462 FARMAKOLOŠKE VEDE, FARMAKOGNOZIJA, FARMACIJA, TOKSIKOLOGIJA Zdrav Vestn | november – december 2022 | Letnik 91 | https://doi.org/10.6016/ZdravVestn.3358 Avtorske pravice (c) 2022 Zdravniški Vestnik. To delo je licencirano pod Creative Commons Priznanje avtorstva-Nekomercialno 4.0 mednarodno licenco. Zaščitna vloga astrocitov pri zastrupitvi z ogljikovim monoksidom in optimizacija zdravljenja Protective role of astrocytes in carbon monoxide poisoning and optimization of treatment Ivana Krajnc,*,1 Laura Kekec,*,1 Miran Brvar,2,3 Damijana Mojca Jurič4 Izvleček Izhodišča: Zastrupitev z ogljikovim monoksidom (CO) močno okrne funkcijo astrocitov in nevronov. Pozne nevropsiho- loške posledice zastrupitve lahko preprečimo z zdravljenjem s hiperbaričnim kisikom (HBO). V raziskavi smo preučevali učinek CO in HBO na zgodnje procese celične smrti v nevronski in mešani kulturi ter ugotavljali, ali se raven glutationa v astrocitih po izpostavljenosti CO in HBO spremeni in ali bi lahko le-ta bil možna nova tarča za zdravljenje zastrupitve s CO. Metode: Primarne astrocitne, nevronske in mešane celične kulture možganske skorje podgane smo izpostavili 3.000 ppm CO v zraku, nato pa jih v obdobju 24-urne normoksije v različnih časovnih presledkih za 1 uro izpostavili 100-odstotnemu kisiku pri tlaku 3 barov. V celicah mešane in nevronske kulture smo merili aktivnost laktat dehidrogenaze (LDH) in kaspaz 3/7, v astrocitih pa raven glutationa. Rezultati: CO je povzročil zvišanje aktivnosti LDH in kaspaz 3/7 v nevronskih kulturah, v mešanih pa le zvišanje aktivnosti kaspaz 3/7. Po izpostavitvi CO in HBO se je zvišala aktivnost LDH v nevronskih kulturah in znižala aktivnost kaspaz 3/7 v mešanih kulturah. CO je v astrocitih povzročil znižanje celokupnega glutationa (GSHt), zvišanje glutation disulfida (GSSG) in znižanje GSH/GSSG, po izpostavitvi CO in HBO pa se je zvišala GSHt, znižala GSSG in zvišala GSH/GSSG. Zaključek: Razlike v citotoksičnem delovanju CO in zaščitni vlogi HBO v nevronski, mešani in astrocitni kulturi kažejo, da so nevroni, ki rastejo brez astrocitov, v primerjavi z mešano kulturo dovzetnejši za škodljive učinke CO ter nakazujejo, da astrociti ob oksidativnem stresu poskušajo ščititi nevrone, ki so pri sintezi glutationa odvisni od njih. Zdravniški VestnikSlovenia Medical Journal * Avtorici si pripadajoče avtorsko mesto delita. 1 Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Ljubljana, Slovenija 2 Center za klinično toksikologijo in farmakologijo, Univerzitetni klinični center Ljubljana, Slovenija 3 Center za klinično fiziologijo, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Ljubljana, Slovenija 4 Inštitut za farmakologijo in eksperimentalno toksikologijo, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani Ljubljana, Slovenija Korespondenca / Correspondence: Damijana Mojca Jurič, e: damijana-mojca.juric@mf.uni-lj.si Ključne besede: glutation; hiperbarična oksigenacija; nevroni; apoptoza; nekroza Key words: glutathione; hyperbaric oxygenation; neurons; apoptosis; necrosis Prispelo / Received: 2. 5. 2022 | Sprejeto / Accepted: 15. 7. 2022 Citirajte kot/Cite as: Krajnc I, Kekec L, Brvar M, Jurič DM. Zaščitna vloga astrocitov pri zastrupitvi z ogljikovim monoksidom in optimizacija zdravljenja. Zdrav Vestn. 2022;91(11–12):462–73. DOI: https://doi.org/10.6016/ZdravVestn.3358 eng slo element sl article-lang 10.6016/ZdravVestn.3358 doi 2.5.2022 date-received 15.7.2022 date-accepted Pharmacology, pharmacognosy, pharmacy, toxicology Farmakološke vede, farmakognozija, farmacija, toksikologija discipline Original scientific article Izvirni znanstveni članek article-type Protective role of astrocytes in carbon monox- ide poisoning and optimization of treatment Zaščitna vloga astrocitov pri zastrupitvi z ogljikov- im monoksidom in optimizacija zdravljenja article-title Protective role of astrocytes in carbon monox- ide poisoning and optimization of treatment Zaščitna vloga astrocitov pri zastrupitvi z ogljikov- im monoksidom in optimizacija zdravljenja alt-title glutathione, hyperbaric oxygenation, neurons, apoptosis, necrosis glutation, hiperbarična oksigenacija, nevroni, apoptoza, nekroza kwd-group The authors declare that there are no conflicts of interest present. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo nobeni konkurenčni interesi. conflict year volume first month last month first page last page 2022 91 11 12 462 473 name surname aff email Damijana Mojca Jurič 4 damijana-mojca.juric@mf.uni-lj.si name surname aff Ivana Krajnc 1 Laura Kekec 1 Miran Brvar 2,3 eng slo aff-id Institute of Pharmacology and Experimental Toxicology, Faculty of Medicine, University of Ljubljana, Ljubljana, Slovenia Inštitut za farmakologijo in eksperimentalno toksikologijo, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani Ljubljana, Slovenija 1 Faculty of Medicine, University of Ljubljana, Ljubljana, Slovenia Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Ljubljana, Slovenija 2 Centre for Clinical Toxicology and Pharmacology, University Medical Centre Ljubljana, Ljubljana, Slovenia Center za klinično toksikologijo in farmakologijo, Univerzitetni klinični center Ljubljana, Slovenija 3 Centre for Clinical Physiology, Faculty of Medicine, University of Ljubljana, Ljubljana, Slovenia Center za klinično fiziologijo, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Ljubljana, Slovenija 4 463 IZVIRNI ZNANSTVENI ČLANEK Zaščitna vloga astrocitov pri zastrupitvi z ogljikovim monoksidom in optimizacija zdravljenja 1 Uvod 1.1 Zastrupitev z ogljikovim monoksidom Zastrupitev z ogljikovim monoksidom (CO) je naj- pogostejši vzrok nenamernih zastrupitev in najpogostej- ša smrtna zastrupitev v razvitih državah (1). Po podatkih Inštituta za varovanje zdravja Republike