Pomen okužbe s humanimi virusi papiloma v etiopatogenezi epitelijskih novotvorb grla in požiralnika The role of human papillomavirus infection in etiology and pathogenesis of laryngeal and esophageal epithelial neoplasms
Mario Poljak*, Nina Gale**, Vinko Kambič***, Anton Cerar****, Katja Seme*****
Deskriptorji
grlo novotvorbe - etlologlla požiralnik novotvorbe - etlologlja papllomavlrus humani
Izvleček. Pomembno vlogo pri nastanku jn razvoju benlgnlh ln mallgnlh epltelljsklh novotvorb spolovll ln rodll, zlastl ploščatocellčnega karcl-noma maternlčnega vratu, prlplsujejo okužbl z razllčnlml tlpl humanlh vlrusov paplloma. Manj je razlskana etlološka povezava med okužbo s humanlml vlrusl paplloma ln nastankom podob-nlh bolezensklh sprememb ploščatocellčnega epltellja vdruglh organlh ln organsklh slstemlh. V našlh štlrlletnlh razlskavah, kl smo jlh usme-rlll predvsem na ploščatocellčne papllome ln kar-clnome grla ln požlralnlka ter epltelljske hlper-plastlčne spremembe sluznlce grla s kllnlčno sll-ko kronlčnega larlngltlsa, smo poskušall odgo-vorltl na nekatera pomembna vprašanja o pomenu okužbe s humanlml vlrusl paplloma v etlo-patogenezl teh novotvorb. V prispevku predstavljamo naše dosedanje razlskave na tem področju ter nekatera novejša dognanja o po-vezavl med okužbo s humanlml vlrusl paplloma ter vznlkom ln razvojem določenlh novotvorb grla ln požlralnlka.
Descriptors
laryngeal neoplasms-etiology esophageal neoplasms-etiology papillomavirus human
Abstract. Infection with certain types of human papillomaviruses is intimately linked with benign and malignant squamous epithelial cell lesions of the lower genital tract in both sexes. This relationship can be appreciated at many levels, as demonstrated by a wealth of molecular, experimental, morphological and clinical data. Despite extensive research, the role of human papillomavirus infection in the etiology of similar epithelial lesions of the upper part of the respiratory and digestive tract remains obscure. The purpose of the present review is to summarize the present knowledge of human papillomavirus infection and epithelial neoplasms of the larynx and esophagus, and to briefly present the results of human papillomavirus studies done in Slovenia.
Uvod
Humani virusi papiloma (HPV) so drobni DNA-virusi, ki jih taksonomsko uvrščamo v družino Papovaviridae, rod Papillomavirus (1). HPV dodatno razvrščamo v različne virusne tipe glede na skladnost nukleotidnih zaporedij. Do sedaj je odkritih že več kot 70 tipov HPV in njihovo število še vedno narašča (1). Po nedavnem sklepu Mednarodne komisije za nomenklaturo virusov papiloma vsak na novo osamljeni HPV, ki kaže več kot 10 % neskladnost nukleotidnega zaporedja z že znanimi tipi virusa v področjih E6, E7
*Aslst.dr.sc. Marlo Poljak, dr. med., Inštltut za mlkroblologljo, Medlclnska fakulteta Unlverze v Ljubljanl, Korytkova 2, 61105 Ljubljana.
**Prof. dr. sc. Nlna Gale, dr. med., Inštltut za patologljo, Medlclnska fakulteta Unlverze v Ljubljanl, Korytkova 2, 61105 Ljubljana.
***Akad. prof. dr. sc. Vlnko Kamblč, dr. med., Slovenska akademlja znanostl ln umetnostl, Novl trg 3, 61100 Ljubljana.
****Doc. dr. sc. Anton Cerar, dr. med., Inštltut za patologljo, Medlclnska fakulteta Unlverze v Ljubljanl, Korytkova 2, 61105 Ljubljana.
*****Aslst. mag.sc. Katja Seme, dr. med., Inštltut za mlkroblologljo, Medlclnska fakulteta Unlverze v Ljubljanl, Korytkova 2, 61105 Ljubljana.
in L1, dobi novo oznako (številko). Če je neskladnost med 2 in 10%, je to virusni pod-tip, kadar pa je neskladnost manjša kot 2%, opredelimo novo osamljeni virus kot različico enakega tipa (1). To pomeni, da so virusni tipi oštevilčeni popolnoma slučajno - po vrstnem redu osamitve in ne po bioloških lastnostih virusov ali njihovi genomski sorodnosti. Verjetno bo z napredovanjem znanja razvrščanje HPV poenostavljeno.
