Matevž Skerget1, Luka Strniša2
Delež aktiviranih trombocitov pri bolnikih z idiopaticno trombocitopenicno purpuro brez zdravljenja in bolnikih, zdravljenih s splenektomijo
Proportion of Activated Platelets in Untreated and Splenectomized Patients with Idiopathic Thrombocytopenic Purpura
IZVLEČEK
KLJUČNE BESEDE: purpura trombocitopeniCna idiopatska-zdravljenje, splenektomija, trombocitna aktivacija
Izhodišča. Idiopatična trombocitopenična purpura (ITP) je avtoimuna bolezen s posledično majhnim številom trombocitov v periferni krvi. Krvavitve so kljub trombocitopeniji redkejše, kot bi pričakovali. Zanimal nas je delež aktiviranih trombocitov pri bolnikih z ITP brez zdravljenja in pri bolnikih z ITP v remisiji bolezni po odstranitvi vranice. Metode. Opazovali smo dve skupini bolnikov. V prvo smo vključili nezdravljene bolnike z ITP, v drugo pa bolnike v remisiji bolezni po odstranitvi vranice. Določili smo delež aktiviranih trombocitov za vsako skupino in ga primerjali s kontrolno skupino.
Rezultati. Pri nezdravljenih bolnikih z ITP smo ugotovili večji delež aktiviranih trombocitov -
kot pri kontrolni skupini (p = 0,0042). Pri skupini bolnikov z ITP v remisiji po splenektomi-ji nismo našli statistično pomembne razlike v deležu aktiviranih trombocitov. Zaključki. Bolniki z ITP, ki niso v remisiji in so brez zdravljenja, imajo v krvi v višjem odstotku prisotne aktivirane trombocite kot zdrava populacija, s čimer lahko pojasnimo manjšo pojavnost krvavitev kljub trombocitopeniji. Bolniki z ITP v remisiji po odstranitvi vranice imajo v krvnem obtoku prisotne aktivirane trombocite v istem deležu kot zdrava populacija, kar kaže na pomembno vlogo vranice v patogenezi ITP.
ABSTRACT_
KEY WORDS: purpura thrombocytopenic idiopathic-therapy, splenectomy, platelet activation
Background. Idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP) is an autoimmune disorder of blood haemostasis with thrombocytopenia. The incidence of bleeding in ITP patients is lower than may be predicted on the basis of the platelet count. The proportion of activated platelets in patients with untreated ITP and in splenectomized ITP patients in remission was evaluated. Methods. Two groups of ITP patients were chosen. The first included untreated ITP patients and the second consisted of splenectomized ITP patients in remission. The proportion of activated platelets was determined for each group and compared with the control group. Results. The untreated group had a significantly higher (p = 0.0042) proportion of activated platelets than the control group. The group of splenectomized patients in remission showed no significant difference in the proportion of activated platelets compared to the control group.
1	Matevž Skerget, dr. med., Klinični oddelek za hematologijo, Klinični center, Zaloška 7, 1525 Ljubljana.
2	Luka Strniša, Ellerjeva 39, 1000 Ljubljana.
Conclusions. ITP patients in remission and without therapy have a higher proportion of activated platelets than the healthy population, which could explain their low bleeding tendency. On the other hand, splenectomized ITP patients in remission have the same proportion of activated platelets in their blood as the healthy population and this emphasizes the primary importance of the spleen in ITP patients.
230
UVOD
Idiopatična trombocitopenična purpura (ITP) je avtoimuna bolezen s posledično majhnim številom trombocitov v periferni krvi (manj kot 140 x 109/L) in pomnoženim številom megakariocitov v kostnem mozgu (1). Za bolezen so značilna avtoprotitelesa, usmerjena zoper antigene na površini trombocitov (1-3). Za potrditev diagnoze je treba izključiti bolezni, ki povzročajo trombocitopenijo. Pojavnost ITP je 1 na 100.000 prebivalcev in v večini primerov poteka blago (1-4). Zdravimo jo samo pri znakih krvavitve ali pri izredno majhnih vrednostih trombocitov (manj kot 20 x 109/L do 30 x 109/L) (5).