Slovenije pri nas letno zaradi nenamerne zastrupitve s CO, brez požarov, umre okoli 5 ljudi, še 13 ljudi pa jih umre zaradi zastru- pitve s CO v požaru in kot posledica namerne zastrupi- tve oziroma samomora (2,3). CO je v ozračju produkt nepopolnega izgorevanja ogljikovodikov, nastaja pa tudi endogeno v normalnih biokemičnih procesih (1,2). CO se iz pljuč z lahkoto vsrka v krvni obtok, kjer se z 240-krat večjo afiniteto veže na vezavna mesta za kisik na hemoglobinu (Hb), s čimer se tvori karboksi- hemoglobin (HbCO), kar dodatno poveča afiniteto za vezavo kisika na Hb in tako ovira sproščanje že vezanega kisika v tkiva (1,2,4,5). Dolgo časa so mislili, da do to- ksičnih učinkov pride le zaradi tkivne hipoksije, vendar delež HbCO v krvi zastrupljencev ne korelira z njihovo klinično sliko (5). Poleg Hb ima CO interakcije z mio- globinom, s citokrom c oksidazo, z gvanilat ciklazo, mi- tohondriji, ionskimi kanalčki, nikotinamid adenin dinu- kleotid fosfat (NADPH) oksidazo in s ksantin oksidazo, v organizmu pa povzroči nastanek reaktivnih kisikov spojin (ROS) ter vnetje. Pri zastrupitvi s CO se NO spro- šča iz trombocitov in različnih hemproteinov, preko NO Abstract Background: Carbon monoxide (CO) poisoning impairs astrocyte and neuron performance. Treatment with hyperbaric oxygen (HBO) can prevent late neuropsychological impairment. We investigated the effect of CO and HBO on the early pro- cesses of cell death in neuronal and mixed culture and determined whether the level of glutathione in astrocytes changes after exposure to CO and HBO and whether it could represent a potential new target for the treatment of CO poisoning. Methods: Primary astrocytes, neuronal and mixed cultures of the rat cerebral cortex were exposed to CO in the air and then to 24-hour normoxia, during which the cells were exposed to 100 % oxygen at 3 bar pressure for 1 hour at various time intervals. We measured the activity of lactate dehydrogenase (LDH) and caspase 3/7 in neuronal and mixed cell cultures and levels of glutathione in astrocytes. Results: CO induced an increase in LDH and caspase 3/7 activity in neuronal culture, but only in caspase 3/7 activity in mixed cultures. After treatment with HBO, there was an increase in LDH activity in neuronal and in caspase 3/7 activity in mixed culture. CO caused a decrease in total glutathione (GSHt), an increase in glutathione disulfide (GSSG), and a de- crease in GSH/GSSG in astrocytes, and after CO/HBO, there was an increase in GSHt, a decrease in GSSG and an increase in GSH/GSSG. Conclusions: Differences in the cytotoxic effect of CO and the protective role of HBO in neuronal, mixed and astrocyte cul- ture show that neurons growing in the absence of astrocytes are more susceptible to the harmful effects of CO compared to mixed culture and suggest that astrocytes attempt to protect neurons that depend on them for glutathione synthesis during oxidative stress. sintaze pa se poveča njegova sinteza. Kombinacija CO, prostih radikalov in NO vodi v nastanek peroksinitrita (ONOO-), močnega ROS, ki skupaj s hidrogen peroksi- dom, superoksidom in ostalimi prostimi radikali okvari DNA/RNA, povzroča peroksidacijo lipidov, apopto- zo, poškodbe žilnega endotela in aktivacijo imunskega sistema. Ti mehanizmi skupaj vodijo v demielinizacijo osrednjega živčevja (OŽ) (1,2,4-6). Simptomi in znaki zastrupitve s CO so nespecifični. Akutne zastrupitve delimo na blage, zmerne in hude. Blage se pogosto spregledajo in se lahko kažejo z zna- ki blage viroze in blagim glavobolom, slabostjo, bruha- njem, utrujenostjo, omotičnostjo, oslabelostjo, poslab- šanjem osnovne bolezni (npr. kroničnega bronhitisa ali angine pektoris), zmerne pa z močnim glavobolom, za- spanostjo, zmedenostjo, nevropsihološko prizadetostjo, motnjami vida, zanašanjem pri hoji, mišično nemočjo ter hitrim bitjem srca. Pri hujših zastrupitvah pride do nezavesti, epileptičnih krčev, bolečine za prsnico, čemur lahko sledijo odpoved srca in dihanja ter smrt. Dolgo- trajne kronične izpostavitve CO se slabo prepoznavajo, ker se kažejo s kronično utrujenostjo, čustveno labil- nostjo, težavami s spominom, z vrtoglavico, motnjami spanja, bolečinami v trebuhu in drisko. Po akutni zastru- pitvi s CO imajo bolniki pogosto nevropsihološke posle- dice, ki se pojavijo po nekaj tednih ali mesecih (1,2,5,6). Ob zastrupitvi s CO je prvi ukrep dajanje 464 FARMAKOLOŠKE VEDE, FARMAKOGNOZIJA, FARMACIJA, TOKSIKOLOGIJA Zdrav Vestn | november – december 2022 | Letnik 91 | https://doi.org/10.6016/ZdravVestn.3358 normobaričnega kisika (NBO) preko maske z rezervo- arjem do padca HbCO pod 5 % (2,5). Ob težjih zastrupi- tvah jih nato v Sloveniji zdravimo s hiperbaričnim kisi- kom (HBO) 90 minut s 100-odstotnim kisikom pri tlaku 3 barov (2). Zdravljenje s HBO izboljša napoved izida pri bolni- kih, saj zmanjša incidenco nevropsiholoških posledic pri zastrupljencih (7), čeprav natančni mehanizmi še niso raziskani. HBO skrajša razpolovni čas HbCO na 20 mi- nut, izboljša oksigenacijo tkiv, poveča sintezo ATP, zniža oksidativni stres in vnetje (2,5). Kratkotrajno zdravljenje (do 120 minut) s HBO pri 3 barih je splošno sprejeto kot varno, z daljšim časom izpostavljenosti kisiku pri viso- kem tlaku pa bi se verjetnost toksičnih poškodb moč- no povečala. Toksični vpliv kisika na OŽ se kaže kot t. i. efekt Bert s hiperoksičnimi krči (6), na celični ravni pa previsoke koncentracije kisika vodijo v nastanek ROS. Hipoksiji možganov ob zastrupitvi s CO sledi reoksige- nacijska poškodba možganov, pri kateri se prav tako tvo- ri ROS in nato vnetje ter reperfuzijske poškodbe (2,4). 