Kmalu po odkritju HPV so začeli posamezne bolezenske spremembe ploščatocelične-ga epitelija v genitalnem traktu etiološko povezovati z okužbo z določenimi tipi HPV. Dokaz te tesne povezave je skupna ugotovitev številnih viroloških, molekularnih, patomor-foloških, epidemioloških in kliničnih raziskav (2). Povezava med okužbo z določenimi tipi HPV in nastankom nekaterih sprememb ploščatoceličnega epitelija v genitalnem traktu, zlasti ploščatoceličnega karcinoma materničnega vratu, je danes tako očitna, da v nekaterih delih sveta zgodnje odkrivanje in tipizacija HPV zavzema osrednjo vlogo v načrtovanju zmanjšanja incidence teh novotvorb (3). Domneva, da imajo nekateri tipi HPV večji vpliv na vznik in razvoj samo določenih vrst novotvorb, je narekovala delitev HPV, ki jih najdemo v genitalnem traktu v tri skupine: nizkorizični (tipi 6, 11, 42-44), mejno rizični (tipi 31, 33, 35, 51, 52, 58) in visokorizični HPV (tipi 16, 18, 45, 56). Okužbo z niz-korizičnimi tipi HPV povezujemo predvsem z vznikom in razvojem benignih novotvorb ploščatoceličnega epitelija, nasprotno pa okužbo z visokorizičnimi tipi etiološko povezujemo z intraepitelijsko neoplazijo najvišje stopnje in malignimi ploščatoceličnimi tumorji genitalnega trakta. Tako sta bila nizkorizična tipa HPV 6 in 11 odkrita v 85-100% genitalnih kondilomov in 25-55% intraepitelijskih neoplazij materničnega vratu nižje stopnje (CIN I, CIN II) (3, 4). Visokorizična tipa 16 in 18 so odkrili predvsem v intraepitelij-ski neoplaziji najvišje stopnje (CIN III) in v ploščatoceličnem karcinomu materničnega vratu. V teh spremembah so ugotovili okužbo z omenjenima tipoma HPV v 60-80% (3,4). Podobno razporeditev nizko- in visokorizičnih tipov HPV najdemo tudi v benignih in malignih novotvorbah zunanjega spolovila pri moških, vendar je pogostost okužbe nekoliko nižja (3). Vloga mejno rizičnih tipov HPV v etiologiji novotvorb spolovil in rodil še ni dokončno opredeljena.
Zaradi histomorfološke podobnosti novotvorb spolovil in rodil z enakimi spremembami ploščatoceličnega epitelija v drugih organih ali organskih sistemih so številne raziskovalne skupine v zadnjem času usmerile svoje raziskave tudi v ugotavljanje etiopatoge-netske povezave med okužbo s HPV in nastankom drugih epitelijskih novotvorb pri človeku.
V štiriletnih raziskavah, ki jih predstavljamo v tem prispevku, smo poskušali odgovoriti na nekatera aktualna vprašanja o pomenu okužbe s HPV v etiopatogenezi določenih novotvorb in epitelijskih sprememb grla in požiralnika. Raziskave smo usmerili predvsem na ploščatocelične papilome in karcinome grla in požiralnika ter epitelijske hiperplastič-ne spremembe sluznice grla s klinično sliko kroničnega laringitisa (2, 5-16).
Retrospektivna študija, ki je bila zasnovana na našem obsežnem biopsijskem materialu, nam je omogočila preverjanje zastavljenih domnev na velikem številu tkivnih vzorcev. Za dokazovanje okužbe s HPV in opredeljevanje posameznih tipov virusov smo uporabili trenutno najbolj občutljivi in specifični molekularni metodi: in situ hibridizacijo in
verižno reakcijo s polimerazo. Ker sta obe metodi dokaj zahtevni, smo po priporočilu več avtorjev pred začetkom raziskave pazljivo optimizirali vse pomembnejše reakcijske pogoje (17). Natančno optimizacijo smo izvedli na kliničnih vzorcih bolnikov, pri katerih smo po kliničnih in histopatoloških ali citoloških ocenah predvidevali veliko možnost okužbe s HPV (koničasti kondilomi penisa, ploščatocelični karcinomi materničnega vratu).
V	procesu uvajanja teh metod smo razvili tudi nekaj pomembnih tehničnih izboljšav predhodno opisanih postopkov za dokazovanje HPV in novo metodo za tipizacijo teh virusov (9, 10, 14).
Hibridizacija in situ
Hibridizacija in situ (ISH) je edina izmed metod molekularne virologije, pri kateri se postopek denaturacije in hibridizacije nukleinskih kislin odvija v okuženih celicah (in situ) in ne na najlonskih ali nitroceluloznih membranah (6). Uporabljamo jo predvsem za dokazovanje navzočnosti mikroorganizmov v citoloških vzorcih ali na tkivnih rezinah in za ugotavljanje lege določenih m-RNA. Tkivo je lahko sveže zmrznjeno, fiksirano v forma-linu ali kakšnem drugem fiksativu pod pogoji, ki veljajo za vse imunohistokemične preiskave (6).