Adhezija trombocita in številni drugi dejavniki povzročajo njegovo aktivacijo. Ob tem se spremeni oblika trombocita in oblika nekaterih na celični membrani ležečih recep-torjev. Iz znotrajceličnih zrnc trombocita se izločijo citokini (6-8). Aktivirani trombociti imajo zato zelo izraženo sposobnost adhezije in agregacije (4). Selektin P je glikoprotein, ki se ob trombocitni aktivaciji sprosti iz a-zrnc trombocitov in Weibel-Paladovega telesca endotelne celice. Pomemben je za adhezijo med trombociti, endotelnimi in vnetnimi celicami (9). GP IIb-IIIa je receptor za fibri-nogen, ki pri neaktiviranih trombocitih ni sposoben vezave fibrinogena. Ob aktivaciji trombocita se GP IIb-IIIa konformacijsko spremeni in pridobi vezavno mesto za fibrinogen. V nadaljnjem besedilu bomo konformacijsko spremenjeni GP IIb-IIIa imenovali aktivirani GP IIb-IIIa. Vezava fibrinogena na aktivirani GP IIb-IIIa spremeni tudi konformacijsko stanje fibrinogena, nastane aktivirani fibrinogen (10-12). Aktivirani trombociti imajo v nasprotju z neaktiviranimi na svoji membrani izražen selektin P in vezan aktivirani fibrinogen. Oba proteina lahko uporabljamo kot imunološka označevalca za aktivirane trombocite (13-16). Delež aktiviranih trombocitov tako predstavlja delež trombocitov
v krvnem obtoku, ki na svojih celičnih membranah izražajo selektin P ali aktivirani fibrinogen.
Pri ITP prihaja do tvorbe avtoprotiteles. Ob vezavi avtoprotiteles na membranske antigene trombocitov pride pri bolnikih z ITP do pospešenega odstranjevanja trombocitov iz krvnega obtoka (1-3). Avtoprotitelesa se lahko vežejo tudi na megakariocite in tako dodatno zmanjšajo tvorbo trombocitov (17,18). Vzroki za pojavljanje avtoprotiteles še niso pojasnjeni. Možen je neprimeren in iztirjen odgovor T-limfocitov pomagalk (Th-limfoci-ti) na antigene, ki so prisotni na telesu lastnih trombocitih (19-21). Opisana je tudi morebitna povezava med ITP in okužbo s Helicobacter pylori (22-25) ter humanim T-limfotropnim virusom tipa I (HTLV-1) (26). Pri 40% bolnikov z laboratorijskimi metodami ni možno zaznati protiteles proti trombocitom. V odstranjevanje trombocitov pri teh bolnikih je morda vključena celična imunost (27).
Odstranjevanje z avtoprotitelesi označenih trombocitov poteka v vranici (1, 2). Vranica tudi omogoča stik med trombociti, makrofagi, avtoreaktivnimi Th-limfociti in B-celicami limfocitne vrste. S tem vzdržuje in uravnava imunsko reaktivnost zoper trombocite. Tako vranica predstavlja osrednje mesto aktivacije avtoreaktivnih limfocitov T in B in tvorbe protiteles (28, 29). S splenektomijo odstranimo mesto fagocitoze trombocitov in osrednje mesto imunske reaktivnosti proti trombocitom. Pri bolnikih v remisiji po odstranitvi vranice so ugotovili z zdravo populacijo primerljiv titer avtoprotiteles. Pri bolnikih, neodzivnih na splenektomijo, je titer avtopro-titeles statistično pomembno večji (30).
