Določitev mutacij v eksonu 12 gena iAK2 pri bolnikih s pravo policitemijo
Identification of JAK2 exon 12 mutations in patients with polycythemia vera
Marija Jedrt Mandelc Mazaj, Sašenka lozar, Peter černelč, tadej Pajič
Klinični oddelek za hematologijo, Interna klinika, Univerzitetni klinični center Ljubljana
Korespondenca/ Correspondence:
asist.dr. tadej Pajič, spec. med. biokem, Specializirani hematološki laboratorij kliničnega oddelka za hematologijo, Klinični oddelek za hematologijo, Interna klinika, Univerzitetni klinični center ljubljana, njegoševa 4, SI-1000 ljubljana, Slovenia; fax: + 386 1 43 20 230, e-mail: tadej.pajic@kclj.si
Ključne besede:
prava policitemija, eritrocitoza, JAK2 ekson 12, JAK2 V617F
Key words:
polycythemia vera, erythrocytosis, JAK2 exon 12, JAK2 V617F
Citirajte kot/Cite as:
Zdrav Vestn 2012; 81 supl 2: II-161-7
Prispelo: 10. apr. 2012, Sprejeto: 17. maj 2012
Izvleček
Izhodišča: Diagnozo prava policitemija (PV) praviloma postavimo z ugotovitvijo eritrocitoze in mutacije v genu JAK2. Pri več kot 95 % bolnikov s PV ugotovimo somatsko mutacijo JAK2 V617F. Pri bolnikih s PV in z negativnim izsledkom za mutacijo JAK2 V617F so nedavno odkrili mutacije znotraj eksona 12 gena JAK2. Namen raziskave je vpeljava načinov za določitev mutacij v eksonu 12 gena JAK2 pri skupini bolnikov s pravo policitemijo (PV) ali z nejasno eritrocitozo in negativnim izsledkom za mutacijo JAK2 V617F.
Metode: V raziskavo smo vključili vzorce 6 bolnikov z znaki zvečane mase eritrocitov v krvni sliki in negativnim izsledkom za mutacijo JAK2 V617F. Granulocite smo osamili s centrifugira-njem preko gostotnega gradienta fikola iz vzorcev venske krvi ali kostnega mozga ter z lizira-njem eritrocitov. Iz celic smo osamili RNA in s postopkom obratnega prepisovanja z reverzno transkriptazo pridobili komplementarno DNA (cDNA). Prisotnost mutacij v eksonu 12 gena JAK2 smo ugotovili z načinom kvantitativne verižne reakcijo s polimerazo (qPCR) in analizo krivulje taljenja dveh specifičih fluorescenčno označenih hibridizacijskih sond ter s klasičnim postopkom PCR in z analizo velikosti madežev pridelkov PCR na agaroznem gelu po elektrofo-rezi. Vrsto mutacij smo določili s sekvenciranjem ciljnega odseka pridelka klasičnega PCR.
Rezultati: Pri dveh od šestih bolnikov smo ugotovili prisotnost mutacije v eksonu 12 gena JAK2. Pri enem bolniku smo ugotovili deleci-jo p.Asn542_Glu543del, pri drugem pa delecijo p.Glu543_Asp544del. Obe mutaciji sta že znani.
Zaključki: Pri dveh od šestih bolnikov s kliničnim sumom na PV smo ugotovili mutacijo v ek-sonu 12 gena JAK2 in potrdili diagnozo PV. Sklepamo, da so metode primerne za redno delo v laboratoriju in pomembne za postavitev diagnoze
bolezni PV pri bolnikih s PV ali z eritrocitozo in negativnim izsledkom za mutacijo JAK2 V617F.
Abstract
Background: Polycythemia vera (PV) is characterized by erythrocytosis and mutation in JAK2 gene. More than 95 % of patients with PV have somatic mutation JAK2 V617F. Recently, several novel JAK2 exon 12 mutations in PV patients and unmutated JAK2 V617F were found. The aim of the study was to introduce methods for the detection of JAK2 exon 12 mutations in patients with PV or unclear erythrocytosis and with un-mutated JAK2 V617F.