V	naših raziskavah smo ISH izvajali z uporabo z biotinom označenih DNA-sond (kratki označeni komplementarni deli nukleinske kisline), značilnih za HPV-tipe 6/11, 16/18 in 31/33/51, in s komercialno dostopnim diagnostičnim kompletom (PathoGene in situ human papillomavirus hybridisation kit, ENZO Diagnostic Inc., New York, ZDA) po navodilih proizvajalca, z manjšimi spremembami (7, 12). Po vezavi sonde na komplementarni del virusne DNA smo biotin prikazali z uporabo visokospecifičnega avidina, označenega z encimom hrenova peroksidaza. Po dodatku substrata so se jedra epitelnih celic, ki so vsebovala HPV DNA, obarvala rjavo.
Največje težave pri uvajanju ISH smo imeli pri fiksaciji tkivnih rezin na objektna stekel-ca. V začetku raziskave smo za ta namen uporabljali poli-L-lizin (Sigma Chemical Co., St. Louis, ZDA). Čeprav je to klasičen adheziv za imunohistokemične raziskave, so se tkivne rezine pri našem delu slabo pritrjevale na objektna stekelca in so pri prvem spiranju po hibridizaciji največkrat odpadle. Kasneje smo poli-L-lizin zamenjali s 3-amino-propil-trietoksil silanom (Sigma Chemical Co., St. Louis, ZDA in se tako izognili prejšnjim težavam.
Verižna reakcija s polimerazo
Verižna reakcija s polimerazo (PCR) je trenutno najobčutljivejša metoda molekularne mikrobiologije (18). Dokazovanje mikroorganizmov s PCR temelji na in vitro pomnože-vanju za določen mikroorganizem specifičnega, majhnega odseka njegovega dednega materiala (največkrat od 100 do 1000 baznih parov) z encimom termostabilna polime-raza DNA. Z več različicami metode je mogoče določeni odsek tarčne DNA ali RNA v nekaj urah pomnožiti do več kot milijonkrat. Na ta način dobimo zadostno količino nukleinske kisline za nadaljnje molekularne analize, s katerimi končno potrdimo specifičnost pomnoženega genomskega odseka (18).
Ker začetni oligonukleotidi izbirajo odsek genoma, ki bo v reakciji pomnožen, je pravilen izbor le-teh najbolj pomemben korak optimizacije PCR. V želji, da v eni sami reakciji PCR zajamemo čim več v patologiji človeka pomembnih tipov HPV, smo se odločili, da v naših raziskavah za pomnoževanje uporabljamo t. i. grupno specifične začetne oligonu-kleotide. Ti so izbrani tako, da so skladni s področji genoma, ki so enaki pri večini tipov HPV. V dostopni literaturi je do sedaj opisanih 8 parov bolj ali manj učinkovitih grupno specifičnih začetnih oligonukleotidov HPV (16). Pred začetkom raziskav smo se odločili preizkušati dva para takšnih začetnih oligonukleotidov, in sicer GP5/GP6 ter MY09/MY11, med katerima je slednji komercialno dostopen. Oba omenjena para začetnih oligonukleotidov, izbrana v zelo ohranjenem področju ORF L1, sta se namreč izkazala kot zelo uporabna za dokazovanje okužbe s HPV v številnih predhodnih raziskavah v različnih delih sveta (19, 20). Tudi v naših razmerah sta oba para HPV grupno specifičnih začetnih oligonukleotidov pokazala približno enako učinkovitost v dokazovanju različnih tipov HPV. PCR-pridelek MY09/MY11 je zaradi svoje velikosti in razvitih ustreznih tipizacijskih metod veliko bolj uporaben za tipizacijo HPV kot PCR-pridelek GP5/GP6, zato smo se v nadaljnjih raziskavah odločili predvsem za uporabo para začetnih oligonukleotidov MY09/MY11.
Za dokazovanje specifičnosti PCR-pridelkov, nastalih s pomnoževanjem 450 baznih parov dolgega dela ORF L1 s parom grupno specifičnih začetnih oligonukleotidov MY09/MY11, in istočasto določanje tipov HPV smo uporabljali nedavno razvito metodo encimske razgradnje PCR-pridelkov (19). Specifičnost PCR-pridelka potrdimo, če ga uporabljeni re-strikcijski encimi razgradijo na delce, ki tako po velikosti kot tudi po številu ustrezajo predhodno teoretično določenemu vzorcu razgradnje. Razlikovanje tipov HPV temelji na različnih vzorcih razgradnje pomnoženega dela genoma HPV. Po dostopnih podatkih poznamo več kot 50 različnih vzorcev razgradnje PCR-pridelka MY09/MY11, od katerih je vsak povezan z določenim tipom oziroma podtipom HPV (19). V želji, da bi natančno opredelili čim več tipov HPV, smo metodo izvajali z uporabo sedmih različnih restrikcij-skih endonukleaz: BamH I, Dde I, Hae III, Hinf I, Pst I, Rsa I in Sau 3A I (Gibco-BRL, Bethesda, ZDA). V nekaterih primerih smo za tipizacijo PCR-pridelka MY09/MY11 uporabljali še encimsko oligonukleotidni test, ki smo ga razvili v našem laboratoriju (14).