Bolnike z ITP zdravimo ob znakih krvavitve in ob nizkih vrednostih trombocitov (manj kot 20-30 x 109/L). Število trombocitov pri posamezniku niha, tako je odločitev o začetku zdravljenja ob stabilni bolezni in enkratnem številu pod 20 x 109/L individualna. Zdravljenje začnemo s steroidi, ki jim ob
izredno nizkih vrednostih trombocitov s prisotnimi krvavitvami dodamo intravenske imunoglobuline (IVIG). Ob odsotnosti zadovoljivega odgovora in potrebi po visokih odmerkih steroidov se odločamo o splenektomiji. Ce standardni načini zdravljenja niso uspešni, uporabljamo rituximab. Med redkeje uporabljena zdravila sodijo zaviralci imunskega odgovora (ciklosporin, azathioprin), endoxan, vinca alkaloidi, interferon-alfa, danazol in druga zdravila. Pogosto jih uporabljamo v kombinaciji (3, 5).
METODE
Iz literature in naših lastnih izkušenj je razvidno, da so krvavitve pri bolnikih z ITP glede na nizke vrednosti števila trombocitov redke (6, 31, 32). Z opravljeno raziskavo smo določili delež aktiviranih trombocitov pri bolnikih z ITP, ki niso v remisiji in se ne zdravijo, in pri bolnikih z remisijo ITP po odstranitvi vranice.
V raziskavo je bilo vključenih 94 oseb, 37 bolnikov z ITP in 57 zdravih kontrol. Bolnike smo razdelili v dve skupini. V skupino ITP-70 smo vključili 20 bolnikov z ITP, 15 žensk in 5 moških, ki zadnje 3 mesece niso prejemali nobenih zdravil in pri katerih je bila vrednost trombocitov ob zadnjih treh kontrolnih pregledih največ 70 x 109/L. V skupino ITP-Splen smo vključili 17 bolnikov z ITP, 11 žensk in 6 moških, v remisiji bolezni po odstranjeni vranici. Pri tej skupini nismo omejili spodnje in zgornje vrednosti števila trombocitov. V kontrolno skupino (Kontr) smo vključili 57 zdravih prostovoljcev, darovalcev krvi na Zavodu Republike Slovenije za transfuzijo. Bolniki zadnje tri mesece niso smeli prejemati nobenih zdravil za ITP, zato bolniki z ITP, neodzivni na splenektomijo, ki pogosto potrebujejo zdravljenje, niso bili zajeti v vzorcu. Raziskava je bila opravljena v skladu s Helsinško deklaracijo in jo je odobrila komisija za medicinsko etiko dne 7. 10. 2003 (dopis št. 87/10/03).
Vsem preiskovancem smo odvzeli 5 ml venske krvi v epruveto s citratom (0,105 M) kot antikoagulantom. Cas od odvzema krvi do začetka laboratorijskega dela ni znašal več kot 30 minut. Vzorce smo analizirali v laboratoriju Kliničnega oddelka za hematologijo. Uporabili smo uveljavljeno metodo določanja
izražanja selektina P in aktiviranega fibrino-gena na membranah trombocitov (33).
Kot reagente smo uporabili fiziološko raztopino z dodatkom pufra (PFR), enoodstotni goveji serumski albumin (BSA), piščančja protitelesa proti selektinu P (angl. anti-human P-selectin-FITC WAK-FA-PSFITC-2, WAK Chemie, Bad Soden, Nem~ija), piščančja protitelesa proti aktiviranemu fibrinogenu (angl. anti human fibrinogen WAK-FA-AFFITC-2, WAK Chemie, Bad Soden, Nemčija), izotipsko kontrolo za protitelesa proti selektinu P - piščančji IgY-FITC (WAK Chemie, Bad Soden, Nem~ija). Uporabili smo pretočni citometer Coulter Epics XL-MCL. Pretočni citometer omogoča prepoznavanje celičnih označevalcev na površini celic. V ta namen uporabljamo mono-klonska protitelesa, označena s fluorokromi, ki po osvetlitvi z laserjem oddajajo svetlobo druge valovne dolžine, kar omogoča njihovo prepoznavo v pretočnem citometru. Mono-klonska protitelesa so specifična za določen označevalec na površini celice. V naši raziskavi smo tako beležili prisotnost selektina P in aktiviranega fibrinogena.