1.2 Astrociti in njihova zaščitna vloga Astrociti so najštevilčnejše celice glije, ki se preko ak- tivnih stikov z nevroni, drugimi astrociti, mikroglijo in oligodendrociti hitro odzivajo na spremembe v okolju. Razporejeni so po celotnem OŽ in imajo med glijalnimi celicami najbolj intimen in dinamičen odnos z vsemi de- li nevronov, z ustvarjanjem primernega okolja skrbijo za njihovo zorenje, diferenciacijo in preživetje ter sodeluje- jo pri nastajanju in vzdrževanju sinaps in sinaptični pla- stičnosti (8). Pri okrnjenem delovanju OŽ se mirujoči astrociti morfološko, molekularno in funkcionalno spre- menijo v reaktivne celice, ki sodelujejo pri odstranjeva- nju strupenih snovi, ščitijo pred oksidativnim stresom in podpirajo preživetje nevronov ter njihovo rast (9). 1.3 Glutation Glutation v reducirani obliki (GSH) je endogeni an- tioksidant, ki se nahaja v večini celic v telesu, vključno z astrociti in nevroni. Je tripeptid, ki nastane iz cisteina (Cys), glutamata in glicina s pomočjo glutamat cistein ligaze (GCL) in glutation sintetaze. Igra najpomemb- nejšo vlogo pri obrambi celic pred oksidativnimi po- škodbami. Visoka koncentracija v astrocitih in njihova velika sposobnost razstrupljanja ščiti tako astrocite kot tudi nevrone pred škodljivimi vplivi oksidantov in toksi- nov. Njegova sinteza v nevronih je odvisna tudi od de- lovanja astrocitov, ki jim zagotavljajo zadostne količine prekurzorjev. Glutation je odgovoren za odstranjevanje ksenobiotikov, sodeluje pri proliferaciji in diferenciaciji celic, apoptozi ter je prenašalec in vir cisteina (10,11). GSH reagira s prostimi radikali in sodeluje v reakci- jah odstranjevanja peroksidov, ki jih katalizira glutation peroksidaza (GPx). Ko GSH tem molekulam odda vodik in jih s tem reducira, se dve molekuli GSH povežeta v oksidirano obliko, tj. v GSSG. Encim glutation reduktaza (GR) v reakciji, pri kateri NADPH deluje kot donor, iz GSSG obnovi dve molekuli GSH. Tako se GSH najprej uporabi v reakcijah detoksifikacije in nato obnovi z en- cimom GR, pri čemer celokupna koncentracija GSH (GSHt) ostaja enaka. Zadostna količina GSH je nujna za delovanje antioksidativnega sistema (10). V celici, ki je v nestresnem okolju, je razmerje GSH/GSSG okoli 9,0, ob staranju in dolgotrajnem oksidativnem stresu se po- makne na stran oksidirane oblike in se približa vrednos- ti 0,5 (12). Glutation in njegovi prekurzorji s pomočjo prenašalcev prehajajo krvno-možgansko pregrado (13). Koncentracija GSHt se v celici zniža pri sintezi GSH-ko- njugatov, ki nastajajo ob detoksifikaciji ksenobiotikov in konjugaciji endogenih spojin z GSH. Do znižanja kon- centracije GSHt pride tudi pri prenosu GSH in njegovih derivatov iz celic v okolico (10). 1.4 Razlog za izvedbo raziskave Zastrupitev s CO močno okrne funkcijo astroci- tov (14,15,16) in nevronov (1,2,4,5), vendar pozne nevropsihološke posledice zastrupitve lahko prepreči- mo z zdravljenjem v hiperbarični komori (2,5,7). V tej raziskavi smo želeli ugotoviti dvoje; prvič, ali akutna izpostavljenost CO/hipoksiji proži zgodnje procese ce- lične smrti v nevronski in mešani (nevronsko-astroci- tni) celični kulturi, ter drugič, ali oksidativni stres, ki ga povzroča CO, vpliva na ravni glutationa v astrocitni celični kulturi. HBO učinkovito zmanjšuje posledice de- lovanja CO v astrocitih (14,15,16), zato nas je zanimalo, ali zaščitno deluje tudi v mešani in nevronski celični kul- turi. Preverili pa smo tudi, ali se raven glutationa v astro- citih po izpostavljenosti CO in HBO spremeni. Tako bi morda lahko postal nova tarča za zdravljenje zastrupitve s CO. 2 Metode 2.1 Poskusne živali in priprava celičnih kultur Za pripravo primarnih nevronskih in mešanih ce- ličnih kultur možganske skorje podgane smo uporabili 465 IZVIRNI ZNANSTVENI ČLANEK Zaščitna vloga astrocitov pri zastrupitvi z ogljikovim monoksidom in optimizacija zdravljenja 18 dni stare plodove datumsko parjenih podgan Wistar, za pripravo astrocitov možganske skorje podgane pa novorojene (1–3 dni stare) podgane Wistar, vzgojene v Medicinskem eksperimentalnem centru Inštituta za pa- tologijo Medicinske fakultete. Celične kulture smo pri- pravili po protokolih, opisanih v Prešernovi nalogi (17). Postopki priprave celičnih kultur so bili v skladu z do- voljenjem, ki ga je izdala Uprava Republike Slovenije za varno hrano, veterinarstvo in zdravje rastlin za delo na tkivih (št. potrdila: U34401-3/2013/3). Usmrtitev živali smo prijavili na Veterinarsko upravo Republike Sloveni- je (št. potrdila: 34401-87/2008/3). 2.2 Izpostavitev celičnih kultur ogljikovemu monoksidu Celice smo v prirejenem inkubatorju (New Brun- swick Scientific) izpostavili mešanici 3000 ppm CO in 5 % CO2 v zraku za različno dolga obdobja (1–8 ur). Po izpostavitvi CO smo celice za 24 ur vrnili v inkubator s standardnimi razmerami (CO/normoksija). Kontrolne celice smo inkubirali v standardnih razmerah. 2.3 Izpostavitev celičnih kultur hiperbaričnemu kisiku V nadaljevanju študije smo celice, ki so bile 8 ur iz- postavljene CO, v različnih časovnih presledkih (0, 1, 3, 5 ali 7 ur po CO), za 1 uro prestavili v hiperbarično ko- moro, v kateri smo jih izpostavili 100-odstotnemu kisiku pri tlaku 3 barov (CO/HBO). Celice smo nato vrnili v inkubator s standardnimi razmerami ter jih analizirali 24 ur po 8-urnem poskusu s CO. Kontrolne celice smo za 1 uro izpostavili HBO in jih nato 24 ur inkubirali v standardnih razmerah. 2.4 Določanje aktivnosti kaspaze 3/7 Aktivnost poglavitne izvršilne kaspaze 3/7 smo me- rili s testom Caspase-Glo® 3/7 Assay (Promega Corpora- tion, Madison, ZDA). Merili smo luminiscenčni signal, ki nastane ob cepitvi substrata z aktivno kaspazo. S tem smo določali stopnjo apoptoze. 2.5 Določanje citotoksičnosti celic – merjenje laktat dehidrogenaze Zastrupitev s CO in kasnejše zdravljenje s HBO lah- ko povzročita poškodbe celične membrane, zaradi česar celice sproščajo laktat dehidrogenazo (LDH). Sprošče- ni LDH iz poškodovanih celic smo določali s testom CytoTox-ONE Homogenous Membrane Integrity (Pro- mega Corporation, Madison, ZDA) ter rezultate predsta- vili kot delež pozitivne kontrolne vrednosti. 