Kljub uporabi učinkovitih postopkov ekstrakcije in izolacije DNA je treba zaradi vpliva številnih znanih in neznanih dejavnikov, ki lahko privedejo do inhibicije delovanja kompleksnega encimskega »ustroja« za pomnoževanje in posledičnega lažno negativnega rezultata reakcije PCR, vedno izvesti tudi t. i. notranje kontrolno pomnoževanje (17). Notranje kontrolno pomnoževanje je pomnoževanje delov vseprisotnih humanih genov (beta-globin, beta-aktin, deli HLA-genov) hkrati starčnim delom DNA HPV. Uspešno pomnoževanje notranje kontrole pomeni, da v vzorcu ni zaviralcev PCR. V primeru, da do pomnoževanja notranje kontrole ne pride, dobljenega rezultata HPV-PCR ne moremo opredeliti. Zato smo v naših raziskavah vsak vzorec ekstrahirane in/ali izolirane DNA pred začetkom dokazovanja okužbe s HPV testirali s PCR z začetnimi oligonukleotidi, specifičnimi za delce beta-globinskega ali beta-aktinskega gena (7, 12).
V naše delo smo za zmanjšanje možnosti lažno pozitivnih rezultatov PCR poleg nespecifičnih postopkov uvedli trenutno najboljši, specifični postopek, t. i. encimski N-uracil glikozilazni postopek (21). Pri tem postopku v reakcijski mešanici dTTP zamenjamo z dUTP,
kar privede do nastanka PCR-pridelkov, ki vsebujejo za DNA nenaravno nukleotidno bazo uracil. Na ta način lahko razlikujemo PCR-pridelke tarčnega dela DNA, ki vsebujejo uracil in predstavljajo možne vire kontaminacije, od izhodnega tarčnega dela vzorčne DNA, ki vsebuje timin. Če pred reakcijo PCR dodamo N-uracil glikozilazo (encim, ki razgrajuje nukleinske kisline, ki vsebujejo nukleotidno bazo uracil), bo ta v primeru kontaminacije uničila PCR-pridelke predhodnih reakcij (ker ti vsebujejo uracil), ne pa tarčne DNA, in na ta način preprečila nastanek lažno pozitivnega rezultata. Opisani postopek se je tudi pri našem delu izkazal kot zelo učinkovit (11).
Ploščatocelični papilomi grla in humani virusi papiloma
Med benignimi vzbrstmi sluznice grla je najpogostejši ploščatocelični papilom. Papilom je krhek, resičast ali cvetačast, bledo rožnat ali rdečkast tumor, velikosti 1-10 mm. Lahko vznikne kjerkoli na sluznici grla, najpogosteje na prostem robu glasilk in v sprednji komisuri. Pri otrocih lahko prekriva vso sluznico grla. Histološko je papilom grajen iz resičaste vezivnožil-ne strome, ki jo odeva večplasten, včasih poroženevajoč ploščatocelični epitelij (13,22).
Klinična znamenja papilomov grla so odvisna od velikosti in lokalizacije sprememb. Papilomi na prostem robu glasilk povzročajo močno hripavost, medtem ko pri tistih, ki niso na glasilkah, tega bolezenska znamenja ni. Dihanje je ovirano le pri večjih novotvorbah, ki pomembno zožujejo svetlino grla. Incidenca spontane maligne preobrazbe papilomov grla je približno 1-2% (v Sloveniji 0,8%) in v izbranih skupinah, zdravljenih z obsevanjem, doseže tudi 10% (13). Čeprav so ploščatocelični karcinomi, ki so nastali z maligno preobrazbo papilomov grla, histološko večinoma dobro diferencirani, so navadno zelo agresivni in povezani s slabo napovedjo (13).
Zdravljenje papilomov grla je najpogosteje kirurško, z endoskopsko-mikrolaringoskop-sko ali lasersko odstranitvijo. Redkeje pri zdravljenju uporabljamo različna zdravila, kot so kemoterapevtiki, podofilin, interferoni, steroidni hormoni itd. Ponovitve bolezni so pogoste, še posebej pri otrocih (22).
Povezava med virusno okužbo in nastankom papilomov grla je znana že desetletja. Tako je že leta 1923 Ullman poročal o uspešnem eksperimentalnem prenosu papilomov grla (23). Z večkratnim vbrizgavanjem celičnega ekstrakta papiloma grla, odstranjenega šestletnemu otroku, mu je uspelo prenesti papilom na lastno roko in v nožnico psi-ce. Začetni poskusi dokazovanja virusnih delcev v tkivnih vzorcih papilomov grla z elektronsko mikroskopijo so bili večinoma neuspešni (24, 25). Tako npr. Svobodi in sodelavcem (24) ter Stephenu in sodelavcem (25) z uporabo elektronske mikroskopije ni uspelo dokazati delcev HPV niti v enem od 33 pregledanih biopsijskih vzorcev ploščato-celičnih papilomov grla. Z izboljšavo elektronskomikroskopskih tehnik je raziskovalcem končno uspelo potrditi okužbo s HPV v posameznih primerih papilomov grla (26, 27). Imunohistokemične metode in uporaba sprva poliklonskih in kasneje monoklonskih protiteles proti veliki plaščni beljakovini so v zgodnjih osemdesetih letih omogočile dokaz HPV antigenov že v več kot polovici pregledanih papilomov grla (28,29). Z uvedbo molekularno viroloških metod v raziskave okužbe s HPV se je odstotek ugotovljene okužbe s temi virusi v papilomih grla večal in v primeru uporabe PCR v posameznih skupinah
papilomov grla, predvsem pri otrocih, že dosegel 100%. Pregled vseh pomembnejših molekularno-viroloških raziskav okužbe s HPV v papilomih grla je prikazan v tabeli 1.