Statistično oceno smo opravili z namenom ovrednotiti razlike v deležih izraženega selektina P in aktiviranega fibrinogena na membranah trombocitov pri različnih vzorcih. Izbrali smo dvosmerni parametrični preizkus domneve o razliki med povprečjema dveh majhnih neodvisnih vzorcev. V ta namen smo uporabili Studentov t-test za primerjavo povprečij dveh neodvisnih vzorcev. Privzeli smo neenake variance. Statistične spremenljivke so bili deleži selektina P (P-sel) in deleži aktiviranega fibrinogena (A-fib) na trombocitnih membranah pri skupinah ITP-70, ITP-Splen in Kontr.
REZULTATI
Število trombocitov pri skupini ITP-70 se je gibalo v razponu od 4 x 109/L do 66 x 109/L z aritmetično sredino 37 x 109/L. Bolniki so bili brez znakov krvavitve. Pri skupini ITP-Splen je bil razpon števila trombocitov od 119x109/L do 453 x 109/L z aritmetično sredino 301 x 109/L, pri skupini Kontr pa od 141x109/L do 333 x 109/L z aritmetično sredino 225 x 109/L.
Primerjavo povprečnih vrednosti med različnimi skupinami in njihovo statistično
231
M. SKERGET, L. STRNIŠA DELEŽ AKTIVIRANIH TROMBOCITOV PRI BOLNIKIH... MED RAZGL 2007; 46 Tabela 1: Primerjave povprečnih vrednosti dveh neodvisnih kontinuiranih spremenljivk st-testi. Enakost varianc med vzorci ni privzeta.
Spremenljivka Primerjava vzorcev p (dvosmerno) Povprečno Standardno napako 95 % interval zaupanja razlike
razlika	razlike
Spodnji	Zgornji
P-selektin
ITP-70 in Kontr	0,6980	-0,2534	0,6454	-1,5853	1,0785
ITP-Splen in Kontr	0,5737	-0,2914	0,5106	-1,3464	0,7637
ITP-Splen in ITP-70	0,9606	0,0379	0,7624	-1,5117	1,5875
ITP-70 in Kontr	0,0042	8,8459	2,7680	3,1028	14,5891
ITP-Splen in Kontr	0,7371	-0,5987	1,7614	-4,2441	3,0468
ITP-Splen in ITP-70	0,0050	9,4446	3,1187	3,0796	15,8096
232
pomembnost podaja tabela 1. Pri skupini ITP-70 smo ugotovili statistično pomemben višji delež trombocitov (p = 0,0042), ki na svoje membrane vežejo aktivirani fibrinogen, kot pri kontrolni populaciji (Kontr). Statistično pomembne razlike v izražanju selektina P med skupinama ITP-70 in Kontr nismo dokazali (p = 0,6980). Za skupino ITP-Splen ni statistično pomembne razlike v deležu aktiviranega fibrinogena (p = 0,7371) in selektina P (p = 0,5737) na membranah trombocitov glede na kontrolno populacijo (Kontr). Med skupino ITP-70 in ITP-Splen je statistična analiza odkrila statistično visoko pomembno razliko v izražanju aktiviranega fibrinogena (p = 0,005). Med tema vzorcema ni statistično pomembne razlike v izražanju selektina P (p = 0,9606).
RAZPRAVLJANJE
Aktivirani fibrinogen je prisoten na večjem deležu trombocitov skupine ITP-70 kot Kontr. Aktivirani fibrinogen nastane iz fibrinoge-na, ko se ta veže na aktivirani kompleks GP IIb-IIIa. Tako govorimo o trombocitih, ki imajo v večjem deležu izražen aktivirani GP IIb-IIIa (11,12, 34, 35). Med ITP-70 in Kontr ni statistično pomembne razlike v izraženem deležu selektina P. Glede na večji delež aktiviranega GP IIb-IIIa pri ITP-70 lahko sklepamo na večji delež aktiviranih trombocitov pri tej skupini. Dobljeni rezultati za selektin P tega sklepanja ne dopuščajo.
