Pregledni prispevek/Review article
MOLEKULARNOGENETSKI PRISTOP ZA PRESEJANJE DEDNEGA NEPOLIPOZNEGA KOLOREKTALNEGA
KARCINOMA
MOLECULAR GENETIC APPROACH FOR SCREENING OF HEREDITARY NON-POLYPOSIS
COLORECTAL CANCER
Metka Ravnik-Glavač1,2
1 Inštitut za biokemijo, Medicinska fakulteta, Vrazov trg 2, 1000 Ljubljana 2 Inštitut za patologijo, Oddelek za molekularno genetiko, Medicinska fakulteta, Zaloška 4, 1000 Ljubljana
Prispelo 2005-04-08, sprejeto 2005-07-18; ZDRAV VESTN 2005; 74: 443-8
Ključne besede: molekularnogenetsko presejanje; populacijsko presejanje; analiza mikrosatelitne nestabilnosti; MSI; geni popravljanega mehanizma pri podvojevanju DNK; MMR geni; mutacijska analiza
Izvleček - Izhodišča. Glavni cilj znanja o boleznih pri človeku je, prenesti čim več uporabnih informacij v klinično prakso. Dedni nepolipozni kolorektalni karcinom (HNPCC za angl. hereditary non-polyposis colorectal cancer) ali sindrom Lynch je najpogostejša avtosomno-dominantno dedovana nagnjenost za kolorektalni karcinom, ki zajema 1-2% vseh primerov raka debelega črevesa. Osnova najpogostejšega načina za prepoznavanje sindroma HNPCC je družinska anamneza, kakor jo je opredelila Mednarodna skupina za HNPCC (Amsterdamska merila I in II). Glavni molekularni vzrok za HNPCC je podedovana mutacija v enem od genov, ki kodirajo proteine, odgovorne za popravljanje napak pri podvojevanju DNK (MMR za angl. mismatch repair). Ker so mutacije v genih MMR našli tudi pri družinah, ki niso izpolnjevale amsterdamskih meril, so predlagali, naj bi bile molekularnoge-netske značilnosti sindroma HNPCC lahko prva stopnja pri prepoznavanju sindroma. Več kot 90% tumorjev bolnikov s HNPCC namreč izraža genetsko mikrosatelitno nestabilnost. Ker pa je tudi približno 10% sporadičnih kolorektalnih karci-nomov genetsko nestabilnih v predelih mikrosatelitov, je bilo potrebno razkriti molekularne mehanizme, ki ločijo mikrosatelitno nestabilne tumorje HNPCC od tumorjev sporadičnega izvora. Zdaj je znano, da so pri sporadični obliki visoko mikrosatelitno nestabilnih tumorjev pogoste hipermetilacija v promotorju gena MLH1 ter mutacije v genih BAX in TGFBR2.
Zaključki. Določitev statusa MSI in njegova ločitev na spora-dične tumorje in tumorje HNPCC ter nadaljnja mutacijska analiza v tumorjih HNPCC je pomembna za presejanje in preprečevanje dednega kolorektalnega raka. Nekatere študije, tudi naša, so pokazale, da je obsežna molekularnogenet-ska analiza za sindrom HNPCc izvedljiva in dovolj občutljiva, da opravičuje populacijsko presejanje. Populacijsko pre-sejanje vključuje molekularnogenetsko analizo v povezavi s kolonoskopijo. Kolonoskopija se omeji zgolj na nosilce mutacije. Omogoča, da se bolezen pri njih odkrije v zgodnji fazi, kar zmanjša umrljivost zaradi sindroma HNPCC in močno zniža stroške zdravljenja. Zato smo tudi v Sloveniji začeli po-pulacijskopresejanje za sindrom HNPCC na družinski in mo-lekularnogenetski osnovi.
Key words: large-scale molecular genetic screening; analysis of microsatellite instability; MSI; mismatch repair genes; MMR genes; mutational analysis
Abstract - Background. The main goal of knowledge concerning human diseases is to transfer as much as possible useful information into clinical applications. Hereditary non-poly-posis colorectal cancer (HNPCC) is the most common autosomal dominant inherited predisposition for colorectal cancer, accountingfor 1-2% of all bowel cancer. The only way to diagnose HNPCC is by a family history consistent with the disease defined by International Collaborative Group on HNPCC (Amsterdam criteria I and II). The main molecular cause of HNPCC is a constitutional mutation in one of the mismatch repair (MMR) genes. Since HNPCC mutations have been detected also in families that did not fulfil the Amsterdam criteria, molecular genetic characteristics of HNPCC cancers have been proposed as valuable first step in HNPCC identification. Microsatellite instability is present in about 90% of cancers of HNPCC patients. However, of all MSI colorectal cancers 8090% are sporadic. Several molecular mechanisms have been uncovered that enable distinguishing to some extent between sporadic and HNPCC cancers with MSI including hyperme-thylation of hMLHl promoter andfrequent mutations in BAX and TGFBR2 in sporadic CRC with MSI-H.
Conclusions. The determination of MSI status and careful separation of MSI positive colorectal cancer into sporadic MSI-L, sporadic MSI-H, and HNPCC MSI-H followed by mutation detection in MMR genes is important for prevention, screening and management of colorectal cancer. In some studies we and others have already shown that large-scale molecular genetic analysis for HNPCC can be done and is sensitive enough to approve population screening. Population screening includes also colonoscopy which is restricted only to the obligate carriers of the mutation. This enables that the disease is detected in earlier stages which would greatly decrease medical treatment costs and most importantly decrease mortality. In Slovenia we have started population screening based on molecu-largenetic and high-risk clinical bases.