2.6 Določanje koncentracije celokupnega glutationa in glutation disulfida v astrocitih Za merjenje koncentracije GSHt in GSSG v vzorcu smo uporabili Glutathione Assay Kit (Cayman Che- mical, Ann Arbor, Michigan, ZDA). Meritev absorban- ce nam je podala koncentracijo GSH v vzorcu. Zaradi uporabe encima GR, ki vodi v redukcijo GSSG, smo v vzorcih s to metodo lahko izmerili koncentracijo celo- kupnega GSH (17). Po posebnem protokolu smo dolo- čili tudi koncentracijo GSSG (17). V vzorcih, v katerih smo merili celokupni GSH in GSSG, smo koncentracijo proteinov določali z metodo po Bradfordu s kompletom BIO-RAD Protein Assay (18). GSH v reducirani obliki smo izračunali kot GSH = celokupni GSH – 2× GSSG. Iz koncentracij GSH in GSSG smo izračunali razmerje GSH/GSSG. 2.7 Statistična obdelava podatkov Podatke smo statistično obdelali in podali v obliki grafov z računalniškim programom GraphPad Prism, verzija 9.1.1 (GraphPad Software Inc., San Diego, ZDA). Predstavili smo jih s srednjo vrednostjo in standardnim odklonom od aritmetične sredine (x ± SD) 4 – 6 neodvi- snih poskusov (n = 4–6), ki smo jih izvedli v treh para- lelah. Točke na grafih predstavljajo povprečne vrednosti rezultata posameznega poskusa. Statistično značilnost rezultatov smo preverili z enosmerno analizo varian- ce (angl. one-way ANOVA) in t.i. post hoc testom z Dunnettovim popravkom. Za mejo statistične značil- nosti smo uporabili vrednost p < 0,05. Raziskavo je odobrila Komisija Republike Slovenije za medicinsko etiko (številka 0120-519/2019/4, 4. de- cembra 2019). 3 Rezultati 3.1 Vpliv CO/normoksije na zgodnje procese celične smrti v nevronski in mešani celični kulturi Po 5-urni izpostavljenosti CO in 24-urni normo- ksiji se je aktivnost encima LDH, pokazatelja celične nekroze, v nevronski kulturi značilno, tj. 1,6-krat, pove- čala. Najvišji porast smo zabeležili po 8-urni inkubaciji v CO (Slika 1A). Izpostavljenost CO v tem obdobju ni 466 FARMAKOLOŠKE VEDE, FARMAKOGNOZIJA, FARMACIJA, TOKSIKOLOGIJA Zdrav Vestn | november – december 2022 | Letnik 91 | https://doi.org/10.6016/ZdravVestn.3358 značilno vplivala na delež sproščenega LDH v celicah mešane kulture (Slika 1A-B). Povečanje aktivnosti sprožilca programirane celične smrti – izvršilne kaspaze 3/7 – smo zaznali v nevron- ski celični kulturi po 3-urni (Slika 1C), v mešani kulturi pa po 5-urni izpostavljenosti CO (Slika 1D). Največjo aktivnosti kaspaze 3/7 smo v obeh kulturah zaznali po 8-urni inkubaciji v CO, v nevronski kulturi se je poveča- la za 3,3-krat, v mešani kulturi pa za 2,5-krat v primerja- vi s kontrolo (Slika 1C-D). 3.2 Vpliv CO/normoksije na raven glutationa v astrocitni celični kulturi Astrociti možganske skorje novorojene podgane so v kontrolnih pogojih vsebovali 33,1 ± 2,2 μM GSHt /mg pro- teina in 4,9 ± 0,6 μM GSSG /mg proteina. Razmerje GSH/ GSSG v kontrolnih celicah je znašalo 5,8 ± 0,9 (Slika 2). Koncentracija GSHt se je ob izpostavljenosti CO/ normoksiji znižala, pri čemer smo statistično značilni 27,2-odstotni padec glede na kontrolo zaznali po 8-urni izpostavljenosti CO (Slika 2A). Po daljši izpostavljenosti CO/normoksiji smo opazili akumuliranje oksidirane- ga GSSG. Značilno spremembo smo izmerili po 8-urni inkubaciji s CO, ko je koncentracija GSSG znašala 9,1 ± 1,5 μM/mg proteina in narasla 1,9-krat glede na kon- trolo (Slika 2B). Dolgotrajni oksidativni stres pomakne razmerje GSH/GSSG v smer oksidirane oblike. Statistič- no značilen 53,4-odstotni padec glede na kontrolo smo opazili po 4-urni izpostavljenosti CO, ko je bilo razmer- je GSH/GSSG 2,7 ± 0,9. Največji padec razmerja GSH/ GSSG smo ugotovili po 8-urni izpostavljenosti CO, ko je razmerje znašalo 2,1 ± 0,7, kar je pomenilo 63,8-odsto- tni padec glede na kontrolo (Slika 2C). Slika 1: Vpliv CO/normoksije na aktivnost LDH v A) nevronskih in B) mešanih celičnih kulturah ter aktivnost kaspaze 3/7 v C) nevronskih in D) mešanih celičnih kulturah možganske skorje podgane. Rezultati so predstavljeni kot srednja vrednost ± SD 6 neodvisnih poskusov (n = 6). Točke na grafu predstavljajo povprečne vrednosti rezultata posameznega poskusa. Statistično značilnost vpliva CO smo preverili z analizo variance med skupinami in z Dunnettovim popravkom. Označena je z zvezdico * (p < 0,05 v primerjavi s kontrolo). A) B) C) D) 467 IZVIRNI ZNANSTVENI ČLANEK Zaščitna vloga astrocitov pri zastrupitvi z ogljikovim monoksidom in optimizacija zdravljenja 3.3 Vpliv hiperbaričnega kisika na zgodnje procese celične smrti po izpostavitvi CO/ normoksiji v nevronski in mešani celični kulturi Inkubacija nevronske kulture v hiperbarični komo- ri v danih časovnih intervalih ni zavrla citotoksičnega učinka izpostavljenosti CO/normoksiji. Delež sprošče- nega LDH se ni zmanjšal, pač pa smo pri zdravljenju s HBO 3 ure po 8-urni izpostavljenosti CO izmerili zna- čilen 1,3-kratni porast sproščenega LDH glede na celice, izpostavljene samo CO/normoksiji (Slika 3A). Inkubacija nevronske celične kulture v hiperbarični komori v danih časovnih presledkih prav tako ni zavrla zgodnjih apoptotičnih procesov, ki jih je sprožila izpo- stavljenost CO/normoksiji. Tako izpostavljenost zgolj HBO kot tudi izpostavljenost HBO po zastrupitvi s CO privedeta do povečane aktivnosti kaspaze 3/7 (Slika 3C). Po 1-urni inkubaciji nevronov v HBO se je aktivnost kaspaze 3/7 povečala 2,7-krat v primerjavi s kontrolnimi celicami, kar kaže, da že samo 100-odstotni kisik pri 3 barih spodbuja proženje apoptoze. Inkubacija celic mešane kulture v hiperbarični ko- mori po 8-urni izpostavljenosti CO v danih presledkih v času 24-urne normoksije ni povzročila