Ploščatocelične papilome grla tradicionalno delimo glede na starost bolnikov pri prvem pojavu bolezni na papilome pri otrocih in papilome pri odraslih (42). Lindeberg in sodelavci (43) so leta 1986 papilome grla dodatno razvrstili v štiri skupine:
-	številni pri otrocih (angl. juvenile multiple);
-	posamezni pri otrocih (angl. juvenile solitary);
-	številni pri odraslih (angl. adult multiple);
-	posamezni pri odraslih (angl. adult solitary).
Tabela 1. Pregled vseh pomembnejših molekularno-viroloških raziskav okužbe s humanimi virusi papiloma v ploščatoceličnih papilomih grla. HPV — humani virus papiloma, ISH — hibridizacija in situ, SB — hibridi-zacija po Southernu, PCR — verižna reakcija s polimerazo, J — papilomi grla pri otrocih, A — papilomi grla pri odraslih, JM — številni papilomi grla pri otrocih, JS — posamezni papilomi grla pri otrocih, AM — številni papilomi grla pri odraslih, AS — posamezni papilomi grla pri odraslih.
Raziskovalna skupina	Leto raziskave	Število primerov	Metode, uporabljene za dokazovanje oku2be s HPV	Rezultati raziskave
Terry in sod. (30)	1087	10	ISH; tipa 6/11	HPV tipa 6 in 11 dokazana v 10/10 J papilomov
Corbitt in sod. (31)	1988	14	dot-blot in SB; tipi 6,11,16,18	HPV tip 6 dokazan v 10/14 in tip 11 v 3/14 papilomov
Terry in sod. (32)	1080	41	ISH; tipi 6/11, 16/18	HPV tipa 6 in 11 dokazana v 12/13 JM, 3/3 JS, 5/14 AM, 2/11 AS
Quiney in sod. (33)	1989	45	ISH; tipi 6/11, 16/18, 31/33/35	HPV tipa 6 in 11 dokazana v 8/14 J papilomov in 20/31 A papilomov
Tsutsumi in sod. (34)	1989	20	ISH; tipi 6/11, 16/18, 31/33/35	HPV tipa 6 in 11 dokazana v 8/8 AM in 0/12 AS papilomov
Levi in sod. (35)	1989	19	PCR z grupno-specifičnimi začetnimi oligonukleotidi	HPV tip 6 dokazan v 13/13 J papilomov in 6/6 A papilomov
Greer in sod. (36)	1990	2	dot-blot; tipi 6,11,16,18,31,33,35	HPV tip 6 dokazan v 2/2 papilomov
Lindeberg in sod. (37)	1990	20	ISH; tipi 6/11, 16/18	HPV tipa 6 in 11 dokazana v 19/20 AS papilomov
Brandsma in sod. (38)	1990	9	PCR z grupno-specifičnimi začetnimi oligonukleotidi	HPV tip 6 dokazan v 5/9 in HPV tip 11 v 4/11 papilomov
Dickens in sod. (39)	1991	27	dot-blot; tipi 6,11,16,18,31,33,35	HPV tip 11 dokazan v 13/27 in HPV tipi 6,11,16 v 3/27 papilomov
Rimmel in sod. (40)	1992	20	ISH; tipi 6/11, 16/18, 31/33/35	HPV tipa 6 in 11 dokazana v 11/11 J in 9/9 A papilomov
Arndt in sod. (41)	1992	35	ISH; tipi 6/11, 16/18, 31/33/35	HPV tipa 6 in 11 dokazana v 8/8 J in 25/27 A papilomov
Gale in sod. (12)	1994	79	ISH; tipi 6/11, 16/18, 31/33/35 in PCR z grupno-specifičnimi začetnimi oligonukleotidi	HPV tipa 6 in 11 dokazana v 28/29 J, 26/30 AM in 17/20 AS papilomov
Takšno razvrstitev ploščatoceličnih papilomov grla opravičujejo z različnim kliničnim potekom bolezni pri odraslih in pri otrocih (bistveno težji potek pri otrocih) ter z ugotovljeno neenakomerno razporeditvijo bolezni med spoloma pri odraslih, za razliko od enakomerne razporeditve bolezni med spoloma pri otrocih. Nenazadnje je upravičenost navedene razvrstitve papilomov grla narekovala tudi domneva o različni etiologiji teh tumorjev pri otrocih in odraslih, ki je temeljila na ugotovljeni, statistično pomembni razliki v prevalenci HPV-okužbe pri odraslih in otrocih s papilomi grla (tabela 1) (32, 34, 42). Posebno nizko prevalenco okužbe s HPV so raziskovalci ugotovili