Uvod
V zadnjih treh desetletjih je razumevanje genetike raka zelo napredovalo. Večino začetnih molekularnogenetskih raziskav so naredili prav na kolorektalnih tumorjih. Kot model za genetske študije so ga izbrali zaradi naslednjih vzrokov: kolon je mesto, kjer se pogosto razvijejo tumorji pri človeku; endoskopske tehnike omogočajo dober pregled kolona; širok spekter prisotnih neoplastičnih sprememb (od majhnih adenomov do karcinomov) omogoča korelacijo specifične genetske spremembe s patološkim napredovanjem tumorja. V zgodnjih ko-lorektalnih tumorjih so opazili dve vrsti genomske nestabilnosti: kromosomsko nestabilnost (CIN, angl. chromosomal instability) (1) in mikrosatelitno nestabilnost (MSI, angl. microsatellite instability) (2). Pri kromosomski nestabilnosti tumorji hitro izgubljajo ali pridobivajo dele kromosomov, ki vsebujejo tumorske zaviralne gene in onkogene. Večina sporadič-nih in del dednih kolorektalnih karcinomov (FAP - familialna adenomatozna polipoza) sledi tej molekularni poti, katere začetna stopnja je mutacija v genu APC, tej pa sledijo spremembe v K-ras, DCCin TP53 (3). Mikrosatelitna nestabilnost pa se kaže kot kopičenje majhnih insercij in delecij v predelih kratkih ponavljajočih se zaporedij DNK (DNK mikrosateliti) na različnih kromosomih (2, 4). Namesto genov, ki so običajno mutirani pri kolorektalnem karcinomu, so tu inaktivirani določeni geni, vključeni v razvoj celice in vsebujejo kratke mo-nonukleotidne ponovitve v kodirajočem predelu, kot so BAX (5), TGFBR2 (6), TCF4 (7), TCFI, TEF4 (8). Čeprav nekateri avtorji zagovarjajo model ene genetske poti, pri kateri vrsta genetske nestabilnosti lahko v manjši meri vpliva na genetske spremembe, vendar ne dovolj, da bi jo delili na dve neodvisni poti (9, 10), pa so številne druge pomembne lastnosti kolorektalnih tumorjev v soglasju z dvema različnima in neodvisnima potema kancerogeneze. Tako so kolo-rektalni karcinomi z MSI bolj pogosto na desni strani črevesja in imajo boljšo napoved izida (2, 11). Tumorji z MSI imajo tudi sorazmerno posebne histološke lastnosti: prevladujejo mucinozni, slabo diferencirani, diploidni in s povečano lim-foidno infiltracijo (12, 13). Celične linije z MSI in s CIN pa so se in vitro tudi različno odzvale na kemoterapijo (14). Skupina kolorektalnih tumorjev z MSI obsega približno 1015% vseh kolorektalnih tumorjev (15), od tega jih manj kot tretjina pripada bolnikom s sindromom dednega nepolipo-znega kolorektalnega raka (HNPCC, angl. hereditary non-poly-posis colorectal cancer), pri katerem pa je več kot 90% tumorjev mikrosatelitno nestabilnih (4). Da bi zmanjšali umrljivost zaradi raka v družinah s sindromom HNPCC, je naš prvi cilj, da ugotovimo kar se da veliko takih družin. Tukaj opisujemo molekularnogenetsko znanje, ki lahko služi za presejanje za sindrom HNPCC, kar je predpogoj za nadaljnje spremljanje, preprečevanje in zdravljenje tega sindroma na ravni populacije.
Sindrom HNPCC ali sindrom LYNCH
Dedni nepolipozni kolorektalni karcinom ali sindrom Lynch je najpogostejša avtosomno-dominantno dedovana nagnjenost za kolorektalni karcinom in predstavlja 1-2% vseh primerov kolorektalnega karcinoma (16). Običajen način prepoznavanja HNPCC temelji na družinski anamnezi, kakor jo je opredelila Mednarodna skupina za HNPCC (Amsterdamska merila I in II). V družini s HNPCC morajo biti vsaj trije sorodniki s kolorektalnim karcinomom ali drugim rakom, povezanim s HNPCC (maternica, želodec, ovarij, jetrno-žolčni predel, sečila, možgani ter koža) v dveh zaporednih generacijah, vsaj en bolnik pa mora biti mlajši od 50 let (17, 18). Tumorji bolnikov s sindromom HNPCC imajo visoko stopnjo mikrosatelitne nestabilnosti, bolniki pa imajo podedovano mutacijo v enem od genov, ki kodirajo proteine, ki sestavljajo
molekularni mehanizem za popravljanje napak pri podvoje-vanju DNK (MMR, angl. mismatch repair) (2, 4, 19). Tako so predpostavili, da je okvarjen sistem MMR povezan z nastankom sindroma HNPCC. Številni geni sistema MMR so mutira-ni pri bolnikih s HNPPC: MLH1 (20, 21), MSH2, PMS1 (22, 23), PMS2 (24) in MSH6(GTBP) (25). Pri večini bolnikov so mutacije prisotne v približno enakem razmerju v genih MLH1 in MSH2, medtem ko so mutacije v ostalih treh genih našli le v posameznih primerih 26). Mutacijska analiza bi bila enostavnejša, če bi jo lahko izvajali le pri bolnikih iz družin, izbranih po amsterdamskih merilih. Vendar so podedovane mutacije v genih MLH1 in MSH2 našli tudi v precejšnem deležu bolnikov s kolorektalnim rakom iz družin, ki niso izpolnjevale amsterdamskih meril (27), kar pomeni, da bi marsikatero družino na ta način lahko zgrešili. Po navadi so take družine majhne ali pa se bolezen pri njih izrazi v kasnejšem življenjskem obdobju. Po drugi strani pa je kar nekaj takih družin, ki izpolnjujejo amsterdamska merila, pa vseeno pri njih ne najdemo mutacije v genih MMR (18). Ker je mikrosatelitna nestabilnost značilna za več kot 90% tumorjev bolnikov s HNPPCC, bi lahko bila v odsotnosti drugih diagnostičnih meril pomembna prva stopnja pri prepoznavanju družin s HNPCC. Vendar pa je 80-90% vseh kolorektalnih karcinomov z MSI sporadičnih. Doslej so odkrili tudi že številne molekularnogenetske značilnosti, ki do določene mere lahko razlikujejo med kolorek-talnimi karcinomi z MSI sporadičnega in HNPCC izvora. Pomembno je torej vedeti, ali molekularne značilnosti, ki razlikujejo med sporadičnimi in dednimi tumorji z MSI, lahko določimo s tako natančnostjo in občutljivostjo, da je smiselno molekularnogenetsko testiranje in presejanje sindroma HNPCC na populacijski ravni.
Genetske razlike med HNPCC in sporadičnimi kolorektalnimi karcinomi z visoko mikrosatelitno nestabilnostjo
Zdaj že vemo, da obstajajo razlike v genetski osnovi inaktiva-cije genov MMR pri sporadičnih kolorektalnih tumorjih in tumorjih HNPCC. Pokazali so, da geni MMR delujejo kot tumor-sko zaviralni geni, tako da morata biti oba alela tega gena inak-tivirana za popolno izgubo dejavnosti gena (28). V številnih tumorsko zaviralnih genih poleg genskih mutacij in izgube heterozigotnosti (29) inaktivira izražanje genov tudi hiperme-tilacija v otočkih CpG v promotorskem delu gena (30). Hiper-metilacijo promotorja gena MLH1 so opazili v povezavi z izgubo izražanja proteina v sporadičnih tumorjih z MSI (3133). Pokazali so tudi, da je ta hipermetilacija bialelni dogodek, ki povzroči izgubo dejavnosti MMR v odsotnosti dodatnih somatskih mutacij (34). Izvedli smo analizo mikrosatelit-ne nestabilnosti na 345 naključno izbranih novoodkritih ne-zdravljenih primarnih kolorektalnih karcinomih. Vzroke za nastanek visoke MSI smo nadalje ugotavljali s preiskovanjem podedovanih in somatskih mutacij, analizo izgube heterozi-gotnosti in ugotavljanjem stopnje metilacije promotorjev genov MLH1 in MSH2. Iz naših rezultatov je bilo razvidno, da sta gena MLH1 in MSH2 inaktivirana v večini (94%) tumorjev z visoko MSI. V tumorjih bolnikov s sindromom HNPCC so glavni vzrok nastanka mikrosatelitne nestabilnosti podedovana mutacija v enem od genov MMR na enem alelu in somat-ska mutacija ali izguba heterozigotnosti na drugem alelu. Večina sporadičnih tumorjev MSI pa nastane zaradi bialelne hi-permetilacije promotorja MLH1 in le malo zaradi somatskih MMR mutacij ali LOH (35).
