Retrospektivno smo analizirali izid postopka OBMP glede na kakovost prenešenih blastocist.
Bolnice in zdravljenje
V	analizo smo vključili samo ženske, ki so se zdravile zaradi neplodnosti s postopkom OBMP in so bile mlajše od 40 let. Vključitveno merilo za spodbujanje ovulacije pri ženski je bila koncentracija folikle spodbujajočega hormona (FSH), ki je morala biti pod 10 mIE/ml, in koncentracija estradiola (E2) pod 0,1 nmol/l. Vse ženske so med prvim in sedmim dnevom menstruacijskega cikla dobile oralne kontraceptive, 0,05 mg ethinil estradiola in 0.5 mg norgestrela (Stediril, Krka, Novo mesto, Slovenija), ki so jih jemale najmanj 18 in največ 35 dni. Celotna skupina žensk je prenehala z jemanjem kontracepti-vov na isti dan. Sedmi dan pred zadnjo tableto stedirila so ženske začele dobivati gonadotropine sproščajoči hormomon (GnRHa) triptorelin (Decapeptyl 0,1mg) ali goserelin (Zoladex 3,6 mg, Zeneca, Cheshire, Velika Britanija). Spodbujanje z gonadotropini (150 ali 225 IE dnevno, Gonal F, Serono, Ženeva, Švica) se je začelo sedmi dan po zadnji tableti stedirila. Prvi ultrazvočni pregled smo opravili osmi dan zdravljenja z gonadotropini. Spodbujanje smo zaključili z 10.000 IE huma-
nega horionskega gonadotropina (Profasi, Serono, Aubonne, Švica), ko je vodilni folikel dosegel 18 mm. Pukcijo foliklov smo opravili 36-37 ur kasneje.
Kulture jajčnih celic in zarodkov in vitro
Za kulture smo uporabili gojišča firme MediCult (Jyllinge, Danska). Vsa gojišča smo prelili s parafinskim oljem in pred uporabo za 24 ur izpostavili atmosferi s 37 'C, 95-odstotno relativno vlažnostjo in 5-odstotnim CO2. Jajčne celice smo zbrali v gojišču za izpiranje (Flushing medium) in jih nato prestavili v gojišče za zgodnje zarodke (BlastAssist, Medium 1). V postopku klasične zunajtelesne oploditve smo jajčne celice oseme-nili s 150.000 do 250.000 gibljivimi semenčicami. Jajčnim celicam, namenjenim za oploditev z vnosom semenčice v njihovo citoplazmo (ICSI), smo odstranili celice kumulusa oopho-rusa in jih oplodili mehansko. Tretji dan smo zarodke prenesli v gojišče za blastociste (BlastAssist System, Medium 2), kjer smo jih pustili do petega dneva.
Za prenos blastocist v maternico smo uporabili mehki kateter (Labotect, Gottingen, Nemčija).
Morfološka ocena blastocist
Morfologijo blastocist smo ocenjevali pet dni po osemenitvi, najprej na stereo mikroskopu (SMZU, Nikon, Japonska) pri povečavah med 7,5- do 75-krat, ki je omogočal tudi obračanje blastocist s pomočjo pipetiranja. Oceno smo preverili še na invertnem mikroskopu (IMT-2, Olympus, Japonska) pri 100- do 300-kratni povečavi. Vse blastociste na dan 5 smo ocenjevali prvič zjutraj ob 7.30, ko smo pripravljali poročilo laboratorija o prenosih zarodkov, in nato še enkrat čez tri ure, ob samem prenosu.
Morfologijo blastocist smo ocenjevali s štirimi parametri hkrati.
Prvi je bil delež zarodka znotraj zone pelucide, preoblikovanega v kompaktno morulo oz. blastocisto, ki smo ga izrazili z odstotki.
Drugi parameter je bil zrelost blastociste. Blastocisto smo ocenili kot zrelo, če je blastocel popolnoma izpolnjeval zarodek. Kot zgodnjo blastocisto smo smatrali tisto, ki je imela opazen blastocel, vendar le-ta ni izpolnjeval celotnega zarodka. V to kategorijo smo uvrstili tudi kompaktne morule, pri katerih smo na obodu embrija lahko opazili, da so formirane iz več kot 10 blastomer, ki so med seboj tesno povezane v kompaktno tvorbo. Nekompaktnih morul na dan 5 nismo uvrščali med zgodnje blastociste.