Na kratko se bomo dotaknili verjetnih razlogov za dobljeno razliko med označevalcema trombocitne aktivacije. Odvzem vzorcev krvi pri obeh skupinah ni popolnoma enak. Kri bolnikov je odvzeta s tanjšo iglo kot kri kon-
trolne skupine. V literaturi navajajo, da je za sprožitev maksimalne aktivacije GP IIb-IIIa potreben 7-krat manjši dražljaj kot za sprožitev maksimalnega izražanja selektina P (14). Tako bi lahko tanjša igla pri odvzemu krvi povzročila večje izražanje aktiviranega GP IIb-IIIa pri skupini ITP-70. V tem primeru pa bi morali tudi pri skupini ITP-Splen ugotoviti večje izražanje aktiviranega GP IIb-IIIa, kar pa ni bil slučaj. Raziskava namreč ni pokazala statistično pomembne razlike v izražanju aktiviranega GP IIb-IIIa med ITP-Splen in kontrolno populacijo. Dodatno obstaja statistično pomembna razlika v izražanju GP IIb-IIIa med skupinama bolnikov ITP-70 in ITP-Splen, zato menimo, da različen odvzem vzorcev krvi ni vplival na večje izražanje aktiviranega GP IIb-IIIa pri skupini ITP-70 glede na kontrolno populacijo.
Razlog za neznačilne rezultate, upoštevajoč selektin P, lahko iščemo v spontani degranu-laciji trombocitov zaradi fizikalnih dejavnikov. Ti vplivajo na trombocite med odvzemom in pripravo vzorca. Tako bi lahko prišlo do navidezno večjega izražanja selektina P na površini trombocitov invitro (13, 36). Trombociti kontrolne skupine bi se lahko aktivirali po odvzemu in tako statistična primerjava s trombociti bolnikov ITP-70 ne bi pokazala statistično pomembne razlike med vzorci. Nenavadno pa je, da bi se pri kontroli po odvzemu izrazil le selektin P in ne aktivirani GP IIb-IIIa, še posebej če upoštevamo že prej omenjeno večjo odzivnost GP IIb-IIIa na aktivacijske dražljaje (15). Nazadnje lahko razliko med označevalcema trombocitne akti-vacije selektinom P in GP IIb-IIIa poskušamo razložiti z reinternalizacijo selektina P z membran aktiviranih trombocitov. Kmalu po akti-
vaciji se začne ponoven premik na membrane trombocitov vezanega selektina P v notranjost trombocita. Po dveh urah postane 95 % sprva selektin P pozitivnih trombocitov ponovno selektin P negativnih. Aktivirani GP IIb-IIIa ostane prisoten na površini trombocitov. Ti trombociti se kljub izgubi selektina P s svojih membran v krvnem obtoku obnašajo kot aktivirani trombociti (37). S to razlago lahko pojasnimo razliko v rezultatih, dobljenih z obema označevalcema trombocitne aktivacije, selektinom P in aktiviranim GP IIb-IIIa.
Glede na omenjeno izražanje označevalcev trombocitne aktivacije lahko zaključimo, da imajo bolniki z ITP, ki niso v remisiji bolezni, v krvnem obtoku statistično pomembno večji delež aktiviranih trombocitov kot kontrolna populacija. Večji delež aktiviranih trombocitov pri bolnikih z ITP razloži redkejše krvavitve, kot bi pričakovali, upoštevajoč znižano število trombocitov. Ker imajo zdravila, uporabljana pri zdravljenju ITP, pogoste in neželene stranske učinke, jih ob odsotno-
sti krvavitev uporabljamo z zadržkom. Naša raziskava z dobljenimi rezultati upravičuje konzervativni pristop k zdravljenju. Označevalec trombocitne aktivacije GP IIb-IIIa se je v naši raziskavi izkazal primernejši kot selek-tin P.