V nekaterih drugih študijah rakov v okviru HNPCC so pokazali, da pride zaradi mutacij v genu APC (36, 37) in mutacij v beta-kateninu (38, 39) do uničenja signalne poti wnt. Na drugi strani pa so poročali, da so mutacije APC, K-ras in TP53 pri
sporadični vrsti raka z visoko MSI redke ali celo odsotne. Ravno tako je izguba heterozigotnosti na 5q, 17p in 18q precej redkejša pri sporadičnem raku z visoko stopnjo MSI v primerjavi z visoko nestabilnimi raki bolnikov s HNPCC (40-44). Namesto tega pa smo našli mutacije v številnih drugih genih, kot so BAX (5), TGFBR2 (45), IGF2R (46), E2F-4, (47), CDX2 (48), caspase-5 (49), AXIN2 (50), CtlP (51), TCFI, TEF4, TFE3, RGS12 (8). Poleg tega so tudi ugotovili, da so številni normalno delujoči geni, vključujoč HPP1, p16 in hMLHl utišani zaradi metilacije (52, 53). Zelo verjetno je, da tudi številni drugi geni, pri katerih pride do utišanja zaradi metilacije, prispeva-njo k nastanku sporadičnih kolorektalnih tumorjev z visoko stopnjo MSI. Zelo pomembno je, da natančno razlikujemo in razdelimo kolorektalne tumorje, ki so pozitivni z ozirom na MSI, v tri podskupine, tj. sporadične z nizko stopnjo MSI, spo-radične z visoko stopnjo MSI in HNPCC, ker bo to pomembno vplivalo na načine preprečevanja, presejanja in ravnanja s kolorektalnim karcinomom na populacijski ravni (14).
Določanje in evalvacija mikrosatelitne nestabilnosti
O tem, kako precizno opredeliti in natančno meriti MSI, obstajajo določene polemike (15, 54). Da lahko ovrednotimo status MSI, moramo primerjati DNK iz normalnega in tumor-skega tkiva istega posameznika na različnih predelih v geno-mu. Katera koli sprememba v dolžini, bodisi zaradi insercije ali delecije ponavljajočega se dela v zaporedju mikrosatelitne sekvence, je definirana kot MSI. V splošnem lahko kolorektal-ne tumorje razdelimo v naslednje skupine: z visoko stopnjo MSI (MSI-H), če je pozitivnih vsaj 30-40% testiranih mikrosa-telitnih označevalcev; z nizko stopnjo MSI (MSI-L), če je pozitivnih manj kot 30-40% testiranih označevalcev (12, 13, 55), ter mikrosatelitno stabilne tumorje (MSS), ki nimajo očitne nestabilnosti. Splošno sprejeto je razlikovanje med tumorji MSI-H in MSI-L, medtem ko je razlikovanje med skupinama MSI-L in MSS močno odvisno od vrste in števila analiziranih mikrosatelitnih označevalcev. Če bi uporabili zadostno število označevalcev, bi mogoče vsi kolorektalni karcinomi imeli določeno stopnjo nestabilnosti (56). Mononukleotidni označevalci so sorazmerno stabilni in nepolimorfni. Vseeno pa v rakih z visoko stopnjo MSI zelo pogosto pride do nastanka ali izginotja nukleotidov v mononukleotidnih označevalcih, kot so BAT25, BAT26, BAT34 in BAT40. Pokazano je bilo, da je samo uporaba označevalca BAT26 že dovolj za hitro določanje MSI statusa tumorjev (57, 58). V naši študiji smo na 300 diagnosticiranih primarnih še nezdravljenih kolorektalnih rakih pokazali, da bi zgolj z uporabo označevalca BAT26 zgrešili enega od 29 visoko nestabilnih tumorjev. Vendar pa noben nizko nestabilni tumor ni bil pozitiven z BAT26 ali BAT25. Večino vzorcev smo testirali z mononukleotidnimi označevalci BAT26, BAT25 (25) in BAT40 (59), dinukleotidi D2S123 (60), D5S346 (61), TP53 (62), D11S1294, D112179 (63), D17S250 (64), D18S58 (65) in D18S69 (60), in tetranukleoti-dom MYCLY (66). Ugotovili smo, da imajo skoraj vsi tumorji MSI alteracije v bodisi več kot 40% (visoko MS nestabilni) ali manj kot 20% (nizko MS nestabilni) testiranih lokusov (67). Med samo analizo se je pokazalo, da so za določitev MSI statusa dovolj štirje izbrani označevalci, BAT26, D2S123, BAT25 in D5S346. Tumorski vzorec smo določili kot visoko MS nestabilen, če sta bila spremenjena vsaj dva od štirih označevalcev (68, 69).
Kljub pomembni kvalitativni razliki med visoko in nizko nestabilnimi kolorektalnimi raki, ki zadeva nestabilnost znotraj mononukleotidnih ponovitev, so v številnih študijah uporabljali le dinukleotidne označevalce in diagnosticirali visoko nestabilne tumorje tudi v primerih, ko so opazili razlike le pri dveh od osmih testiranih označevalcev. Na srečanju na Natio-
nal Cancer Institute v Bethesdi so priporočili v vseh nadaljnjih raziskavah uporabo najbolj informativnih mikrosatelitnih označevalcev v kolorektalnih tumorjih (15). Ta set sestavljajo: dva mononukleotidna (BAT26 in BAT25) in trije dinu-kleotidni (D2S123, D5S346in D17S250) mikrosatelitni označevalci. Dinukleotidni označevalci so bili izbrani zaradi izredne nestabilnosti in občutljivosti za določanje nizko nestabilnega statusa tumorjev. Ker pa uporaba tega seta omogoča, da se označi tumor kot visoko nestabilen tudi v primeru, ko sta spremenjena dva dinukleotidna in noben mononukleotiden označevalec, je vprašanje, ali je tak tumor v resnici visoko nestabilen (14). Ker je bilo mogoče odkriti podedovane mutacije v genih DNK popravljalnega mehanizma (kar pomeni dokončno diagnozo sindroma HNPCC) le v družinah z genetsko visoko nestabilnimi raki (70), je torej zelo pomembno, da izločimo nizko nestabilne rake, kadar uporabljamo moleku-larnogenetski pristop za prepoznavanje družin s sindromom HNPCC.
Ko enkrat določimo visoko nestabilni status tumorja, pa je podobno težko razlikovati med sporadičnimi in visoko nestabilnimi kolorektalnimi tumorji v okviru HNPCC. V populacijskem presejanju za sindrom HNPCC je zato koristno, da preden v vseh visoko nestabilnih tumorjih iščemo mutacije v genih DNK popravljalnega mehanizma, določimo še metila-cijski status promotorja gena MLH1 (35), dobro pa je, da analiziramo na mutacije gene z mononukleotidnimi ponovitvami v kodirajočem delu, kot sta BAX, TGRBR2 in BRAF (71), ki so pogosto mutirani pri sporadičnih visoko nestabilnih rakih.