v podskupini posameznih papilomov grla pri odraslih. Tako je npr. Terryju in sodelavcem (32) z uporabo ISH uspelo dokazati okužbo s HPV tipoma 6/11 le v 2 od 11 primerov (18%) posameznih papilomov grla pri odraslih ter le v 5 od 14 primerov (35%) številnih papilomov pri odraslih, medtem ko so dokazali prisotnost teh dveh tipov HPV v 15 od 16 primerov (93%) papilomov pri otrocih. Še večjo razliko v prevalenci okužbe s HPV v posameznih skupinah papilomov so ugotovili Tsutsumi in sod. (34), ki jim z uporabo ISH ni uspelo dokazati prisotnosti HPV v nobenem od 12 primerov posameznih papilomov pri odraslih, medtem ko so v skupini številnih papilomov pri odraslih dokazali okužbo v vseh 8 primerih, vključenih v raziskavo. Nekaterim raziskovalnim skupinam je z uporabo bolj občutljivih metod (PCR, ISH z radioaktivno označenimi sondami) uspelo dokazati okužbo s HPV v približno enakem odstotku pri papilomih grla pri odraslih in otrocih, čeprav je treba omeniti, da v raziskanih serijah delež posameznih papilomov pri odraslih nikoli ni presegel 15% (35, 40, 41). Na osnovi raziskave, v kateri sta z uporabo ISH z radioaktivno označenimi sondami dokazala okužbo s HPV-tipoma 6/11 v 19 od 20 posameznih papilomov grla pri odraslih, sta Lindeberg in Johansen prva postavila domnevo o enotni etiologiji vseh skupin oz. podskupin ploščatoceličnih papilomov grla (37).
Glede na rezultate naših kliničnih, histopatoloških ter preliminarnih molekularno patoloških raziskav, v katerih nismo zasledili pomembnih razlik med papilomi pri otrocih in odraslih, smo enako kot Lindeberg in Johansen (37) domnevali, da vsi papilomi grla predstavljajo biološko entiteto z enotno etiologijo. Našo domnevo smo preverili z raziskavo, ki je bila po podatkih iz literature opravljena na do sedaj največjem številu papilomov grla in z uporabo trenutno najbolj občutljivih metod za odkrivanje okužbe s HPV (12). V raziskavo smo vključili 79 tkivnih vzorcev, fiksiranih v formalinu in vklopljenih v parafin, odvzetih 36 bolnikom, ki so se zdravili na Kliniki za otorinolaringologijo in cervikofacialno kirurgijo v Ljubljani v obdobju od leta 1980 do 1993. Bolniki vključeni v raziskavo, so bili izbrani naključno. Najmlajši bolnik je bil v času študije star 10 mesecev, najstarejši pa 71 let. Trije bolniki in šest bolnic so bili v času študije mlajši od 18 let (otroška skupina), medtem ko je bilo 17 bolnikov in 10 bolnic starejših od 18 let (odrasla skupina). Povprečna starost bolnikov je bila 37 let. 24 bolnikov (67%) je imelo v času študije zaradi papilomov več kot en kirurški poseg (med njimi vsi bolniki iz otroške skupine), 12 bolnikov pa en sam kirurški poseg.
Po mikrolaringoskopski sliki tumorjev pri prvem pregledu smo 29 papilomov grla opredelili kot številne pri otrocih, 30 papilomov kot številne pri odraslih, 20 papilomov pa kot posamezne pri odraslih.
Spremembe epitelija ploščatoceličnih papilomov grla smo opredelili po Kambič-Lenar-tovi klasifikaciji (44) kot navadno hiperplazijo v 33 papilomih 14 bolnikov, kot abnorm-no hiperplazijo v 43 papilomih 19 bolnikov in kot atipično hiperplazijo ali nevarnostni epi-telij pri 3 papilomih 3 bolnikov.
Koilocitozo, edini svetlobnomikroskopsko viden citopatski učinek okužbe s HPV, smo našli v 71 (90%) od 79 pregledanih ploščatoceličnih papilomov grla.