statistično zna- čilnega porasta sproščanja LDH (Slika 3B). Inkubacija celic mešane kulture v hiperbarični komo- ri v danih časovnih presledkih je uspešno zavrla apopto- zo, ki jih je sprožila izpostavljenost CO/normoksiji. Pri zdravljenju s HBO smo beležili značilen upad aktivno- sti kaspaze 3/7 od 1 do 5 ur po 8-urni izpostavljenosti CO, medtem ko takojšnja in nekoliko zakasnela (7 ur po 8-urni izpostavljenosti CO) inkubacija v HBO nista zna- čilno zavrli kaspazne aktivnosti (Slika 3D). Slika 2: Vpliv CO/normoksije na A) koncentracijo GSHt, B) koncentracijo GSSG in C) razmerje GSH/GSSG v astrocitih možganske skorje podgane. Rezultati so predstavljeni kot srednja vrednost ± SD 5–6 neodvisnih poskusov (n = 5–6). Točke na grafu so povprečne vrednosti rezultata posameznega poskusa. Statistično značilnost vpliva CO smo preverili z analizo variance med skupinami in z Dunnettovim popravkom in je označena z zvezdico * (p < 0,05 v primerjavi s kontrolo). A) B) C) 468 FARMAKOLOŠKE VEDE, FARMAKOGNOZIJA, FARMACIJA, TOKSIKOLOGIJA Zdrav Vestn | november – december 2022 | Letnik 91 | https://doi.org/10.6016/ZdravVestn.3358 Izpostavljenost celic zgolj HBO ni povzročila stati- stično značilnega povečanja aktivnosti LDH v nevronski ali mešani celični kulturi (Slika 3A-B), prav tako pa tudi ni prožila kaspaze 3/7 v mešani kulturi (Slika 3D). 3.4 Vpliv hiperbaričnega kisika na raven glutationa po izpostavljenosti CO/normoksiji v astrocitih V celicah, ki so bile zdravljene s HBO takoj po za- strupitvi s CO, je bila koncentracija GSHt značilno, tj. za 17,5 %, nižja, inkubacija s HBO v kasnejših presledkih, od 1 do 7 ur po CO, pa je povzročila dvig GSHt glede na astrocite, izpostavljene le CO/normoksiji. Največji porast GSHt smo beležili pri celicah, ki so bile HBO iz- postavljene 7 ur po zastrupitvi s CO. Koncentracija je znašala 35,1 ± 2,6 μM GSHt/mg proteina. Inkubacija astrocitov zgolj v HBO ni statistično značilno vplivala na znotrajcelični GSHt. V celicah smo izmerili 34,7 ± 3,1 μM GSHt/mg proteina (Slika 4A). Vpliv HBO se je odslikaval tudi na koncentraciji oksi- diranega GSSG. Ugotovili smo, da je zgolj HBO po 1-ur- ni inkubaciji statistično značilno povečal koncentracijo GSSG (6,5 ± 0,4 μM GSSG/mg proteina). Na astrocitih, Slika 3: Vpliv HBO po izpostavljenosti CO/normoksiji na aktivnost LDH v A) nevronskih in B) mešanih celičnih kulturah ter aktivnost kaspaze 3/7 v C) nevronskih in D) mešanih celičnih kulturah možganske skorje podgane. Rezultati so predstavljeni kot srednja vrednost ± SD 5–6 neodvisnih poskusov (n = 5–6). Točke na grafu so povprečne vrednosti rezultata posameznega poskusa. Statistično značilnost vpliva HBO smo preverili z analizo variance med skupinami in z Dunnettovim popravkom. Označena je z zvezdico * (p < 0,05 v primerjavi s kontrolo) ali številskim znakom # (p < 0,05 v primerjavi s CO/normoksijo). A) B) C) D) 469 IZVIRNI ZNANSTVENI ČLANEK Zaščitna vloga astrocitov pri zastrupitvi z ogljikovim monoksidom in optimizacija zdravljenja inkubiranih s CO, je HBO v intervalih od 1 do 7 ur po CO povzročil značilno znižanje GSSG glede na izpo- stavljenost CO/normoksiji. Največje znižanje koncen- tracije GSSG smo izmerili pri celicah, ki so bile HBO izpostavljene 7 ur po CO. Koncentracija je znašala 5,0 ± 0,9 μM GSSG/mg proteina (Slika 4B). Pri izpostavljenosti celic zgolj 1-urni inkubaciji s HBO je prišlo do statistično značilnih sprememb raz- merja GSH/GSSG. Razmerje se je znižalo (3,8 ± 0,3) glede na kontrolo. Inkubacija celic s HBO po izposta- vljenosti CO je v časovnih intervalih 1–7 ur po CO povzročila značilno zvišanje razmerja med GSH/GSSG glede na celice, izpostavljene le CO/normoksiji (Slika 4C). 4 Razprava Uporaba HBO za zdravljenje zastrupitev s CO je še vedno kontroverzna. Nekatere študije potrjujejo ugo- den učinek HBO in mu pripisujejo znižano inciden- co nevropsiholoških posledic po zastrupitvi, druge pa HBO povezujejo celo s slabšim izidom zdravljenja (2,5-7). Vloga astrocitov ostaja pri izidu zdravljenja še vedno slabo poznana. Akutna zastrupitev z visokimi Slika 4: Vpliv HBO po izpostavljenosti CO na A) koncentracijo GSHt, B) koncentracijo GSSG in C) razmerje GSH/GSSG v astrocitih možganske skorje podgane. Rezultati so predstavljeni kot srednja vrednost ± SD 4–5 neodvisnih poskusov (n = 4–5). Točke na grafu so povprečne vrednosti rezultata posameznega poskusa. Statistično značilnost vpliva HBO smo preverili z analizo variance med skupinami in z Dunnettovim popravkom in je označena z zvezdico * (p < 0,05 v primerjavi s kontrolo) ali številskim znakom # (p < 0,05 v primerjavi s CO/normoksijo). A) B) C) 470 FARMAKOLOŠKE VEDE, FARMAKOGNOZIJA, FARMACIJA, TOKSIKOLOGIJA Zdrav Vestn | november – december 2022 | Letnik 91 | https://doi.org/10.6016/ZdravVestn.3358 koncentracijami CO močno zavre njihovo delovanje, saj povzroča oksidativni stres in mitohondrijsko disfunk- cijo ter preko aktiviranja različnih cisteinskih proteaz sproža apoptozo, medtem ko zdravljenje s HBO po za- strupitvi zavira apoptozo in izboljšuje presnovne funk- cije (15,16). V raziskavi smo preverili, ali zdravljenje s HBO preko ugodnega delovanja na astrocite ščiti tudi nevrone, kar bi lahko bil eden od razlogov za manjšo incidenco nevropsiholoških posledic po zdravljenju s HBO. Zastrupitev s CO vodi v nastanek prostih radika- lov (2,4), zato smo se pri raziskovanju zaščitnih meha- nizmov osredinili na spremembe v ravni antioksidanta glutationa v astrocitih. V prvem delu raziskave smo preučevali vpliv CO na zgodnje procese celične smrti, torej na pojav nekro- ze – citotoksičnosti in apoptoze v nevronih možganske skorje podgane, ki so rastli v celični kulturi brez priso- tnosti astrocitov, ter rezultate primerjali z mešano kul- turo nevronov in astrocitov. Citotoksični učinek