Odkrivanje mutacij v genih DNK popravljalnega mehanizma
Podedovane mutacije v katerem koli od petih genov, ki so vključeni v DNK popravljalni mehanizem, MSH2, MLH1, MSH6, PMS2 in PMS1, lahko povzroči nastanek dednega ne-polipoznega kolorektalnega raka. Posamezniki s podedovano mutacijo imajo visoko doživljenjsko ogroženost, da zbolijo za kolorektalnim rakom (verjetnost 70-85%), rakom endo-metrija (verjetnost 50%), kot tudi določeno drugo, s sindromom HNPCC povezano obliko raka (verjetnost pod 15%). Podedovane mutacije v genih MSH2 (38%) in MLH1 (49%) so odgovorne za večino družin s HNPCC, medtem ko so geni MSH6, PMS2 in PMS1 manj pogosto vključeni (72). Odkritih je bilo že več kot 300 različnih mutacij v genih MMR, ki povečajo nagnjenost za nastanek sindroma HNPCC (Baza podatkov Mednarodne skupine za HNPCC, http://w.w.w.nfdht.nl). Število najdenih mutacij v genu MSH6 v zadnjih letih počasi narašča in predstavlja 9% vseh odkritih mutacij. Mutacije MSH6 so pogostejše pri klinično manj značilni obliki HNPCC z eno ali več od naslednjih značilnosti: pojav bolezni v poznejšem življenjskem obdobju, pogostejšim rakom endometrija in nizko stopnjo mikrosatelitne nestabilnosti v tumorskem tkivu (73). Medtem ko odkritje podedovane mutacije v enem od genov popravljalnega mehanizma DNK pomeni dokončno diagnozo sindroma HNPCC oz. sindroma Lynch, odsotnost mutacije zaradi tehničnih vzrokov pri odkrivanju mutacij nujno ne pomeni odsotnosti tega sindroma. Detekcijo mutacij z uporabo bolnikove DNK in/ali RNK namreč lahko izvedemo s številnimi različnimi metodami, od katerih pa nobena ni 100-odstotno občutljiva. Ker so mutacije razpršene vzdolž celotnih genov, je genetsko testiranje zahtevno in dolgotrajno. Večina objavljenih mutacij so zamenjave enega nukleotida ali majhne delecije ali insercije (1-5 bp). Za odkritje teh mutacij se uporablja sekveniranje vseh eksonov skupaj z intronskimi povezavami (70) ali uporaba posrednih metod in sekvenira-nja samo tistih predelov, ki vsebujejo spremembe. Posredne metode, ki so omogočile odkrivanje mutaciji pri sindromu HNPCC, vključujejo analizo heterodupleksov, denaturacijsko
gradientno gelsko elektroforezo (DGGE), konformacijski po-limorfizem enoverižne DNK (SSCP) in denaturacijsko viso-koločljivostno tekočinsko kromatografijo (DHPLC) (29, 35, 74-77). Z uporabo teh metod pa se ne zaznajo velike delecije (obsegajo enega ali več eksonov), duplikacije in genomske preureditve, ki tudi nastanejo v genih MMR pri bolnikih s sindromom HNPCC. Velike delecije lahko odkrijemo z analizo po Southernu (78) ali z analizo mRNK s pomočjo testa, ki prepozna skrajšanje proteina (test PTT) (79, 80). Pred kratkim je bila za ugotavljanje velikih delecij v genih MSH2 in MLH1 predstavljena tudi metoda, ki temelji na pomnožitvi kratkih fluorescentnih predelov z mnogokratno verižno reakcijo s poli-merazo (PCR) (81). To metodo so nadalje še optimizirali, tako da vključuje različne eksone obeh genov (MSH2 in MLH1) med eno reakcijo in tako omogoča, da v primeru mutacije, ko je celoten predel, ki bi se moral pomnožiti odsoten ali dupli-ciran, to lahko pravilno določimo z uporabo eksonov drugih referenčnih genov (82). Za razlago potencialnih mutacij, ki vplivajo na izrezovanje intronov ali detekcijo genomskih preureditev, so nedavno uspešno testirali na genu MLH1 tudi novo metodo, ki vključuje tehniko ločevanja alelov v somatskih celičnih hibridih, kar še dodatno poveča občutljivost testiranja mutacij v podedovanih boleznih (83).
Smiselnost molekularnogenetske detekcije in presejanja družin s sindromom HNpCc (sindrom Lynch)
Molekularnogenetski pristop za odkrivanje družin s sindromom HNPCC (ali sindrom Lynch) je pomemben iz več vidikov:
1.	Dostop do dobro organiziranih registrov dednih oblik raka v številnih državah ni mogoč.
2.	Celo če bi taki registri obstajali, niso vedno zadostni, saj so precejšen delež podedovanih mutacij v genih MMR našli pri bolnikih iz družin, ki niso izpolnjevale amsterdamskih meril. Taki primeri so bile majhne družine, družine, ki niso vedele dovolj o svoji družinski anamnezi, ali družine, v katerih so otroci ali starši zgodaj umrli zaradi drugih vzrokov, še preden se bi jim lahko razvil rak (27, 84, 85).
3.	Kadar koli družina izpolnjuje ali pa tudi kadar ne izpolnjuje kliničnih meril, je dokončno diagnozo bolezni mogoče postaviti le na osnovi ugotovljene podedovane mutacije.
Potreba po diagnosticiranju sindroma HNPCC v celotni populaciji postaja vse bolj pomembna prav zaradi vse večjih uspehov pri preprečevanju raka s kolonoskopskim preseja-njem ter obetov v kemopreventivi. V 15-letnem projektu za profilaktično presejanje se je zaradi kolonoskopskega pregledovanja bolnikov iz družin s HNPCC in nosilcev mutacij v triletnih presledkih zmanjšalo tveganje za kolorektalnega raka za več kot polovico in umrljivost za približno 65% (86, 87). Iz študije na človeških celičnih linijah, ki so imele okvarjene gene, vključene v sindrom HNPCC, je bilo razvidno, da aspirin zavira mutatorski fenotip, tako da spodbudi genetsko selekcijo za mikrosatelitno stabilnost. Zato bi lahko predstavljal uspešno možnost za profilaktično zdravljenje sindroma HNPCC (88). Ker imajo nosilci mutacije v enem od genov DNK popravljalnega mehanizma 70-80% doživljenjsko verjetnost, da razvijajo kolorektalnega raka, je potrebno določiti, kdo v družini ima ali nima mutacije, ki je v tej družini povezana s sindromom HNPCC. Izziv in smisel je torej, da diagnosticira-mo kar se da največ posameznikov z nagnjenostjo za sindrom HNPCC, in to na najbolj učinkovit in po ceni ugoden način. Zaradi dovolj dobrega znanja o molekularnogenetskem mehanizmu HNPCC ter sorazmerno visoke penetrance in incidence bolezni je HNPCC genetska bolezen, pri kateri je smiselno mutacijsko presejanje na populacijski ravni. Ker je sama mutacijska analiza precej zahtevna in draga, je zaželeno,
da visokorizično populacijo določimo vnaprej s preprostejšimi metodami. Zato so bili izdelani in ovrednoteni različni logistični modeli, ki so temeljili na kliničnopatoloških in družinskih podatkih (78, 89). Nedavno so predlagali, da bi mole-kularnogenetski pristop za presejanje HNPCC temeljil na analizi mikrosatelitne nestabilnosti novoodkritih kolorektalnih rakov, temu pa bi sledila mutacijska analiza genov MLH1 in MSH2 v MSI pozitivnih rakih (90). Med 535 bolniki s kolorek-talnim rakom jih je bilo 66 (12%) MSI pozitivnih. Med temi jih je imelo 18 (3,4% od vseh) podedovano bolezensko mutacijo v genu MLH1 ali v genu MSH2. Občutljivost tega pristopa je bila malo manjša kot občutljivost pristopa, ki je upošteval vsaj eno od naslednjih značilnosti bolnika: starost manj kot petdeset let, prisotnost raka črevesja ali endometrija že prej in vsaj enega sorodnika z rakom črevesja ali endometrija. Pokazali so tudi, da je označevalec BAT26 zelo občutljiv kazalec mikrosatelitne nestabilnosti. Vendar pa je specifičnost MSI nizka predvsem zaradi tega, ker je pri visokem deležu MSI pozitivnih tumorjev vzrok za mikrosatelitno nestabilnost epige-netsko utišanje gena, kar je somatski dogodek, ki ga povzroči metilacija promotorja (90).