Z uporabo ISH smo okužbo s HPV tipoma 6/11 dokazali v 25 od 29 številnih papilomov pri otrocih, 23 od 30 številnih papilomov pri odraslih ter v 13 od 20 posameznih papilomov pri odraslih. Specifično rdeče rjavo obarvanost jeder, ki govori o navzočnosti HPV, smo videli izključno v celicah spinoznega sloja epitelija, nikoli pa v bazalnih celicah. V vseh HPV-pozitivnih vzorcih so se specifično obarvala samo jedra epitelijskih celic in nikoli celična citoplazma ali membrana. Področja specifično obarvanih celic so se v večini primerov ujemala s svetlobnomikroskopsko ugotovljenimi koilociti. Primer ploščatocelične-ga papiloma grla, v katerem smo z ISH dokazali HPV tipa 6/11, je prikazan na sliki 1. V nadaljevanju raziskave smo hoteli preveriti, ali 18 tkivnih vzorcev ploščatoceličnih papilomov grla, v katerih z ISH nismo dokazali okužbe s HPV, resnično ne vsebuje teh virusov. Zato smo te vzorce pregledali tudi s PCR z grupno specifičnimi začetnimi olligo-nukleotidi MY09/MY11. Kot pozitivne kontrole smo izbrali 10 vzorcev ploščatoceličnih
Slika 1. Primer ploščatoceličnega papiloma grla, v katerem smo s hibridizacijo in situ dokazali navzočnost humanega virusa papiloma tipa 6/11. Pozitivna reakcija je vidna v rdeče rjavo obarvanih jedrih v zgornjih dveh tretjinah ploščatoceličnega epitelija. Kontrastirano z Mayerjevim hematoksilinom.
papilomov grla, v katerih smo predhodno z ISH dokazali okužbo s HPV, kot negativne kontrole pa 5 avtopsijskih vzorcev normalnega grla. Kakovost ekstrahirane DNA smo v vseh 33 vzorcih preverjali s pomnoževanjem delcev beta-globinskega gena z začetnimi oligonukleotidi GH20/PC04. S PCR smo uspeli dokazati okužbo s HPV v 10 od 18 (55%) primerov ISH-negativnih ploščatoceličnih papilomov grla, med njimi v 3 pa-pilomih, opredeljenih kot številni pri otrocih, v 3 papilomih, opredeljenih kot številni pri odraslih, in v 4 papilomih, opredeljenih kot posamezni pri odraslih. Delce beta-globin-skega gena smo uspešno pomnožili v vseh 18 HPV ISH-negativnih papilomih. Za opredelitev tipa HPV v 10 papilomih, ki so bili PCR-pozitivni in ISH-negativni, smo uporabili metodo encimske razgradnje PCR-pridelka MY09/MY11, ki je pokazala prisotnost HPV-tipa 6 v vseh 10 papilomih grla. Prisotnost HPV smo s PCR dokazali tudi v vseh 10 tkivnih vzorcih ploščatoceličnih papilomov grla, v katerih smo predhodno z ISH dokazali okužbo s HPV-tipoma 6 in 11 (pozitivne kontrole). Nasprotno s PCR nismo dokazali okužbe s HPV v nobenem od 5 avtopsijskih vzorcev normalnega grla (negativne kontrole). Iz vseh 15 tkivnih kontrolnih vzorcev smo uspešno pomnožili delce beta-globinskega gena z začetnimi oligonukleotidi GH20/PC04.
Skupno smo z uporabo ISH in PCR okužbo s HPV-tipoma 6/11 dokazali v 28 od 29 številnih papilomov pri otrocih, 26 od 30 številnih papilomov pri odraslih in v 17 od 20 posameznih papilomov pri odraslih (12).
Rezultati naše raziskave torej v celoti podpirajo navedeno domnevo Lindeberga in Jo-hansena (37). Menimo, da je bila različna pogostost okužbe s HPV v posameznih podskupinah papilomov ugotovljena zaradi uporabe premalo občutljivih in specifičnih metod za odkrivanje te okužbe ter zaradi raziskav, opravljenih na premajhnem številu primerov. Možna razlaga za statistično značilno nižjo prevalenco okužbe s HPV v podskupini posameznih papilomov pri odraslih, ugotovljeno v vseh študijah razen v Lindeberg-Johansenovi (37) in naši, je manjše število virusov, prisotnih v tej podskupini papilomov v primerjavi z ostalimi. Različno število prisotnih virusov bi pri uporabi manj občutljivih metod za dokazovanje okužbe s HPV lahko privedlo do navidezne razlike v prevalenci te okužbe v posameznih podskupinah papilomov grla. Tkivnih vzorcev z relativno majhnim številom HPV, ki je pod pragom občutljivosti omenjenih metod, le-te namreč ne bi prepoznale kot HPV-pozitivne. Pri uporabi bolj občutljivih metod za dokazovanje okužbe s HPV takšne navidezne razlike ni, ker s temi metodami spoznamo okužbo s HPV tudi v tkivnih vzorcih z majhnim številom virusov.