Methods: Six patients with an increased red cell mass determined by Complete Blood Count (CBC) test and with unmutated JAK2 V617F were included in the study. Granulocytes were isolated from peripheral blood or bone marrow aspirates by Ficoll density centrifugation followed by erythrocytes lysis. Total cellular RNA was isolated from cells and used to prepare complementary DNA (cDNA) by reverse transcription. Detection of JAK2 exon 12 mutation was performed by quantitative real time PCR and by melting curve analyses using dual hybridization probes, by classical PCR and agarose gel electrophoresis. The type of mutation was determined by direct sequencing of the classical PCR products.
Results: We detected JAK2 exon 12 mutation in two out of six patients. We determined the deletion p.Asn542_Glu543del in one patient and the deletion p.Glu543_Asp544del in another one. The mutations have been already described.
Conclusions: In two out of six patients we detected JAK2 exon 12 mutation and confirmed the diagnosis of PV. We conclude that JAK2 exon 12 mutation analysis by the methods used contributes to the diagnosis of PV or erythrocytosis in patients with unmutated JAK2 V617F mutation.
Uvod
Mieloproliferativne novotvorbe (MPN) so klonske bolezni, ki izvirajo iz multipo-tentne matične celice, za katere je značilna čezmerna tvorba ene ali več celičnih vrst ob odsotnosti določenega znanega sprožilnega dejavnika. Prava policitemija (PV) je MPN, za katero je značilno predvsem povečano nastajanje celic rdeče vrste, manj pa celic granulocitne in megakariocitne vrste. Po razvrstitvi Svetovne zdravstvene organizacije (SZO) so za pravo policitemijo značilna merila, kot so povečane vrednosti hemato-krita (moški > 0,52, ženske > 0,48), povečana masa eritrocitov (ME > 25 "/o), prisotnost mutacije JAK2 V617F in znižana koncentracija Epo (eritropoetin) v serumu.^'^ V pato-genezi te bolezni igrajo pomembno vlogo mutacije v tirozin kinazi JAK2 (Janus kinaza 2), ki je povezana tudi z aktiviranjem recep-torja za Epo. Tirozin kinaza JAK2 je vključena v signalne poti za proliferacijo hema-topoetskih celic. Gen za JAK2 se nahaja na kromosomu 9p24 in je sestavljen iz sedmih domen. Najpomembnejši domeni sta JHi in JH2. Domena JHi se nahaja blizu karboksil-nega konca proteina in je aktivna kinazna domena s tirozinskimi ostanki, ki se v procesu aktiviranje gena JAK2 fosforilizirajo. Domena JH2 ali psevdokinazna domena je kinazi podobna domena, ki nima kinazne aktivnosti. Vse druge JH3-JH7 domene pa opredelimo kot JAK2 podobne domene.^ Najpogostejša mutacija v genu JAK2 je točkovna mutacija V617F, ki nastane v domeni JH2 psevdokinaze gena JAK2. Pri mutaciji se zamenja aminokislina valin (V) za feni-lalanin (F) na mestu 617 aminokislinskega zaporedja. To vodi do stalnega aktivnega delovanja JAK2 tirozinske kinaze. Celice z omenjeno mutacijo so zelo občutljive na ci-tokine in se hitro delijo. Dve neodvisni raziskavi sta v letu 2005 dokazali, da je pri večini bolnikov s PV (> 95 %) in pri približno polovici (50-60 "%) bolnikov z esencialno trom-bocitemijo in primarno mielofibrozo prisotna pridobljena somatska mutacija JAK2 v6i7f.4'5 Mutacija je prisotna v 50 % tudi pri bolnikih z refraktarno anemijo s prstanasti-mi sideroblasti in trombocitozo, pri drugih
mieloproliferativnih in mielodisplastičnih boleznih pa jo le redko dokažemo.