V naši študiji, v katero smo vključili 345 novoodkritih nezdrav-ljenih primarnih kolorektalnih karcinomov, smo še izboljšali specifičnost odkrivanja na HNPCC vezane mikrosatelitne nestabilnosti. Vse visoko nestabilne tumorje smo namreč analizirali še na status metilacije. Podedovane mutacije smo po tej metodologiji odkrili v 63% tumorjev, ki niso imeli hipermeti-lacije v promotorju gena MLH1. Analiza MSI in metilacije tako lahko nudi dodaten kažipot za mutacijsko presejanje v družinah, ki izpolnjujejo vsaj določena klinična merila za HNPCC. Še več, v državah, kjer ni dostopa do registrov dednega raka ali ti ne obstajajo, ta, zgolj molekularnogenetski pristop lahko pomaga začeti gradnjo nacionalnega registra HNPCC, ki omogoči in olajša spremljanje, obravnavo, preprečevanje in zdravljenje te bolezni na nacionalni ravni (35).
Zaključki
Molekularnogenetsko presejanje sindroma HNPCC na populacijski ravni je izvedljivo in smiselno. Izvedemo ga lahko z določitvijo mikrosatelitne nestabilnosti, ki ji sledi mutacijska analiza. Za določitev visoko mikrosatelitno nestabilnih tumorjev je dovolj občutljiv mononukleotidni označevalec BAT26. Da bi močno izboljšali občutljivost, učinkovitost in ceno, je pred mutacijsko analizo vseh odkritih MSI-pozitivnih tumorjev potrebno: (1) upoštevati določene klinične značilnosti za visoko tveganje (2), določiti v visoko nestabilnih rakih še status metilacije promotorja gena MLH1 ali (3) oboje. Mutacijska analiza mora vključevati vsaj detekcijo majhnih mutacij v genih MLH1 in MSH2 in mogoče tudi v genu MSH6. Ker v nekaterih populacijah velike delecije v genu MSH2 prispevajo približno tretjino vseh znanih mutacij (82), bi določitev teh sprememb še dodatno povišala občutljivost preseja-nja v okviru sindroma HNPCC.
Ko so družine enkrat genetsko diagnosticirane, to močno vpliva na obravnavanje družin in zdravljenje bolnikov in odpira možnosti za genetsko svetovanje in testiranje DNK pred pojavom simptomov pri sorodnikih s tveganjem. Iz študij je razvidno, da je sprejemljivost za genetsko testiranje lahko zelo visoka, če je genetsko svetovanje zelo skrbno in osebno (91). Molekularnogenetsko presajanje v povezavi s kolonoskopijo nadalje odpira možnosti za sledenje in preprečevanje bolezni v ogroženih družinah in v prihodnosti omogoča uvedbo novih odkritij na tem področju. Zaradi pojavljanja kolorektal-nega raka v zgodnejšem življenjskem obdobju in pospešene kancerogeneze je priporočljivo začeti s kolonoskopijo po dvajsetem letu starosti in jo pri nosilcih mutacije ponoviti vsako leto ali vsaki dve leti. Zaradi visoke pojavnosti metakronih kolorektalnih karcinomov pri bolnikih s sindromom HNPCC
priporočajo tudi subtotalno kolektomijo. Zaradi visoke incidence ginekološkega raka pri bolnicah pa predlagajo tudi redne ultrazvočne preglede endometrija in ovarija (92). Zaključimo lahko, da so populacijske molekularnogenetske analize za identifikacijo in potrditev družin s sindromom HNPCC, genetsko svetovanje in testiranje sorodnikov s tveganjem, ki jim sledijo programi za sledenje in preprečevanje bolezni, potrebni, ker omogočajo, da se bolezen odkrije v zgodnji ozdravljivi fazi, kar je povezano z zmanjšanjem stroškov zdravljenja in predvsem z boljšim preživetjem bolnikov. V Sloveniji smo ob sodelovanju Medicinske fakultete Univerze v Ljubljani, Onkološkega inštituta in Kliničnega oddelka za abdominalno kirurgijo Kliničnega centra že začeli populacijsko presejanje sindroma HNPCC na molekularnogenetski ravni.
Literatura
1.	Vogelstein B, Fearon ER, Kern SE, Hamilton SR, Preisinger AC, Nakamura Y, et al. Allelotype of colorectal carcinomas. Science 1989; 244: 207-11.
2.	Thibodeau SN, Bren G, Schaid D. Microsatellite instability in cancer of the proximal colon (see comments). Science 1993; 260: 816-9.
3.	Vogelstein B, Fearon ER, Hamilton SR, Kern SE, Preisinger AC, Leppert M, et al. Genetic alterations during colorectal-tumor development. N Engl J Med 1988; 319: 525-32.
4.	Aaltonen LA, Peltomaki P, Leach FS, Sistonen P, Pylkkanen L, Mecklin JP, et al. Clues to the pathogenesis of familial colorectal cancer (see comments). Science 1993; 260: 812-86.
5.	Rampino N, Yamamoto H, Ionov Y, Li Y, Sawai H, Reed JC, et al. Somatic frameshift mutations in the BAX gene in colon cancers of the microsatellite mutator phenotype. Science 1997; 275: 967-9.
6.	Eshleman JR, Lang EZ, Bowerfind GK, Parsons R, Vogelstein B, Willson JK, et al. Increased mutation rate at the hprt locus accompanies microsatellite instability in colon cancer. Oncogene 1995; 10: 33-7.