Dobljeni rezultati niso pokazali statistično pomembne razlike v izražanju aktiviranega GP IIb-IIIa in selektina P med bolniki z ITP v remisiji po odstranitvi vranice in kontrolno skupino. Pri bolnikih, odzivnih na splenekto-mijo, se ne normalizira le število trombocitov, temveč tudi delež aktiviranih trombocitov. Možno je, da predstavlja splenektomija tudi vzročno in ne samo simptomatsko zdravljenje. Prekine se namreč krog stika trombocitov, makrofagov, avtoreaktivnih Th-limfocitov in B-celic limfocitne vrste, kar poganja avtoi-muno dogajanje. Merjenje deleža aktiviranih trombocitov ne sodi v klinično prakso. Potrebne bodo dodatne raziskave, ki bodo pokazale pomen tovrstnih preiskav v celoviti obravnavi bolnikov z ITP in njihovo mesto pri izbiri zdravljenja.
LITERATURA	233
1.	Karpatkin S. Autoimmune (idiopathic) thrombocytopenic purpura. Lancet 1997; 349: 1531-6.
2.	Cines DB, McMillan R. Pathogenesis of chronic immune thrombocytopenic purpura. Curr Opin Hematol 2007; 14: 511-4.
3.	Psaila B, Bussel JB. Immune thrombocytopenic purpura. Hematol Oncol Clin North Am 2007; 21: 743-59.
4.	George JN. Platelets. Lancet 2000; 355: 1531-9.
5.	Stasi R, Provan D. Management of immune thrombocytopenic purpura in adults. Mayo Clin Proc 2004; 79: 504-22.
6.	Rand ML, Dean JA. Platelet function in autoimmune (idiopathic) thrombocytopenic purpura. Acta Paediatr 1998; 87 Suppl. 424: 57-60.
7.	Chong BH, Murray B, Berndt MC, et al. Plasma P-Selectin is increased in thrombotic consumptive platelet disorders. Blood 1994; 83: 1535-41.
8.	Rinder HM, Snyder EL. Activation of platelet concentrate during preparation and storage. Blood Cells 1992; 18: 445-56.
9.	Merten M, Thiagarajan P. P-Selectin Expression on Platelets Determines Size and Stability of Platelet Aggregates. Circulation 2000; 102: 1931.
10.	Ginsberg MH, Frelinger AL, Lam SC, et al. Analysis of platelet aggregation disorders based on flow cytometric analysis of membrane glycoprotein IIb-IIIa with conformation-specific monoclonal antibodies. Blood 1990; 76: 2017-23.
11.	Zamarron C, Ginsberg MH, Plow EF. Monoclonal antibodies specific for a conformationally altered state of fibrinogen. Thromb Haemost 1990; 64: 41.
12.	Michelson AD. Flow cytometry: a clinical test of platelet function. Blood 1996; 87: 4925-36.
13.	Rinder HM, Snyder EL. Activation of platelet concentrate during preparation and storage. Blood Cells 1992; 18: 445-56.
14.	Devine DV. Novel markers for the detection of platelet activation. Transfus Med Rev 1990; 4: 115-20.
15.	Ruf A, Patscheke H. Flow cytometric detection of activated platelets: comparison of determining shape change, fibrinogen binding, and P-selectin expression. Semin Thromb Hemost 1995; 21: 146-51.
16.	Griesshammer M, Beneke H, Nussbaumer B. Increased platelet surface expression of P-selectin and thrombos-pondin as markers of platelet activation in essential thrombocythaemia. Thromb Res 1999; 96: 191-6.
17.	Chang M, Nakagawa PA, Williams SA, et al. Immune thrombocytopenic purpura (ITP) plasma and purified ITP monoclonal autoantibodies inhibit megakaryocytopoiesis in vitro. Blood 2003; 102: 887-95.
18.	McMillan R, Wang L, Tomer A, et al. Suppression of in vitro megakaryocyte production by antiplatelet autoantibodies from adult patients with chronic ITP. Blood 2004; 103: 1364-9.