Pri približno 5 % bolnikov s PV, kjer ni prisotna mutacija V617F, so prisotne tudi druge mutacije, ki pa se zgodijo znotraj ek-sona 12 gena JAK2.®"® Mutacije v eksonu 12 gena JAK2 nastanejo znotraj področja gena JAK2, ki medsebojno povezuje dve domeni, domeno SH2 in psevdokinazno domeno JH2. Ekson 12 gena JAK2 pokriva področja gena od kodona 506-547. Večina teh mutacij nastane znotraj področja eksona 12 gena JAK2, ki pokriva področje gena od kodona 537-543. Mutacije v eksonu 12 gena JAK2 so prisotne tudi pri bolnikih z idiopatsko eritrocitozo s povečanim številom eritrocitov, povečano vrednostjo hematokrita ter z znižano koncentracijo Epo v serumu brez kakršnih koli kliničnih znakov za PV ali prisotnih karakterističnih morfoloških sprememb megakariocitov v kostnem mozgu.^" Pri drugih MPN mutacij v eksonu 12 gena JAK2 niso ugotovili.
Namen raziskave je vpeljava metod za določitev mutacij v eksonu 12 gena JAK2 in določitev vrste prisotne mutacije pri bolniku z JAK2 V617F negativno PV z metodo sekvenciranja.
Metode Bolniki
V preiskavo za določitev mutacij v ekso-nu 12 gena JAK2 smo vključili 6 bolnikov z napotnima diagnozama PV ali nepojasnjena eritrocitoza. Vsi bolniki so se zdravili v Univerzitetnem kliničnem centru Ljubljana (UKC Ljubljana).
Prisotnost mutacij v eksonu 12 gena JAK2 smo določili s tremi različnimi molekular-no-diagnostičnimi načini: z analizo krivulje taljenja, s kvalitativno verižno reakcijo s po-limerazo (PCR) in s sekvenciranjem.
Osamitev RNA in reverzna transkripcija
Za potrebo določanja mutacij v eksonu 12 gena JAK2 smo bolnikom odvzeli 2 ml kostnega mozga ali 10 ml venske krvi, ki smo ju shranili odvzete v epruveto z anti-koagulantom EDTA. Iz granulocitov, ki smo
Slika i: DoLočitev mutacij v eksonu 12 gena JAK2 z načinom krivulje taljenja na napravi lightGycler 2.0.
jih pridobili z gradientnim centrifugiranjem preko fikola, smo z reagenčnim kompletom High Pure RNA Isolation Kit (ROCHE) iz njih osamili RNA. Po navodilih reagenč-nega kompleta SuperScript® VILO™ cDNA Synthesis Kit (Invitrogen) smo s postopkom obratnega prepisovanja in z encimom reverzna transkriptaza SuperScript III pretvorili ~1 mg RNA v komplementarno DNA (cDNA).
Analiza krivulje taljenja
Kot presejalno metodo za določitev prisotnosti genskih sprememb v eksonu 12 gena JAK2 smo uporabili metodo analize krivulje taljenja hibridizacijskih sond po verižni reakciji s polimerazo v realnem času (RQ-PCR), ki jo izvajamo z napravo Light-Cycler® 2.0 (Roche). Podatke smo analizirali z računalniškim programom LightCycler Software 4.1, ki dobljene vrednosti grafično prikaže v obliki krivulj. Z napravo zaznamo padec fluorescence pri dveh različnih temperaturah, ko se DNA razcepi v predelu mutacije, in pri temperaturi, ko se DNA razcepi v predelu nemutiranega gena. Računalniški program pretvori vrednosti fluorescence, odvisne od temperature, v negativni prvi odvod (-dF/dT).