S tretjim parametrom smo ocenili notranjo skupino celic (ICM - inner cell mass), vendar le pri zrelih blastocistah. Ta je bila normalna, če je bila okrogla ali ovalna. Kot neoptimalne smo šteli vse ICM, ki so bile fragmentirane, ali pa so celo manjkale. Četrti parameter je služil za oceno trofektoderma. Normalen trofektoderm je bil iz številnih elipsastih, med seboj povezanih celic. Trofektoderm, ki je med sploščenimi celicami vseboval številne okrogle celice ali z membrano obdane citopla-zemske vključke, nismo ocenili kot normalen. Na osnovi upoštevanja vseh parametrov hkrati smo postavili tri morfološke razrede: prvega, v katerega smo uvrstili blasto-ciste z vsemi štirimi optimalnimi parametri drugega, z enim neoptimalnim parametrom in tretjega z več neoptimalnimi parametri hkrati (sl. 1-3).
Ugotavljanje nosečnosti
Nosečnost smo dokazovali 14 dni po prenosu zarodkov v maternico s kvantitativnim določanjem beta horionskega gona-dotropina v serumu in 14 dni kasneje potrdili z ultrazvočnim dokazovanjem prisotnosti rumenjakovega mehurčka in srčne akcije.
Sl. 1. Optimalna blastocista. V blastocisto se je preoblikoval celoten zarodek, blastocel (BC) izpolnjuje večji del blastociste, notranja skupina celic (ICM) je povezana s tesnimi medcelič-nimi stiki in je ovalne oblike, celice trofektoderma (TE) tvorijo mnogocelični epitel.
Figure 1. Optimal blastocyst. Blastocyst is formed from all embryonic blastomers, blastocoel (BC) fills whole blastocyst, inner cell mass (ICM) is a compact and oval form, trophecto-derm (TE) is a multicellular cohesive epithelium.
Sl. 3. Slaba blastocista. V blastocisto (BL) se je preoblikovalo le okoli 60% blastomer. Blastocista kljub petdnevnemu gojenju še nima obsežnega blastocela. V blastocisti so opazni celični fragmenti.
Figure 3. Poor blastocyst. Only 60% of blastomers were transformed into the blastocyst (BL). Blastocoel is not expanded in spite of five days of culture. Many celullar fragments are visible in the blastocyst.
Sl. 2. Povprečna blastocista s pomanjkljivo notranjo skupino celic (ICM). ICM je večcelična, vendar je fragmentirana in ne tvori homogene celične mase.
Figure 2. Fair blastocyst with nonoptimal inner cell mass (ICM). ICM is multicellular, butfragmented and noncompact
form.
Statistična analiza
Za vsak opravljeni cikel smo podatke o značilnostih bolnic, hormonskem zdravljenju in laboratorijskem delu postopka vnesli v računalniški statističen program Statistica, Statsoft (USA). Razlike v frekvencah med primerjanimi skupinami smo ovrednotili s hi kvadrat testom. Razliko smo imeli za statistično značilno, če je blia p vrednost enaka ali manjša od 0.05.
Rezultati
V razpredelnici 1 smo primerjali izid prenosa 2 blastocist z različnimi morfološkimi ocenami. Primerjane skupine ciklov se med seboj niso razlikovale po povprečni starosti žensk, indikacijah, številu porabljenih ampul gonadotropinov in načinu osemenitve jajčnih celic.
Med cikli z dvema prenešenima blastocistama je statistično značilno izstopala le skupina ciklov z dvema dobrima pre-
nešenima blastocistama. V njej smo v primerjavi z drugimi skupinami zabeležili statistično značilno višje število jajčnih celic (9,6 ± 4,1 vs. 8,1 ± 4,2 vs. 7,9 ± 4,7; P < 0,05), zarodkov (7 ± 3,1 vs. 5,2 ± 2,7 vs. 5,1 ± 2,6; P < 0,05) in višji delež razvitih blastocist (71,2% vs. 52,5% vs. 33,8%; P < 0,0001).
Razpr. 1. Vpliv kakovosti prenesenih blastocist na ugnezdi-tev, zanositev in večplodno nosečnost.
Table 1. Effect of quality of transferred blastocysts on implantation, pregnancy and multiple pregnancy rate.