19.	Stasi R, Del Poeta G, Stipa E et all. Response to B-cell depleting therapy with rituximab reverts the abnormalities of T-cell subsets in patients with idiopathic thrombocytopenic purpura. Blood. 2007; 110: 2924-30.
20.	Semple JW. Pathogenic T-cell responses in patients with autoimmune thrombocytopenic purpura. J Pediatr Hema-tol Oncol 2003; 25 Suppl1: S11-3.
21.	Andersson J. Cytokines in idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP). Acta Paediatr 1998; 87Suppl 424: 61-4.
22.	Veneri D, Franchini M, Gottardi M et al. Efficacy of Helicobacter pylori eradication in raising platelet count in adult patients with idiopathic thrombocytopenic purpura. Haematologica 2002; 87: 1177-9.
23.	Kurtoglu E, Kayacetin E, Ugur A. Helicobacter pylori infection in patients with autoimmune thrombocytope-nic purpura. World J Gastroenterol 2004; 10: 2113-5.
24.	Franchini M, Veneri D. Helicobacter pylori infection and immune thrombocytopenic purpura: an update. Helicobacter 2004; 9: 342-6.
25.	Franchini M, Veneri D. Helicobacter pylori-associated immune thrombocytopenia. Platelets 2006; 17: 71-7.
26.	Matsushita K, Ozaki A, Arima N, et al. Human T-lymphotropic virus type I infection and idiopathic thrombocy-topnic purpura. Hematology 2005; 10: 95-9.
27.	Zhang F, Chu X, Wang L et all. Cell-mediated lysis of autologous platelets in chronic idiopathic thrombocyto-penic purpura. Eur J Haematol 2006; 76: 427-31.
28.	Kuwana M, Okazaki Y, Kaburaki J, et al. Spleen is a primary site for activation of platelet-reactive T and B cells in patients with immune thrombocytopenic purpura. J Immunol 2002; 168: 3675-82.
29.	Kuwana M, Ikeda Y. The role of autoreactive T-cells in the pathogenesis of idiopathic thrombocytopenic purpura. Int J Hematol 2005; 81: 106-12.
30.	Mazzucconi MG, Arista MC, Peraino M, et al. Long-term follow-up of autoimmune thrombocytopenic purpura (ATP) patients submitted to splenectomy. Eur J Haematol 1999; 62: 219-22.
31.	Hollopeter G, Jantzen HM, Vincent D, et al. Identification of the platelet ADP receptor targeted by antithrom-botic drugs. Nature 2001; 409: 145-7.
32.	Haznedaroglu IC, Büyükascedilinodotk Y, Koscedilar A et all. Selectins and IL-6 during the Clinical Course of Idiopathic Thrombocytopenic Purpura. Acta Haematol 1999; 101: 16-20.
33.	Zver S, Zontar D. Določitev števila aktiviranih trombocitov s protitelesi za aktivirani fibrinogen in selektin P 234 pri bolnikih z esencialno trombocitopenijo in vpliv antiagregacijskih zdravil. Zdrav Vestn 2004; 73 Suppl I: 127-34.
34.	Faraday N, Goldschmidt-Clermont P, Dise K, et al. Quantitation of soluble fibrinogen binding to platelets by fluorescence-activated flow cytometry. J Lab Clin Med 1994; 123: 728-40.
35.	Heilmann E, Hynes LA, Burstein SA, et al. Fluorescein derivatization of fibrinogen for flow cytometric analysis of fibrinogen binding to platelets. Cytometry 1994; 17: 287-93.
36.	Wang C, Mody M, Herst R, et al. Flow cytometric analysis of platelet function in stored platelet concentrates. Transfus Sci 1999; 20: 129-39.
37.	Michelson AD, Barnard MR, Hechtman HB, et al. In vivo tracking of platelets: circulating degranulated platelets rapidly lose surface P-selectin but continue to circulate and function. Proc Natl Acad Sci U S A 1996; 93: 11877-82.
Prispelo 24. 7. 2007