Za reakcijo PCR pri presejalni metodi smo v 20 ^L-reakciji uporabili smerni začetni oligonukleotid JAK2-F (Applied Biosystems) z nukleotidnim zaporedjem TGT ACC AAC CTC ACC AAC AT in protismer-ni začetni oligonukleotid JAK2-R (Applied Biosystems) z nukleotidnim zaporedjem CAG TTG ACC GTA GTC TCC T. Koncentracija obeh začetnih oligonukleotidov v reakcijski mešanici je bila 0,5 mM. Smerni oligonukleotid se prilega področju kodonov 520-525, medtem ko se protismerni prilega na področje kodonov 568-573. V reakciji PCR smo uporabili tudi sondi Hyb-Probe JAK2-FL (Roche Diagnostics) z nukleo-
tidnim zaporedjem ATG GTG TTT CAC AAA ATC AGA AAT GAA GAT TTG AT--Fluorescin ter sondo JAK2-PH (Roche Diagnostics) z nukleotidnim zaporedjem TTA ATG AAA GCC TTG GCC AAG GCA CT--Phosphate. Koncentracija sond v reakcijski mešanici je bila 0,75 mM. Nadaljnji postopek reakcije PCR smo povzeli po predhodno objavljeni literaturi.® Najpogostejše mutacije v eksonu 12 gena JAK2 so v področju kodo-nov 535-555, ki jih prepoznamo z metodo analize krivulje taljenja.
Kvalitativna reakcija PCR
Pri kvalitativni reakciji PCR smo v 50 mL reakcijski mešanici uporabili smerni in protismerni začetni oligonukleotid (JAK2--F in JAK2-R), katerih koncentracija v reakcijski mešanici je bila 0,4 mM. Koncentracija dNTP v reakcijski mešanici je bila 0,200 mM, medtem ko je bila koncentracija MgCl2 2,5 mM (Applied Biosystems). V reakciji PCR smo uporabili encim AmpiTag GOLD Polymerase (Applied Biosystems). V reakciji pomnoževanja s 35 cikli je bila temperatura prileganja 60 °C. Reakcijo PCR smo izvedli z napravama Veriti® Thermal Cycler in GeneAmp® PCR System 9700 (Applied Biosystems).
Po končani reakciji PCR smo produkte PCR s postopkom gelske elektroforeze ločili na 4-odstotnim agaroznem gelu (E-Gel® EX Gels, 4 "/o, Invitrogen). Fragmente produktov reakcije PCR smo po končani elektro-forezi izrezali iz gela. V primeru prisotnosti enega fragmenta smo prečistili produkt reakcije PCR na E-Gel® SizeSelect™ agaroznem gelu. Ob prisotnosti večjega števila fragmentov smo po končani elektroforezi fragmente produktov reakcije PCR izrezali iz gela. Izrezane fragmente smo prečistili z reagentnim kompletom PureLink Quick Gel Extraction Kit (Invitrogen).
Sekvenciranje
Postopek sekvenciranja, s katerim določimo nukleotidno zaporedje, smo izvedli na genetskem analizatorju ABI 310 (Applied Biosystems) ob uporabi predhodno omenjenega smernega (JAK2-F) in protismernega začetnega oligonukleotida (JAK2-R) ter s
pomočjo reagentnega kompleta BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems).
Rezultati
Podatki laboratorijskih preiskav
V sklopu diagnosticiranja smo bolnikom naredili določene laboratorijske preiskave. Vsem bolnikom smo s preiskavo alelna verižna reakcija s polimerazo (alelni PCR) prej izključili prisotnost mutacije V617F v genu JAK2 (Tabela 1).
Slika 2: AnaLiza produktov verižne reakcije s poLimerazo (PCR) na agaroznem geLu.
Tabela 1: Podatki o bolnikih in laboratorijskih preiskavah.