Prenos dveh blastocist Two transferred blastocysts
Optimalni Povprečni	Slabi
Good	Fair	Poor
Št. ciklov (n) No. of cycles (n)
Pozitivni beta hCG (n) Positive beta hCG (n)
Ugnezditev (n) Implantations (n)
Stopnja implantacije (%) Implantation rate (%)
Spontanih redukcij (n) Spontaneous reductions (n)
Nosečnosti (n) Ongoing pregnancies (n)
Večplodnih nosečnosti (n) Multiple pregnancies (n)
Delež zanositev (%) Pregnancy rate (%)
Delež večplodne nosečnost Multiple preg. rate (%)
* Statistično značilna razlika (p < 0,05).
Med skupinami ciklov z dvema prenešenima blastocistama, ki so se razlikovali po kakovosti, smo zabeležili razlike v stopnji implantacije (P < 0,05) in zanositve (P < 0,05). Pri prenosu dveh dobrih blastocist smo dosegli 62,3% zanositev, od tega 56,9% večplodnih nosečnosti. S prenosom dveh
175	65	20
116	32	3
197	41	3
54,7*	31,5	7,5
20	9	0
109	26	3
62	6	0
62,3*	40	15
i	56,9*	23,1	0
povprečno kakovostnih blastocist smo dosegli manj zanositev v primerjavi s prenosom dveh optimalnih blastocist (40% oz. 62,3%; P < 0,005). Delež večplodnih nosečnosti pa se je v primerjavi s prej naštetimi primeri zmanjšal za več kot polovico in znašal 23%. Po prenosu dveh slabih blastocist je zanosilo le 15% žensk, večplodnih nosečnosti pa ni bilo.
Razpravljanje
V	raziskavah o razvojnih sposobnostih blastocist so ugotovili, da se bolj zrele blastociste vgnezdijo v maternico v višjem deležu v primerjavi z nezrelimi blastocistami (9). Delež ugnezdi-tev je še višji po prenosu blastocist, ki so že zapustile ovojnico - zono pelucido (10, 11). Boljše razvojne možnosti imajo tudi blastociste z večjo ICM (12) in mnogoštevilčnim trofektoder-mom (10, 13).
V	našem centru smo uporabili metodo podaljšanega kultivi-ranja jajčnih celic pri vseh bolnicah, saj smo v dosedanjih raziskavah dokazali, da s podaljšanim kultiviranjem ne poslabšamo biološke kakovosti zarodkov niti v ciklih z majhnim številom zarodkov (14-15). Zato smo bili pogosto prisiljeni vračati tudi morfološko neoptimalne blastociste, kar je omogočilo tudi nastavitev študije o ugotavljanju vgnezditvene sposobnosti različnih morfoloških tipov blastocist. Retrospektivna analiza prenosov različno kakovostnih blasto-cist v naši raziskavi dokazuje, da je vrednost naše nove tristo-penjske ocenjevalne lestvice v napovedovanju ugnezditve, nosečnosti in večplodne nosečnosti zelo visoka. Upoštevajoč zgornje izsledke nam je uspelo določiti morfološke značilnosti optimalne blastociste z največjo razvojno sposobnostjo. Verjetnost, da se bo po prenosu v maternico takšna blastocista tudi ugnezdila, je kar 55%. S prenosom dveh takšnih blastocist se verjetnost za zanositev poveča le za 7% in znaša 62%, vendar pa lahko kar v 57% pričakujemo večplodno nosečnost. V primerih, ko imamo na razpolago optimalno blastoci-sto, se tako lahko brez tveganja za manjši uspeh odločimo za prenos ene same blastociste. Pri tej odločitvi je potrebno upoštevati tudi druge klinične dejavnike, kot sta na primer število dotedanjih neuspešnih postopkov OBMP in starost. Optimalne blastociste starejših žensk imajo namreč tudi slabše razvojne sposobnosti. Prav tako se lahko razvojna sposobnost morfološko optimalnih blastocist precej razlikuje med centri, zato je priporočljivo, da si vsak center izračuna svojo verjetnost za zanositve. Morfologijo blastociste je potrebno ocenjevati natančno in pod veliko povečavo. Priporočamo, da jo oceni le izkušen embriolog. Odločitev o prenosu ene ali dveh blasto-cist pa mora biti rezultat posveta ginekologa in embriologa.
V	ciklih, kjer med več razvitimi blastocistami nismo imeli na razpolago nobene optimalne, smo s prenosom dveh subopti-malnih dosegli 40% zanositev. Delež večplodnih nosečnosti pa se je v primerjavi s prej naštetimi primeri zmanjšal za polovico in znašal 23%.