CO, ki smo ga določili z merjenjem koncentracije LDH, se je v nevronskih kulturah povečeval s časom (Slika 1A), v ce- licah mešane kulture pa značilnih sprememb ravni LDH nismo zaznali (Slika 1B). Znano je, da CO ne povzro- ča poškodb celične membrane astrocitov in ne sproža nekrotičnih procesov v teh celicah (16). Razlike v cito- toksičnem delovanju CO v nevronski (Slika 1A), mešani (Slika 1B) in astrocitni (15) kulturi tako kažejo, da so nevroni, ki rastejo v odsotnosti astrocitov, v primerjavi z mešano kulturo dovzetnejši za škodljive učinke CO. Nakazujejo, da astrociti posedujejo zaščitne mehaniz- me, ki jih pri nevronih ni. Astrocitno podporno vlogo pri zaščiti nevronov ob izpostavljenosti CO potrjujejo tudi meritve aktivnosti izvršilne kaspaze 3/7. V nevron- ski kulturi je njena vrednost 3,3-krat presegla aktivnost kaspaze v kontrolnih celicah (Slika 1C), v mešani celični kulturi pa se aktivira kasneje in manj ter po 8-urni izpo- stavljenosti CO/normoksiji doseže 2,5-kratno vrednost kontrole (Slika 1D). Toksičen učinek CO na nevrone je posledica okvar številnih procesov, kar vodi v nekrozo celic. Pomembni so predvsem mehanizmi nastanka oksidativnega stresa. Z vezavo na citokrom a in c oksidazi vpliva na delovanje mitohondrijev, zavre celično dihanje ter povzroči nasta- nek superoksidnega aniona, aktivacija ksantin oksida- ze, pri kateri kot stranski produkt nastaja peroksid, in NADPH oksidaze, ki vodi v nastanek hidroskilnega ra- dikala, pa skupaj s povišano koncentracijo NO povzro- čita nastanek posebej toksičnega ONOO-. Vse to vodi v okvaro DNA, RNA, peroksidacijo lipidov in nekrozo celic (2,4,5,19). Astrociti so bolj odporni na stres kot nevroni, saj endogeni mehanizmi, kot so biogeneza mitohondrijev in sinteza antioksidantov ter s tem boljša zaščita pred oksi- dativnim stresom, energijski metabolizem in metaboliti, kot je L-laktat, modulacija vnetnih procesov ter privzem živčnih prenašalcev in nevrotoksinov, ščitijo homeosta- zo astrocitov, s tem pa preko dinamičnih interakcij tudi funkcijo nevronov (20). V nadaljevanju smo proučili vpliv izpostavljenosti CO na homeostazo endogenega antioksidanta glutatio- na. V astrocitih smo izmerili koncentracijo celokupnega GSHt (Slika 2A) in oksidiranega GSSG (Slika 2B), iz te- ga pa izračunali koncentracijo GSH ter razmerje GSH/ GSSG (Slika 2C). Razmerje GSH/GSSG in spremembe v ravni glutationa zrcalijo oksidativni stres celic, saj GSH prehaja v oksidirano obliko (Slika 2). Nižja koncentraci- ja GSHt in nižja vrednost razmerja GSH/GSSG je morda posledica izločanja glutationa v okolico, s čimer astrociti ob oksidativnem stresu poskušajo ščititi nevrone, ki so pri sintezi glutationa odvisni od njih (11). Nižje ravni sovpadajo tudi s predhodnimi opažanji, da izpostavlje- nost CO znižuje koncentracijo ATP v astrocitih (15), kar je lahko posledica sprememb oksidativnega metabo- lizma, saj CO toksično deluje na mitohondrije (3,4,15). To pa lahko vodi do zmanjšanja sinteze GSH, ki je od ATP-odvisen proces (10,11). Ob zastrupitvi s CO lahko nastajajo tudi GSH-konjugati, ki se izločijo iz celice, po- rabljeni GSH pa celicam ni več na voljo (10). V poskusih na podganah, zastrupljenih s CO, so ugotavljali znižano aktivnost GR v nevronih možganske skorje in hipokam- pusa (21). GR sodeluje pri obnovi reduciranega glutati- ona iz GSSG, pri čemer v reakciji sodeluje NADPH. CO aktivira NADPH oksidazo, pri tem nastaja NADP+ (19). Morda učinek CO na GR in NADPH oksidazo predsta- vlja četrti možni mehanizem znižanja razmerja GSH/ GSSG ob zastrupitvi s CO. Trenutne smernice zdravljenja zastrupitev s CO pred- videvajo zdravljenje s 100-odstotnim kisikom za lažje in s HBO za težje zastrupljene bolnike (2). V naši raziskavi smo želeli potrditi, da HBO večinoma deluje ugodno na celice, izpostavljene CO. Glede na ugotovitve, da se ško- dljivi učinek CO na obeh proučevanih celičnih kulturah v polni meri izrazi po 8 urah izpostavljenosti CO (Slika 1), smo poskus zdravljenja s HBO izvedli po 8 urah in- kubacije celic v CO. Celice smo med 24-urno normoksi- jo v različnih časovnih presledkih (0–7 ur po CO) za eno uro izpostavili HBO in merili iste parametre kot pri ugo- tavljanju preživetja celic po zastrupitvi s CO. Rezultati so potrdili časovno odvisen varovalni vpliv HBO na celice v mešani kulturi, saj zavira aktivnost kaspaz 3/7 (Slika 3D) in ne proži citotoksičnosti (Slika 3B). Nevroni v kul- turi se na izpostavitev hiperbaričnemu kisiku odzivajo 471 IZVIRNI ZNANSTVENI ČLANEK Zaščitna vloga astrocitov pri zastrupitvi z ogljikovim monoksidom in optimizacija zdravljenja drugače. HBO, ki sam ne spodbuja sproščanja LDH (Slika 3A), ne zavira škodljivega delovanja CO, pač pa celo poveča njegov citotoksični učinek (Slika 3A). Že v kontrolni nevronski kulturi kot tudi v celicah, ki so bile izpostavljene CO, HBO spodbuja aktivnost kaspaz 3/7 (Slika 3D), kar dokazuje toksični vpliv kisika pod tla- kom na celice. Hiperoksične razmere spodbujajo tvor- bo kisikovih prostih radikalov, ki so pomembne signal- ne molekule z zaščitnim ali škodljivim delovanjem, kar je močno odvisno od prisotnosti antioksidantov (22). Kaže, da v nevronih antioksidativni obrambni meha- nizmi po kratkotrajni izpostavitvi hiperoksiji niso do- volj učinkoviti, zato se oksidativni stres, ki nastane, ne popravi; še slabše je po zastrupitvi s CO. Zdravljenje s HBO je najbolj učinkovito v časovnem presledku 1–5 ur po izpostavljenosti CO (Slika 4D) (15,16). Ponovno pa smo dokazali boljše preživetje celic v mešani kulturi, kar kaže na zaščitno vlogo astrocitov, ki jo je HBO še izboljšal. HBO zmanjša proženje apop- toze preko številnih mehanizmov, saj poveča izražanje antiapoptotskih proteinov Bcl-2 in Bcl-xL, zmanjša sproščanje proapoptotskega proteina Bax ter citokroma c, vpliva