Podatki o bolniku in laboratorijskih preiskavah	Bolnik 1	Bolnik 2	Bolnik 3	Bolnik 4	Bolnik 5	Bolnik 6
starost (Leto)	56	55	44	52	24	50
spoL	Ž	Ž	M	Ž	M	M
diagnoza	PV	PV	PV	Eritrocitoza	PV	Eritrocitoza
izvor vzorca	KM	PK	PK	PK	PK	PK
hemoglobin g/L Ref. v. [118-148] x g/L Ž Ref. v. [133-16 7] x g/L M	191	184	175	166	180	175
hematokrit Ref. v. [0,36-0,44] x g/L Ž Ref. v. [0,39-0,50] x g/L M	0,580	0,542	0,507	0,478	0,515	0,502
erci x 1012/L/ Ref. v. [3,88-4,99] x 1012/L Ž Ref. v. [4,32-5,66] x 1012/L M	7,70	5,63	5,53	5,59	5,55	5,89
Lkci x 109/L/ Ref. v. [3,9-11,1] x 109/L Ž Ref. v. [3,7-9,5] x 109/L M	9,2	9,6	10,0	11,5	7,6	3,5
tr x109/L/ Ref. v. [157-384] x 109/L	340	202	279	286	775	153
nivo Epo v serumu IU/mL/ Ref. v. [3,3-16,6] IU/mL	NA	1,9	3,0	7,5	7,0	5,8
mutacija jak2V617F	Ni prisotna	Ni prisotna	Ni prisotna	Ni prisotna	Ni prisotna	Ni prisotna
mutacije v eksonu 12 gena JAK2	E543-D544deL	N542-E543deL	Ni prisotna	Ni prisotna	Ni prisotna	Ni prisotna
Legenda: Ž (ženska); M (moški); PV (prava policitemija); KM (kostni mozeg); Brci (eritrociti); Lkci (Levkociti); Tr (trombociti); Epo (eritropoetin); NA / ni na voljo.
Slika 3: Somatski mutaciji v eksonu 12 gena JAK2 pri dveh bolnicah s pravo policitemijo.
Rezultati določitve mutacij v eksonu 12 gena JAK2
S presejalno metodo krivulje taljenja hi-bridizacijskih sond na napravi LightCycler 2.0 smo dokazali prisotnost mutacije v eksonu 12 pri bolnici 1 in bolnici 2. Pri vseh drugih bolnikih pa smo z metodo taljenja krivulje izključili prisotnost mutacije v eksonu 12 gena JAK2. Na grafu krivulje taljenja, na katerem je negativni prvi odvod (-dF/ dT) fluorescence v odvisnosti od temperature kaže kot enojni vrh pri temperaturi krivulje taljenja ~67 °C, predstavlja bolnika, pri katerem mutacija v eksonu 12 ni prisotna (wt) (Slika 1). Iz grafa je razvidno, da sta pri bolnici 1 prisotna dva vrhova pri različnih temperaturah krivulje taljenja (Tm1 = 61 °C in Tm2 = 67 °C), kar potrjuje prisotnost mutacije v eksonu 12. Prav tako sta prisotna dva vrhova tudi pri bolnici 2 z različnima temperaturama krivulje taljenja (Tm1 = 59 °C in Tm2 = 67 °C). Izsledki potrjujejo prisotnost mutacije v eksonu 12 pri obeh bolnicah.
Pri bolnici 1 in bolnici 2 smo uspešno potrdili prisotnost mutacij v eksonu 12 gena JAK2 tudi z metodo kvalitativne reakcije PCR, kar je razvidno iz elektroforo-grama (Slika 2). Na agaroznem gelu v primeru odsotnosti mutacije v eksonu 12 gena JAK2 dobimo fragment velikosti 163 bp. V primeru prisotnosti mutacije pa so na agaroznem gelu poleg fragmenta velikosti 163 bp prisotni še fragmenti, ki so večji od 163 bp. Velikost fragmentov je odvisna od vrste prisotnih mutacij v eksonu 12 (npr. delecije, insercije nukleotidov). Pri bolnici 1 in bolnici 2 sta poleg fragmenta velikosti 163 bp
prisotna še dva fragmenta, njuna velikost pa je večja od ~180 bp, kar potrjuje prisotnost mutacije v eksonu 12 gena JAK2 (Slika 2). Pri drugih bolnikih pa smo dobili le fragment velikosti 163 bp. Za izključitev mutacij smo opravili še sekvenčno analizo.