7.	Duval A, Gayet J, Zhou XP, Iacopetta B, Thomas G, Hamelin R. Frequent frameshift mutations of the TCF-4 gene in colorectal cancers with microsatellite instability. Cancer Res 1999; 59: 4213-5.
8.	Potocnik U, Glavac D, Ravnik-Glavac M. Identification of novel genes with somatic frameshift mutations within coding mononucleotide repeats in co-lorectal tumors with high microsatellite instability. Genes Chromosomes Cancer 2003; 36: 48-56.
9.	Tomlinson I, Ilyas M, Johnson V, Davies A, Clark G, Talbot I, et al. A comparison of the genetic pathways involved in the pathogenesis of three types of colorectal cancer. J Pathol 1998; 184: 148-52.
10.	Shitoh K, Konishi F, Miyaki M, Iijima T, Furukawa T, Tsukamoto T, et al. Pathogenesis of non-familial colorectal carcinomas with high microsatellite instability. J Clin Pathol 2000; 53: 841-5.
11.	Peltomaki P, Lothe RA, Aaltonen LA, Pylkkanen L, Nystrom-Lahti M, Seruca R, et al. Microsatellite instability is associated with tumors that characterize the hereditary non-polyposis colorectal carcinoma syndrome. Cancer Res 1993; 53: 5853-5.
12.	Thibodeau SN, French AJ, Cunningham JM, Tester D, Burgart LJ, Roche PC, et al. Microsatellite instability in colorectal cancer: different mutator phe-notypes and the principal involvement of hMLH1. Cancer Res 1998; 58: 1713-8.
13.	Jass JR, Do KA, Simms LA, Iino H, Wynter C, Pillay SP, et al. Morphology of sporadic colorectal cancer with DNA replication errors. Gut 1998; 42: 6739.
14.	Lindor NM, Burgart LJ, Leontovich O, Goldberg RM, Cunningham JM, Sargent DJ, et al. Immunohistochemistry versus microsatellite instability testing in phenotyping colorectal tumors. J Clin Oncol 2002; 20: 1043-8.
15.	Boland CR, Thibodeau SN, Hamilton SR, Sidransky D, Eshleman JR, Burt RW, et al. A National Cancer Institute Workshop on Microsatellite Instability for cancer detection and familial predisposition: development of international criteria for the determination of microsatellite instability in colorec-tal cancer. Cancer Res 1998; 58: 5248-57.
16.	Mecklin JP, Jarvinen HJ, Hakkiluoto A, Hallikas H, Hiltunen KM, Harkonen N, et al. Frequency of hereditary nonpolyposis colorectal cancer. A prospective multicenter study in Finland. Dis Colon Rectum 1995; 38: 588-93.
17.	Vasen HF, Mecklin JP, Khan PM, Lynch HT. The International Collaborative Group on Hereditary Non-Polyposis Colorectal Cancer (ICG-HNPCC). Dis Colon Rectum 1991; 34: 424-5.
18.	Vasen HF, Watson P, Mecklin JP, Lynch HT. New clinical criteria for hereditary nonpolyposis colorectal cancer (HNPCC, Lynch syndrome) proposed by the International Collaborative group on HNPCC. Gastroenterology 1999; 116: 1453-6.
19.	Ionov Y, Peinado MA, Malkhosyan S, Shibata D, Perucho M. Ubiquitous somatic mutations in simple repeated sequences reveal a new mechanism for colonic carcinogenesis. Nature 1993; 363: 558-61.
20.	Papadopoulos N, Nicolaides NC, Wei YF, Ruben SM, Carter KC, Rosen CA, et al. Mutation of a mutL homolog in hereditary colon cancer. Science 1994; 263: 1625-9.
21.	Bronner CE, Baker SM, Morrison PT, Warren G, Smith LG, Lescoe MK, et al. Mutation in the DNA mismatch repair gene homologue hMLHl is associated with hereditary non-polyposis colon cancer. Nature 1994; 368: 258-61.
22.	Fishel R, Lescoe MK, Rao MR, Copeland NG, Jenkins NA, Garber J, et al. The human mutator gene homolog MSH2 and its association with hereditary nonpolyposis colon cancer (published erratum appears in Cell 1994; 77: 167). Cell 1993; 75: 1027-38.
23.	Leach FS, Nicolaides NC, Papadopoulos N, Liu B, Jen J, Parsons R, et al. Mutations of a mutS homolog in hereditary nonpolyposis colorectal cancer. Cell 1993; 75: 1215-25.
24.	Nicolaides NC, Papadopoulos N, Liu B, Wei YF, Carter KC, Ruben SM, et al. Mutations of two PMS homologues in hereditary nonpolyposis colon cancer. Nature 1994; 371: 75-80.
25.	Papadopoulos N, Nicolaides NC, Liu B, Parsons R, Lengauer C, Palombo F, et al. Mutations of GTBP in genetically unstable cells (see comments). Science 1995; 268: 1915-7.
26.	Peltomaki P, de la Chapelle A. Mutations predisposing to hereditary non-polyposis colorectal cancer. Adv Cancer Res 1997; 71: 93-119.
27.	Liu B, Farrington SM, Petersen GM, Hamilton SR, Parsons R, Papadopoulos N, et al. Genetic instability occurs in the majority of young patients with colorectal cancer (see comments). Nat Med 1995; 1: 348-52.
28.	Parsons R, Li GM, Longley MJ, Fang WH, Papadopoulos N, Jen J, et al. Hyper-mutability and mismatch repair deficiency in RER+ tumor cells. Cell 1993; 75: 1227-36.
29.	Holinski-Feder E, Muller-Koch Y, Friedl W, Moeslein G, Keller G, Plaschke J, et al. DHPLC mutation analysis of the hereditary nonpolyposis colon cancer (HNPCC) genes hMLH1 and hMSH2. J Biochem Biophys Methods 2001; 47: 21-32.
30.	Herman JG, Graff JR, Myohanen S, Nelkin BD, Baylin SB. Methylation-speci-fic PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93: 9821-6.
31.	Hackman P, Tannergard P, Osei-Mensa S, Chen J, Kane MF, Kolodner R, et al. A human compound heterozygote for two MLH1 missense mutations (letter). Nat Genet 1997; 17: 135-6.
32.	Cunningham JM, Christensen ER, Tester DJ, Kim CY, Roche PC, Burgart LJ, et al. Hypermethylation of the hMLH1 promoter in colon cancer with microsatellite instability. Cancer Res 1998; 58: 3455-60.
33.	Herman JG, Umar A, Polyak K, Graff JR, Ahuja N, Issa JP, et al. Incidence and functional consequences of hMLH1 promoter hypermethylation in colo-rectal carcinoma. Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95: 6870-5.
34.	Veigl ML, Kasturi L, Olechnowicz J, Ma AH, Lutterbaugh JD, Periyasamy S, et al. Biallelic inactivation of hMLH1 by epigenetic gene silencing, a novel mechanism causing human MSI cancers. Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95: 8698-702.
35.	Potočnik U, Glavač D, Golouh R, Ravnik-Glavač M. Causes of microsatellite instability in colorectal tumors: implications for hereditary non-polyposis colorectal cancer screening. Cancer Genet Cytogenet 2001; 126: 85-96.