Pri vračanju dveh morfološko slabih blastocist nismo zabeležili nobene večplodne nosečnosti, zato bi lahko brez večjega tveganja prenesli tudi več kot dve blastocisti.
Zaključki
Naš sistem ocenjevanja blastocist je narejen na hkratnem upoštevanju štirih morfoloških parametrov. Iz primerjave implan-tacijske sposobnosti različnih morfoloških tipov blastocist lahko zaključimo, da ocenjevanje morfologije po našem sistemu omogoča izbiro blastociste z največjo implantacijsko sposobnostjo. To so blastociste, pri katerih so optimalni vsi štirje parametri. Pomanjkljivost v enem samem parametru že pomeni nižjo implantacijsko sposobnost.
V primerih, ko imamo na razpolago optimalno blastocisto, se lahko brez tveganja za nižjo stopnjo zanositve odločimo za prenos ene same blastociste, da se izognemo večplodnim nosečnostim.
Literatura
1.	Gardner DK, Schoolcraft WB. In vitro culture of human blastocysts. In: Jansen R, Mortimer D eds. Toward reproductive certainty: fertility and genetics beyond 1999. Carnforth, UK: Parthenon Publishing, 1999: 37888.
2.	Gardner DK, Vella P, Lane M, Wagley L, Schlenker T, Schoolcraft WB. Culture and transfer of human blastocysts increases implantation rates and reduces the need for multiple embryo transfers. Fertil Steril 1998; 68: 848.
3.	Diaz-Cueto L, Gerton GL. The influence of growth factors on the development of preimplantation mammalian embryos. Arc Med Res 2001; 32: 61926.
4.	Hardy K, Hooper MA, Handyside AH, Rutherford AJ, Winston RM, Leese HJ. Non-invasive measurement of pyruvate and glucose uptake and lactate production by single human preimplantation embryo. Hum Reprod 1989; 4: 188-91.
5.	Gardner DK, Lane M, Stevens J, Schoolcraft WB. Nonivasive assessment of human embryo nutrient consumption as a measure of developmental potential. Fertil Steril 2001; 76: 1175-80.
6.	Houghton FD, Hawkhead JA, Humpherson PG, Hogg JE, Balen AH, Rutherford AJ, Leese HJ. Non-invasive amino acid turnover predicts human embryo developmental capacity. Hum Reprod 2002; 17: 999-1005.
7.	Ackerman SB, Swanson RJ, Stokes GK, Veck LL. Culture of mouse preimplantation embryos as a quality control assay for human in vitro fertilization. Gamete Res 1984; 9: 145-52.
8.	Vlaisavljevic V, Kovačič B. Procjena embriotoksičnosti materijala upotreb-ljavanih u radu IVF laboratorija. Jugosl ginekol perinatol 1991; 3: 45-8.
9.	Shoukir Y, Chardonnens D, Campana A, Bischof P, Sakkas D. The rate of development and time of transfer play different roles in influencing the viability of human blastocysts. Hum Reprod 1998; 13: 676-81.
10.	Balaban B, Urman B, Sertac A, Alatas C, Aksoy S, Mercan R. Blastocyst quality affects the success of blastocyst-stage embryo transfer. Fertil Steril 2000; 74: 282-7.
11.	Yoon HG, Yoon SH, Son WY, Im KS, Lim JH. High implantation and pregnancy rates with transfer of human hatching day 6 blastocysts. Fertil Steril 2001; 75: 832-3.
12.	Richter KS, Harris DC, Daneshmand ST, Shapiro BS. Quantitative grading of a human blastocyst: optimal inner cell mass size and shape. Fertil Steril 2001; 76: 1157-67.
1 3. Hartshorne GM, Elder K, Crow J, Dyson H, Edwards RG. The influence of in-vitro development upon post-thaw survival and implantation of cryopre-served human blastocysts. Hum Reprod 1991; 6: 136-41.
14.	Vlaisavljevic V, Kovačič B, Reljič M, Gavric Lovrec V, Čižek-Sajko M. Is there any benefit from the culture of a single oocyte to a blastocyst-stage embryo in unstimulated cycles? Hum Reprod 2001; 16: 2379-83.
15.	Kovačič B, Vlaisavljevic V, Reljič M, Gavric Lovrec V. Clinical outcome of day 2 versus day 5 transfer in cycles with one or two developed embryos. Fertil Steril 2002; 77: 529-36.