Z metodo sekvenciranja smo nato pri posameznem bolniku iz produktov PCR določili nukleotidno zaporedje, ki smo ga primerjali z nukleotidnim zaporedjem divjega tipa gena JAK2. Z metodo sekvenciranja smo pri bolnici 1 določili mutacijo E543-D544del, kjer je prišlo do izgube fragmenta velikosti 6 bp. Prišlo je do delecije 6 nukleotidov GAA GAT na mestih 1627-1632 (1627-1632del6). Pri mutaciji je v aminokislinskem zaporedju prišlo do delecije glutaminske kisline na mestu 543 in aspartata na mestu 544 (Slika 3). Pri bolnici 2 je bila prisotna mutacija N542--E543del, pri kateri je prav tako prišlo do izgube fragmenta velikosti 6 bp. Do delecije 6 nukleotidov AAT GAA je prišlo na mestih 1624-1629 (1624-1629del6). Pri tej mutaciji je v aminokislinskem zaporedju prišlo do delecije asparagina na mestu 542 in gluta-minske kisline na mestu 543 (Slika 3).
Pri bolniku 3 in bolniku 5 z negativno mutacijo JAK2 V617F in s klinično sliko za PV v granulocitih periferne krvi nismo določili prisotnosti mutacije v eksonu 12 gena JAK2. Prav tako je nismo določili niti pri drugih dveh bolnikih^'® s klinično sliko eri-trocitoze.
Razpravljanje
Mutacija v V617F gena JAK2 je po razvrstitvi Svetovne zdravstvene organizacije pomembno molekularno-diagnostično merilo prave policitemije. Nedavne raziskave so pokazale, da pri teh bolnikih ugotovimo mutacijo v več kot 5 "/o znotraj eksona 12 gena JAK2. Od šestih analiziranih bolnikov s pravo policitemijo ali z eritrocitozo smo pri dveh bolnicah dokazali prisotnost mutacije v eksonu 12. Bolnici sta bili ob določitvi mutacij stari 56 in 55 let (Tabela 1). Zanimivo je, da podatki iz predhodno objavljenih raziskav potrjujejo, da so mutacije v eksonu 12 gena JAK2 prisotne v večjem deležu pri ženski kot pri moški populaciji. Mediana starosti je manjša od 60 let. Nasprotno pa
je mutacija V617F v genu JAK2 prisotna v večjem deležu pri moški populaciji, kjer je mediana starosti manjša od 70 let.®
Za PV so značilni dejavniki, kot so povečana vrednost hematokrita, povečana masa eritrocitov, prisotnost mutacije JAK2 V617F in zmanjšana koncentracija Epo v serumu. Raziskave so pokazale, da mutacije v ekso-nu 12 gena JAK2 ugotavljamo pri bolnikih s PV ali z idiopatsko eritrocitozo (IE), ki pa ni povezana s trombocitozo in levkocito-zo.11-15 V našem primeru sta imeli bolnici s prisotnima mutacijama v eksonu 12 gena JAK2 povečano število eritrocitov, povečano vrednost hematokrita ter povečano koncentracijo hemoglobina. Pri obeh bolnicah sta bila število levkocitov in število trombocitov v mejah referenčnih vrednosti (Tabela 1), kar je v skladu z raziskavami. Bolnica 2 je imela prav tako nizko koncentracijo Epo v serumu.