na aktiviranje ionskih kanalov in zviša izra- žanje superoksid dismutaze (SOD), kar zmanjša nasta- nek ROS (23,24). Uporaba HBO po zastrupitvi mešane celične kulture s CO v določenem časovnem okviru torej preprečuje njegove škodljive učinke, kar ponov- no upravičuje in potrjuje uporabo HBO v terapevtske namene pri zastrupljenih s CO. HBO vpliva na homeostazo glutationa v astrocitih, saj enourna izpostavljenost zviša koncentracijo GSSG in s tem zniža razmerje GSH/GSSG (Slika 4). Predvi- devamo, da je učinek HBO posledica oksidativnega stresa, ki povzroči oksidacijo GSH v GSSG. Pri celicah, ki so bile po izpostavitvi CO zdravljene s HBO, slednji normalizira koncentracije GSHt, GSSG in razmerja GSH/GSSG na vrednosti kontrolne skupine, s čimer iz- niči toksični učinek CO (Slika 4). Za najboljši časovni presledek zdravljenja s HBO se je izkazal čas 1–7 ur po izpostavitvi CO, kar delno sovpada z ugotovitvami pri vplivu HBO na apoptozo po CO v mešani kulturi (Slika 3D). Znižana koncentracija GSHt v astrocitih po CO je lahko posledica povečane sekrecije, manjše sinteze in porabe GSH v procesih detoksifikacije ter vpliva na ob- novo GSH. HBO zniža raven apoptoze in oksidativni stres po izpostavitvi CO (15,16). Opazili so tudi padec aktivnosti NO sintaze in nižje koncentracije NO (24), kar zmanjša nastajanje prostih radikalov. Vse skupaj pa lahko vodi v nižjo porabo GSH ter njegovo zmanjšano sekrecijo, saj imajo celice manj signalov, zaradi katerih bi ga sicer izločile v okolico. Na zmanjšano sintezo GSH bi HBO lahko deloval preko številnih poti v metabo- lizmu glutationa. Znano je, da HBO v astrocitih zviša koncentracijo ATP, saj s tem, ko izpodrine CO s citok- rom c oksidaze in zmanjša peroksidacijo mitohondri- jev, omogoči sintezo ATP (15). Vpliva HBO na GR v literaturi nismo zasledili. Gre za še neraziskano podro- čje. So pa poskusi na miši pokazali, da HBO po zastru- pitvi s CO zavre NADPH oksidazo, kar zmanjša oksi- dativni stres (25) in lahko omogoči obnovo GSH. HBO preko naštetih mehanizmov z zavoro toksičnih učinkov CO verjetno zmanjša oksidativni stres, zavre apoptozo, zviša koncentraciji ATP in NADPH. To odpravi zavoro sinteze ter obnove GSH, kar vodi do povečanja koncen- tracije GSHt, znižanja koncentracije GSSG ter zvišanja razmerja GSH/GSSG v primerjavi s celicami, izpostav- ljenimi le CO (Slika 4). 4.1 Klinična uporabnost raziskave Raziskovanje oksidativnih procesov pri zastrupitvi s CO in zdravljenju s HBO je pomembno, saj obstajajo možna zdravila, ki izboljšajo antioksidativno sposob- nost celic ter bi lahko postala nova linija zdravljenja pri zastrupitvah s CO. Glutation je pri zastrupitvi s CO verjetno udeležen v zaščitnih mehanizmih astrocitov, k čemur dodatno prispeva izpostavljenost HBO. Na to kažejo naši rezultati (Sliki 3 in 4). Za izboljšanje antioksidativnega delovanja astro- citov bi v protokol zdravljenja zastrupitve s CO lahko dodali prekurzorje glutationa ali njegove analoge. Kon- centracija GSH v nevronih je odvisna od razpoložlji- vega cisteina, vendar zviševanje koncentracije GSH z dodatkom cisteina ni priporočljivo zaradi nevrotoksič- nih učinkov cisteina (26). N-acetilcistein je molekula, ki prehaja krvno-možgansko pregrado in deluje kot prekurzor v sintezi GSH. Vsebuje tiolno skupino, zato lahko že sam deluje kot antioksidant in reducira ROS. Dokazano je, da dodatek N-acetilcisteina prispeva k boljšemu izidu zdravljenja nevropatij, možganskih po- škodb in drugih bolezni OŽ (27). Raven glutationa bi lahko zvišali tudi z dodajanjem čistega GSH, saj prečka krvno-možgansko pregrado (13). Študije so pokazale, da je pri peroralnem vnosu GSH biorazpoložljivost majhna, prav tako je prehajanje v mo- žgane vprašljivo zaradi velikega primarnega privzema je- ter in črevesja. Pri intravenskem in intranazalnem vnosu čistega GSH so opažali porast njegove koncentracije v možganih (28). Za zdravljenje bi se lahko uporabljali tu- di sintezni analogi glutationa, ki so po strukturi podobni glutationu in imajo enako antioksidativno funkcijo, ter 472 FARMAKOLOŠKE VEDE, FARMAKOGNOZIJA, FARMACIJA, TOKSIKOLOGIJA Zdrav Vestn | november – december 2022 | Letnik 91 | https://doi.org/10.6016/ZdravVestn.3358 nekatere molekule, ki zvišujejo raven GSH (29). Ven- dar njihova uporabnost, prav tako kot tudi učinkovitost intravenskega in intranazalnega dodajanja GSH na po- dročju zastrupitev s CO in zdravljenja s kisikom ni razi- skana in se jih pri zdravljenju zato ne uporablja. 5 Zaključek V raziskavi smo ugotovili, da akutna izpostavlje- nost CO/hipoksiji proži zgodnje procese celične smrti v nevronski in mešani celični kulturi. Oksidativni stres, ki ga povzroča CO, vpliva tudi na ravni glutationa v astrocitih. Zdravljenje celic s HBO učinkovito zmanj- šuje posledice delovanja CO v astrocitni in mešani kulturi, ne pa v nevronski celični kulturi. Nevroni, ki rastejo v odsotnosti astrocitov, so v primerjavi z meša- no kulturo dovzetnejši za škodljive učinke CO in HBO, kar nakazuje, da astrociti ob oksidativnem stresu po- skušajo ščititi nevrone, ki so pri sintezi glutationa, po- membnega antioksidanta, odvisni od njih. Izjava o navzkrižju interesov Avtorji nimamo navzkrižja interesov. Zahvala Zahvaljujemo se Laboratoriju za molekularno in ce- lično farmakologijo na Inštitutu za farmakologijo in ek- sperimentalno toksikologijo Medicinske fakultete Uni- verze v Ljubljani in Centru za klinično toksikologijo in farmakologijo Interne klinike Univerzitetnega klinič- nega centra v Ljubljani. Zahvaljujemo se tudi dr. Klari Bulc Rozman, univ. dipl. biol., z Inštituta za patološko fiziologijo Medicinske fakultete Univerze v Ljubljani za pripravo primarnih podganjih nevronskih in mešanih celičnih kultur. Raziskovalno delo je bilo financirano v sklopu programa (P3-0019). Uredniški komentar Članek je nastal na podlagi nagrajene študentske Prešernove raziskovalne naloge v letu 2020/2021. Literatura 1. Ernst A, Zibrak JD. Carbon monoxide poisoning. N Engl J Med. 1998;339(22):1603-8. DOI: 10.1056/NEJM199811263392206 PMID: 9828249 2. Brvar M, Šarc L, Jamšek M, Grenc D, Finderle Ž. Smernice zdravljenja zastrupitev z ogljikovim monoksidom. Zdrav Vestn. 