36.	Huang J, Papadopoulos N, McKinley AJ, Farrington SM, Curtis LJ, Wyllie AH, et al. APC mutations in colorectal tumors with mismatch repair deficiency. Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93: 9049-54.
37.	Rowan AJ, Lamlum H, Ilyas M, Wheeler J, Straub J, Papadopoulou A, et al. APC mutations in sporadic colorectal tumors: A mutational »hotspot« and interdependence of the »two hits«. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97: 33527.
38.	Mirabelli-Primdahl L, Gryfe R, Kim H, Millar A, Luceri C, Dale D, et al. Beta-catenin mutations are specific for colorectal carcinomas with microsatellite instability but occur in endometrial carcinomas irrespective of mutator pathway. Cancer Res 1999; 59: 3346-51.
39.	Miyaki M, Iijima T, Kimura J, Yasuno M, Mori T, Hayashi Y, et al. Frequent mutation of beta-catenin and APC genes in primary colorectal tumors from patients with hereditary nonpolyposis colorectal cancer. Cancer Res 1999; 59: 4506-9.
40.	Olschwang S, Hamelin R, Laurent-Puig P, Thuille B, De Rycke Y, Li YJ, et al. Alternative genetic pathways in colorectal carcinogenesis. Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94: 12122-7.
41.	Fujiwara T, Stolker JM, Watanabe T, Rashid A, Longo P, Eshleman JR, et al. Accumulated clonal genetic alterations in familial and sporadic colorectal carcinomas with widespread instability in microsatellite sequences. Am J Pathol 1998; 153: 1063-78.
42.	Salahshor S, Kressner U, Pahlman L, Glimelius B, Lindmark G, Lindblom A. Colorectal cancer with and without microsatellite instability involves different genes. Genes Chromosomes Cancer 1999; 26: 247-52.
43.	Konishi M, Kikuchi-Yanoshita R, Tanaka K, Muraoka M, Onda A, Okumura Y, et al. Molecular nature of colon tumors in hereditary nonpolyposis colon cancer, familial polyposis, and sporadic colon cancer (see comments). Ga-stroenterology 1996; 111: 307-17.
44.	Jass JR, Biden KG, Cummings MC, Simms LA, Walsh M, Schoch E, et al. Characterisation of a subtype of colorectal cancer combining features of the suppressor and mild mutator pathways. J Clin Pathol 1999; 52: 455-60.
45.	Markowitz S, Wang J, Myeroff L, Parsons R, Sun L, Lutterbaugh J, et al. Inac-tivation of the type II TGF-beta receptor in colon cancer cells with microsatellite instability (see comments). Science 1995; 268: 1336-8.
46.	Souza RF, Appel R, Yin J, Wang S, Smolinski KN, Abraham JM, et al. Microsatellite instability in the insulin-like growth factor II receptor gene in gastrointestinal tumours (letter) (published erratum appears in Nat Genet 1996; 14: 488). Nat Genet 1996; 14: 255-7.
47.	Yin J, Kong D, Wang S, Zou TT, Souza RF, Smolinski KN, et al. Mutation of hMSH3 and hMSH6 mismatch repair genes in genetically unstable human colorectal and gastric carcinomas. Hum Mutat 1997; 10: 474-8.
48.	Wicking C, Simms LA, Evans T, Walsh M, Chawengsaksophak K, Beck F, et al. CDX2, a human homologue of Drosophila caudal, is mutated in both alleles in a replication error positive colorectal cancer. Oncogene 1998; 17: 657-9.
49.	Schwartz SJ, Yamamoto H, Navarro M, Maestro M, Reventos J, Perucho M. Frameshift mutations at mononucleotide repeats in caspase-5 and other target genes in endometrial and gastrointestinal cancer of the microsatellite mutator phenotype. Cancer Res 1999; 59: 2995-3002.
50.	Liu W, Dong X, Mai M, Seelan RS, Taniguchi K, Krishnadath KK, et al. Mutations in AXIN2 cause colorectal cancer with defective mismatch repair by activating beta-catenin/TCF signalling. Nat Genet 2000; 26: 146-7.
51.	Vilkki S, Launonen V, Karhu A, Sistonen P, Vastrik I, Aaltonen LA. Screening for microsatellite instability target genes in colorectal cancers. J Med Genet 2002; 39: 785-9.
52.	Toyota M, Issa JP. CpG island methylator phenotypes in aging and cancer. Semin Cancer Biol 1999; 9: 349-57.
53.	Mori Y, Yin J, Rashid A, Leggett BA, Young J, Simms L, et al. Instabilotyping: comprehensive identification of frameshift mutations caused by coding region microsatellite instability. Cancer Res 2001; 61: 6046-55.
54.	Rodriguez-Bigas MA, Boland CR, Hamilton SR, Henson DE, Jass JR, Khan PM, et al. A National Cancer Institute Workshop on Hereditary Nonpolypo-sis Colorectal Cancer Syndrome: meeting highlights and Bethesda guidelines. J Natl Cancer Inst 1997; 89: 1758-62.
55.	Dietmaier W, Wallinger S, Bocker T, Kullmann F, Fishel R, Ruschoff J. Diagnostic microsatellite instability: definition and correlation with mismatch repair protein expression. Cancer Res 1997; 57: 4749-56.
56.	Starostik P, Muller-Hermelink HK. Diagnosis of microsatellite instability-positive colorectal cancer. Expert Rev Mol Diagn 2001; 1: 71-80.
57.	Zhou XP, Hoang JM, Cottu P, Thomas G, Hamelin R. Allelic profiles of mo-nonucleotide repeat microsatellites in control individuals and in colorectal tumors with and without replication errors. Oncogene 1997; 15: 1713-8.
58.	Hoang JM, Cottu PH, Thuille B, Salmon RJ, Thomas G, Hamelin R. BAT-26, an indicator of the replication error phenotype in colorectal cancers and cell lines. Cancer Res 1997; 57: 300-3.
59.	Liu L, Markowitz S, Gerson SL. Mismatch repair mutations override alkyltrans-ferase in conferring resistance to temozolomide but not to 1, 3-bis(2-chlo-roethyl)nitrosourea. Cancer Res 1996; 56: 5375-9.
60.	Weissenbach J. A second generation linkage map of the human genome based on highly informative microsatellite loci. Gene 1993; 135: 275-8.
61.	Spirio L, Joslyn G, Nelson L, Leppert M, White R. A CA repeat 30-70 KB downstream from the adenomatous polyposis coli (APC) gene (published erratum) appears in Nucleic Acids Res 1991; 19: 6348.
62.	Jones MH, Nakamura Y. Detection of loss of heterozygosity at the human TP53 locus using a dinucleotide repeat polymorphism. Genes Chromosomes Cancer 1992; 5: 89-90.
63.	Vanagaite L, James MR, Rotman G, Savitsky K, Bar-Shira A, Gilad S, et al. A high-density microsatellite map of the ataxia-telangiectasia locus. Hum Genet 1995; 95: 451-4.