Preiskave za določitev mutacij v eksonu 12 gena JAK2 izvajamo stopenjsko. Najprej opravimo analizo taljenja krivulje, nato pa potrjujemo prisotnost in vrsto mutacije z metodo sekvenciranja. Pri bolnicah smo določili mutaciji vrste N542-E543del in E543--D544del, ki sta hkrati tudi najpogostejši mutaciji v področju znotraj eksona 12.^
Največ mutacij v eksonu 12 gena JAK2 se zgodi znotraj regije, ki jo pokrivajo kodoni 537-543.i6'14 Do sedaj poznamo več kot 15 različnih mutacij v eksonu 12 gena JAK2, kot so duplikacije (podvajanje), insercije (vstavljanje), delecije (izbris) in substitucije (zamenjava) določenih nukleotidov. Najpogostejše med njimi so delecije, kjer pride do izgube fragmenta velikosti 6 bp. Te ne vplivajo na bralni okvir, vendar spremenijo končno aminokislinsko sestavo. Analiza se-kvenc najpogostejših delecijskih točkovnih prelomov kaže, da se delecije pri mutacijah v eksonu 12 zgodijo znotraj dveh kratkih ponovitev (AGA).
Druge, do sedaj poznane mutacije v eksonu 12, so: K539L, F537-K539delinsL, R541-E543delinsK, H538-K539delinsL, F537--l546dupF547L, E543del, H538QK539L, 547insLl540-F547, l540-E543delinsMK, F547V, H538DK539LI540S, F537-F547dup, l540-N542delinsS, V536-F547dup in V536--I546dup.7'i6-i9
Rezultati naših preiskav so pokazali, da so rezultati analize krivulje taljenja v skladu z rezultati kvalitativne reakcije PCR ter z rezultati sekvenciranja. Analiza taljenja krivulje je bolj občutljiva metoda kot sekvencira-nje, kar je tudi eden izmed razlogov, da obe preiskavi delamo hkrati in s tem povečamo občutljivost detekcije.
Če preiskavo opravljamo iz vzorca venske krvi, se lahko zgodi, da dobimo negativni rezultat, ki pa je lahko vzrok majhnega števila celic v periferni krvi s prisotno mutacijo v eksonu 12 gena JAK2. V tem primeru moramo za izključitev prisotnosti mutacij v eksonu 12 preiskavo ponoviti še na celicah kostnega mozga.
Zaključek
Uspešno smo vpeljali preiskavo, s katero določamo prisotnost mutacij v eksonu 12 gena JAK2. S sekvenciranjem natančno določimo vrsto prisotne mutacije. Do sedaj smo odkrili več kot 15 različnih mutacij v eksonu 12 gena JAK2, kar pa ne izključuje dejstva, da je lahko prisotnih še več različnih vrst mutacij v eksonu 12 gena JAK2. Tako metoda taljenja krivulje kot sekvenciranje omogočata določitev do sedaj še nepoznanih mutacij v eksonu 12 gena JAK2.
V Specializiranem hematološkem laboratoriju od leta 2011 to preiskavo rutinsko izvajamo kot molekularno-diagnostični preskus pri bolnikih z JAK2 V617F-negativno pravo policitemijo. Določitev mutacij v eksonu 12 gena JAK2 ima pomembno vlogo pri postavitvi diagnoze in razumevanju patofi-ziologije same bolezni in vpliva na odločitev o nadaljnjem zdravljenju.
Literatura
1.	Tefferi A and Vardiman JW. Classification and diagnosis of myeloproliferative neoplasms: The 11. 2008 World Health Organization criteria and po-int-of-care diagnostic algorithms. Leukemia 2008;
22: 14-22.	12.
2.	Mlakar U. Smernice za odkrivanje in zdravljenje prave policitemije. Zdravniški Vestnik 2008; 77: 1-11-4.
3.	Smith CA, Fan G. The saga of JAK2 mutations and translocations in hematologic disorders: pathoge- 13. nesis, diagnostic and therapeutic prospects, and revised World Health Organization diagnostic criteria for myeloproliferative neoplasms. Human Pathology 2008; 39: 795-810.
4.	Kralovics R, Passamonti F, Buser AS, Teo SS, Tiedt 14. R, Passweg JR, et al. A gain-of-function mutation
of JAK2 in myeloproliferative disorders. N Engl J Med 2005; 352: 1779-90.