2014;83(1):7-17. 3. Brvar M, Jamšek M, Možina M, Horvat M, Gorjup V. Epidemiološki pregled zastrupitev z ogljikovim monoksidom v Ljubljani od 1990 do 1999. Zdrav Vestn. 2002;71(2):87-90. 4. Roderique JD, Josef CS, Feldman MJ, Spiess BD. A modern literature review of carbon monoxide poisoning theories, therapies, and potentialtargets for therapy advancement. Toxicology. 2015;334:45-58. DOI: 10.1016/j.tox.2015.05.004 PMID: 25997893 5. Weaver LK. Clinical practice. Carbon monoxide poisoning. N Engl J Med. 2009;360(12):1217-25. DOI: 10.1056/NEJMcp0808891 PMID: 19297574 6. Smollin C, Olson K. Carbon monoxide poisoning (acute). Clin Evid. 2010;2010:2103. PMID: 21418677 7. Weaver LK, Hopkins RO, Chan KJ, Churchill S, Elliott CG, Clemmer TP, et al. Hyperbaric oxygen for acute carbon monoxide poisoning. N Engl J Med. 2002;347(14):1057-67. DOI: 10.1056/NEJMoa013121 PMID: 12362006 8. Verkhratsky A, Parpura V, Vardjan N, Zorec R. Physiology of Astroglia. Adv Exp Med Biol. 2019;1175:45-91. DOI: 10.1007/978-981-13-9913-8_3 PMID: 31583584 9. Escartin C, Galea E, Lakatos A, O’Callaghan JP, Petzold GC, Serrano- Pozo A, et al. Reactive astrocyte nomenclature, definitions, and future directions. Nat Neurosci. 2021;24(3):312-25. DOI: 10.1038/s41593-020- 00783-4 PMID: 33589835 10. Aoyama K. Glutathione in the Brain. Int J Mol Sci. 2021;22(9):5010. DOI: 10.3390/ijms22095010 PMID: 34065042 11. Iskusnykh IY, Zakharova AA, Pathak D. Glutathione in Brain Disorders and Aging. Molecules. 2022;27(1):324. DOI: 10.3390/molecules27010324 PMID: 35011559 12. McBean GJ. Cysteine, Glutathione, and Thiol Redox Balance in Astrocytes. Antioxidants. 2017;6(3):62. DOI: 10.3390/antiox6030062 PMID: 28771170 13. Ni G, Hu Z, Wang Z, Zhang M, Liu X, Yang G, Yan Z, Zhang Y. Cysteine Donor-Based Brain-Targeting Prodrug: Opportunities and Challenges. Oxid Med Cell Longev. 2022:4834117. eCollection 2022C. DOI: 10.1155/2022/4834117 PMID: 35251474/ 14. Loboda Č, Mlakar M. Optimizacija zdravljenja s kisikom pri zastrupitvah z ogljikovim monoksidom [Prešernova raziskovalna naloga]. Ljubljana: Loboda Č, Mlakar M. 2012. pp. 45-51. 15. Jurič DM, Finderle Ž, Šuput D, Brvar M. The effectiveness of oxygen therapy in carbon monoxide poisoning is pressure- andtime-dependent: a study on cultured astrocytes. Toxicol Lett. 2015;233(1):16-23. DOI: 10.1016/j.toxlet.2015.01.004 PMID: 25562542 16. Jurič DM, Šuput D, Brvar M. Hyperbaric oxygen preserves neurotrophic activity of carbon monoxide-exposed astrocytes. Toxicol Lett. 2016;253:1- 6. DOI: 10.1016/j.toxlet.2016.04.019 PMID: 27113706 17. Kekec L, Krajnc I. Zaščitna vloga astrocitov pri zastrupitvi z ogljikovim monoksidom in optimizacija zdravljenja [Prešernova raziskovalna naloga]. Ljubljana: Kekec L. Krajnc I. 2021;I:32-5. 18. Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of proteinutilizing the principle of protein- dye binding. Anal Biochem. 1976;72(1-2):248-54. DOI: 10.1016/0003- 2697(76)90527-3 PMID: 942051 19. Hara S, Kobayashi M, Kuriiwa F, Ikematsu K, Mizukami H. Hydroxyl radical production via NADPH oxidase in rat striatum due to carbon monoxidepoisoning. Toxicology. 2018;394:63-71. DOI: 10.1016/j. tox.2017.12.002 PMID: 29223502 20. Bonvento G, Bolaños JP. Astrocyte-neuron metabolic cooperation shapes brain activity. Cell Metab. 2021;33(8):1546-64. DOI: 10.1016/j. cmet.2021.07.006 PMID: 34348099 21. Wang P, Zeng T, Zhang CL, Gao XC, Liu Z, Xie KQ, et al. Lipid peroxidation was involved in the memory impairment of carbon monoxide- induceddelayed neuron damage. Neurochem Res. 2009;34(7):1293-8. DOI: 10.1007/s11064-008-9908-1 PMID: 19199032 473 IZVIRNI ZNANSTVENI ČLANEK Zaščitna vloga astrocitov pri zastrupitvi z ogljikovim monoksidom in optimizacija zdravljenja 22. Poljšak B, Šuput D, Milisav I. Achieving the balance between ROS and antioxidants: when to use the synthetic antioxidants. Oxid Med Cell Longev. 2013;2013:956792. DOI: 10.1155/2013/956792 PMID: 23738047 23. Daly S, Thorpe M, Rockswold S, Hubbard M, Bergman T, Samadani U, et al. Hyperbaric Oxygen Therapy in the Treatment of Acute Severe Traumatic Brain Injury:A Systematic Review. J Neurotrauma. 2018;35(4):623-9. DOI: 10.1089/neu.2017.5225 PMID: 29132229 24. Ahmadi F, Khalatbary AR. A review on the neuroprotective effects of hyperbaric oxygen therapy. Med Gas Res. 2021;11(2):72-82. DOI: 10.4103/2045-9912.311498 PMID: 33818447 25. Qi Y, Guo Z, Meng X, Lv Y, Pan S, Guo D. Effects of hyperbaric oxygen on NLRP3 inflammasome activation in the brain after carbonmonoxide poisoning. Undersea Hyperb Med. 2020;47(4):607-19. DOI: 10.22462/10.12.2020.10 PMID: 33227837 26. Kranich O, Hamprecht B, Dringen R. Different preferences in the utilization of amino acids for glutathione synthesisin cultured neurons and astroglial cells derived from rat brain. Neurosci Lett. 1996;219(3):211- 4. DOI: 10.1016/S0304-3940(96)13217-1 PMID: 8971817 27. Martinez-Banaclocha M. N-Acetyl-Cysteine: Modulating the Cysteine Redox Proteome in Neurodegenerative Diseases. Antioxidants. 2022;11(2):416. DOI: 10.3390/antiox11020416 PMID: 35204298 28. Asanuma M, Miyazaki I. Glutathione and Related Molecules in Parkinsonism. Int J Mol Sci. 2021;22(16):8689. DOI: 10.3390/ijms22168689 PMID: 34445395 29. Wu JH, Batist G. Glutathione and glutathione analogues; therapeutic potentials. Biochim Biophys Acta. 2013;1830(5):3350-3. DOI: 10.1016/j. bbagen.2012.11.016 PMID: 23201199