64.	Weber JL, Kwitek AE, May PE, Wallace MR, Collins FS, Ledbetter DH. Dinu-cleotide repeat polymorphisms at the D17S250 and D17S261 loci. Nucleic Acids Res 1990; 18: 4640.
65.	Dib C, Faure S, Fizames C, Samson D, Drouot N, Vignal A, et al. A comprehensive genetic map of the human genome based on 5,264 microsatellites. Nature 1996; 380: 152-4.
66.	Makela TP, Hellsten E, Vesa J, Alitalo K, Peltonen L. An Alu variable polyA repeat polymorphism upstream of L-myc at 1p32. Hum Mol Genet 1992; 1: 217.
67.	Potocnik U, Glavac D, Golouh R, Ravnik-Glavac M. Evaluation of microsatellite markers for efficient assessment of high microsatellite instabile colorec-tal tumors. Pflugers Arch 2000; 439 Suppl 3: R47-R49.
68.	Potocnik U. Molekularno genetska analiza dednih in sporadicnih oblik ko-lorektalnega raka v slovenski populaciji, Magistrsko delo. Ljubljana: Medicinska fakulteta, 1998.
69.	Ravnik-Glavac M, Potocnik U, Glavac D. Incidence of germline hMLHl and hMSH2 mutations (HNPCC patients) among newly diagnosed colorectal cancers in a Slovenian population. J Med Genet 2000; 37: 533-6.
70.	Aaltonen LA, Salovaara R, Kristo P, Canzian F, Hemminki A, Peltomaki P, et al. Incidence of hereditary nonpolyposis colorectal cancer and the feasibility of molecular screening for the disease. N Engl J Med 1998; 338: 1481-7.
71.	Rajagopalan H, Bardelli A, Lengauer C, Kinzler KW, Vogelstein B, Velcules-cu VE. Tumorigenesis: RAF/RAS oncogenes and mismatch-repair status. Nature 2002; 418: 934.
72.	Peltomaki P. Deficient DNA mismatch repair: a common etiologic factor for colon cancer. Hum Mol Genet 2001; 10: 735-40.
73.	Peltomaki P. DNA mismatch repair and cancer. Mutat Res 2001; 488: 77-85.
74.	Wahlberg S, Liu T, Lindblom P, Lindblom A. Various mutation screening techniques in the DNA mismatch repair genes hMSH2 and hMLH1. Genet Test 1999; 3: 259-64.
75.	Wijnen J, Vasen H, Khan PM, Menko FH, van der Klift H, van Leeuwen C, et al. Seven new mutations in hMSH2, and HNPCC gene, identified by denaturing gradient-gel electrophoresis. Am J Hum Genet 1995; 56: 1060-6.
76.	Beck NE, Tomlinson IP, Homfray T, Frayling I, Hodgson SV, Harocopos C, et al. Use of SSCP analysis to identify germline mutations in HNPCC families fulfilling the Amsterdam criteria. Hum Genet 1997; 99: 219-24.
77.	Ravnik-Glavac M, Potocnik U, Kozelj M, Krizman I, Glavac D. A novel in frame deletion of codons 188-190 in the hMSH2 gene of a Slovenian patient with hereditary non-polyposis colorectal cancer. Hum Hered 1998; 48: 285-7.
78.	Wijnen JT, Vasen HF, Khan PM, Zwinderman AH, van der Klift H, Mulder A, et al. Clinical findings with implications for genetic testing in families with clustering of colorectal cancer. N Engl J Med 1998; 339: 511-8.
79.	Kohonen-Corish M, Ross VL, Doe WF, Kool DA, Edkins E, Faragher I, et al. RNA-based mutation screening in hereditary nonpolyposis colorectal cancer. Am J Hum Genet 1996; 59: 818-24.
80.	Bateman JF, Freddi S, Lamande SR, Byers P, Nasioulas S, Douglas J, et al. Reliable and sensitive detection of premature termination mutations using a protein truncation test designed to overcome problems of nonsense-mediated mRNA instability. Hum Mutat 1999; 13: 311-7.
81.	Charbonnier F, Raux G, Wang Q, Drouot N, Cordier F, Limacher JM, et al. Detection of exon deletions and duplications of the mismatch repair genes in hereditary nonpolyposis colorectal cancer families using multiplex poly-merase chain reaction of short fluorescent fragments. Cancer Res 2000; 60: 2760-3.
82.	Wang Y, Friedl W, Sengteller M, Jungck M, Filges I, Propping P, et al. A modified multiplex PCR assay for detection of large deletions in MSH2 and MLH1. Hum Mutat 2002; 19: 279-86.
83.	Nakagawa H, Yan H, Lockman J, Hampel H, Kinzler KW, Vogelstein B, et al. Allele separation facilitates interpretation of potential splicing alterations and genomic rearrangements. Cancer Res 2002; 62: 4579-82.
84.	Nystrom-Lahti M, Wu Y, Moisio AL, Hofstra RM, Osinga J, Mecklin JP, et al. DNA mismatch repair gene mutations in 55 kindreds with verified or putative hereditary non-polyposis colorectal cancer. Hum Mol Genet 1996; 5: 763-9.
85.	Farrington SM, Lin-Goerke J, Ling J, Wang Y, Burczak JD, Robbins DJ, et al. Systematic analysis of hMSH2 and hMLH1 in young colon cancer patients and controls. Am J Hum Genet 1998; 63: 749-59.
86.	Jarvinen HJ, Mecklin JP, Sistonen P. Screening reduces colorectal cancer rate in families with hereditary nonpolyposis colorectal cancer. Gastroen-terology 1995; 108: 1405-11.
87.	Jarvinen HJ, Aarnio M, Mustonen H, Aktan-Collan K, Aaltonen LA, Peltoma-ki P, et al. Controlled 15-year trial on screening for colorectal cancer in families with hereditary nonpolyposis colorectal cancer. Gastroenterology 2000; 118: 829-34.
88.	Ruschoff J, Wallinger S, Dietmaier W, Bocker T, Brockhoff G, Hofstadter F, et al. Aspirin suppresses the mutator phenotype associated with hereditary nonpolyposis colorectal cancer by genetic selection. Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95: 11301-6.
89.	Loukola A, Salovaara R, Kristo P, Moisio AL, Kaariainen H, Ahtola H, et al. Microsatellite instability in adenomas as a marker for hereditary nonpoly-posis colorectal cancer. Am J Pathol 1999; 155: 1849-53.
90.	Salovaara R, Loukola A, Kristo P, Kaariainen H, Ahtola H, Eskelinen M, et al. Population-based molecular detection of hereditary nonpolyposis colorec-tal cancer. J Clin Oncol 2000; 18: 2193-200.
91.	Aktan-Collan K, Mecklin JP, de la Chapelle A, Peltomaki P, Uutela A, Kaari-ainen H. Evaluation of a counselling protocol for predictive genetic testing for hereditary non-polyposis colorectal cancer. J Med Genet 2000; 37: 108-13.
92.	Lynch HT, Lynch JF. Hereditary nonpolyposis colorectal cancer. Semin Surg Oncol 2000; 18: 305-13.