5.	Baxter EJ, Scott LM, Campbell PJ, East C, Fourou- 15. clas N, Swanton S, et al. Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2 in human myeloproliferative disorders. Lancet 2005; 365: 1054-61.
6.	Pardanani A, Lasho TL, Finke C, Hanson CA and Tefferi A. Prevalence and clinicopathologic cor- 16. relates of JAK2 exon 12 mutations in JAK2V617F--negative polycythemia vera. Leukemia 2007; 21: 1960-3.
7.	Pietra D, Li S, Brisci A, Passamonti F, Rumi E, 17. Theocharides A, et al. Somatic mutations of JAK2 exon 12 in patients with JAK2 (V617F)-negati-
ve myeloproliferative disorders. Blood 2007; 111: 1686-9. 18.
8.	Kouroupi E, Zoi K, Parquet N, Zoi C, Kiladjian JJ, Grigoraki V, et al. Mutations in exon 12 of JAK2 are mainly found in JAK2 V617F-negative polycythae-mia vera patients. Br J Haematol 2008; 142: 676-9.
9.	Schnittger S, Bacher U, Haferlach C, Geer T, Mül- 19. ler P, Mittermüller J, et al. Detection of JAK2 exon
12 mutations in 15 patients with JAK2V617F negative polycythemia vera. Haematologica 2009; 94:
414-8.
10.	Percy MJ, Scott LM, Erber WN, Harrison CN, Reilly JT, Jones FG, et al. The frequency of JAK2
exon 12 mutations in idiopathic erythrocytosis patients with low serum erythropoietin levels. Hae-matologica 2007; 92: 1607-14. Cazzola M. Somatic mutations of JAK2 exon 12 as a molecular basis of erythrocytosis. Haematologi-ca 2007; 92(12): 1585-9.
Ohyashiki JH, Hisatomi H, Shimizu S, Sugaya M and Ohyashiki K. Detection of Low Allele Burden of JAK2 Exon 12 Mutations Using TA-cloning in Patients with Erythrocytosis. Jpn J Clin Oncol
2009; 39(8): 509-13.
Passamonti F, Elena C, Schnittger S, Skoda RC, Green AR, Girodon F, et al. Molecular and clinical features of the myeloproliferative neoplasm associated with JAK2 exon 12 mutations. Blood. 2011; 117 (10): 2813-6.
Scott LM, Tong W, Levine RL, Scott MA, Beer PA, Stratton MR, et al. JAK2 exon 12 mutations in polycythemia vera and idiopathic erythrocytosis. N Engl J Med 2007; 356: 459-68. Martinez-Aviles L, Besses C, Alvarez-Larra'n A, Cervantes F, Herna'ndez-Boluda JC, Bello-sillo B. JAK2 exon 12 mutations in patients with polycythemia vera or idiopathic erythrocytosis. Haematologica 2007; 92: 1717-8. Butcher CM, Hahn U, To LB, Gecz J, Wilkins EJ, Scott HS, et al. Two novel JAK2 exon 12 mutations in JAK2-V617F-negative polycythemia vera patients. Leukemia 2008; 22: 870-3. Li S, Kralovics R, De Libero G, Theocharides A, Gisslinger H, Skoda RC. Clonal heterogeneity in polycythemia vera patients with JAK2 exon 12 and JAK2-V617F mutations. Blood 2008; 111: 3863-6. Lakey MA, Pardanani A, Hoyer JD, Nguyen PL, Lasho TL, Tefferi A, et al. Bone Marrow Morphologic Features in Polycythemia Vera With JAK2 Exon 12 Mutations. Am J Clin Pathol 2010; 133:
942-8.
Passamonti F, Elena C, Schnittger S, Skoda RC, Green AR, Girodon F, et al. Molecular and clinical features of the myeloproliferative neoplasm associated with JAK2 exon 12 mutations. Blood. 2011; 117 (10): 2813-6.