Pojavljanje bolezni v dveh starostnih obdobjih je temelj delitve papilomov grla v dve skupini (43). Nastanek in razvoj papilomov grla pri otrocih in mladostnikih povezujejo s prenosom HPV z okužene matere na novorojenca pri prehodu skozi porodni kanal (40,45). Način okužbe sluznice grla s HPV pri odraslih bolnikih še ni dokončno razjasnjen. Najpogosteje omenjajo reaktivacijo latentne okužbe s HPV, pridobljene pri porodu ali kasnejšo okužbo zaradi orogenitalnih stikov ali stikov z aerosoli, ki vsebujejo virusne delce (45). Menimo, kot nekateri drugi avtorji (38, 40), da je prva možnost malo verjetna. Z reaktivacijo latentne okužbe s HPV si težko razlagamo prvi pojav posameznega papiloma grla v starosti 71 let pri bolnici, vključeni v našo raziskavo. Če bi bila domneva o reaktivaciji latentne okužbe s HPV pravilna, bi morali zaradi pogoste prisotnosti tipa
HPV 16 in 18 v kanalu materničnega vratu (tudi do 15% v populaciji ginekološko popolnoma zdravih žensk) (2), tudi v sluznici grla pogosteje najti tipa HPV 16 in 18, kar je izjemno redko. Prav tako bi morala biti v primeru pravilnosti te domneve razporeditev papilomov grla med spoloma pri odraslih enakomerna (takšna, kot je pri papilomih grla pri otrocih), ne pa približno dvakrat večja pri moških, kot je ugotovljeno v vseh klinično patoloških študijah.
Tradicionalno delitev papilomov grla po starosti mnogi utemeljujejo z različnim kliničnim potekom bolezni pri otrocih in odraslih. Pri otrocih s papilomi grla je namreč klinični potek včasih dramatičen in se bolezen pogosto ponavlja, medtem ko je potek bolezni pri odraslih v glavnem blažji (43, 46). Menimo, da je razlika v klinični sliki bolezni pri otrocih in odraslih posledica izključno manjšega premera dihalnih poti pri otrocih v primerjavi s premerom dihalnih poti pri odraslih in ne posledica različne etiologije teh dveh skupin papilomov grla (12).
Na osnovi rezultatov naših predhodnih kliničnih in patohistoloških ter predstavljenih mo-lekularno-viroloških raziskav, opravljenih na velikem številu primerov, lahko zaključimo, da le-ti podpirajo domnevo o enotni etiologiji vseh ploščatoceličnih papilomov grla (12, 13). Njihov nastanek je tesno povezan z okužbo s tipoma HPV 6/11. Rezultati kažejo, da so vsi ploščatocelični papilomi grla biološko enotna skupina in da le razlike v klinični sliki ne upravičujejo delitve teh novotvorb v posamezne skupine oz. podskupine.
Epitelijske hiperplastične spremembe sluznice grla s klinično sliko kroničnega laringitisa in humani virusi papiloma
Pogoste bolezenske spremembe v grlu, predvsem na glasilkah, so tiste, ki jih laringo-logi po kliničnem pregledu poimenujejo kronični laringitis. S posredno ali neposredno laringoskopijo največkrat ugotovijo simetrično zadebeljene glasilke z neravno, umazano rdečkasto površino, pogosto pokrito z različno velikimi belkastimi lisami. Končna diagnoza je vedno odvisna od histološke slike, v kateri so lahko vidne vse spremembe od začetne zadebelitve ploščatoceličnega epitelija do invazivnega karcinoma (22).
Za histološko opredelitev kroničnih bolezenskih sprememb sluznice grla in napoved poteka bolezni se od leta 1971 v Sloveniji uporablja Kambič-Lenartova klasifikacija (13,22, 44, 47-50). Klasifikacija je rezultat dolgoletnih izkušenj slovenskih zdravnikov pri obravnavanju in zdravljenju epitelijskih hiperplastičnih sprememb sluznice grla s klinično sliko kroničnega laringitisa. Pri vrednotenju in razvrščanju teh sprememb v posamezne skupine se upošteva predvsem zadebelitev celotnega epitelija, zakasnelo dozorevanje epitelijskih celic, jedrne in celične atipije, število diskeratotičnih celic ter število imuno-kompetentnih celic vsubepitelijski stromi. Po Kambič-Lenartovi klasifikaciji razvrščamo epitelijske spremembe v naslednjih pet skupin (44):
- navadna hiperplazija (hyperplasia simplex): epitelij je zadebeljen na račun celic spi-nozne plasti; plast bazalnih celic je nespremenjena, v subepitelijskem vezivu skoraj ni imunokompetentnih celic;
-	abnormna hiperplazija (hyperplasia abnormalis): nedozorele celice bazalnega tipa so pomnožene in dosežejo polovico debeline epitelija, v višjih plasteh najdemo tudi posamezne diskeratotične celice, v subepitelijskem vezivu je zmerna kronična vnetna infiltracija;
-	atipična hiperplazija (hyperplasia atypica) ali nevarnostni epitelij: v vsej debelini epitelija so pomnožene nedozorele celice bazalnega tipa z zelo zmernimi jedrnimi in celičnimi atipijami in številne diskeratotične celice, subepitelijsko je pogosto viden močan odziv organizma v obliki infiltracije s številnimi imunokompetentnimi celicami;
-	intraepitelijski karcinom (carcinoma in situ): vidne so vse značilnosti rakaste rašče, hude jedrne in celične atipije, porušena je celotna epitelijska zgradba, prisotne so patološke mitoze ter številne diskeratotične celice, bazalna epitelijska membrana je ohranjena;
-	invazivni karcinom (carcinoma invasivum): viden je vdor rakastih celic skozi bazalno membrano v subepitelijsko stromo.
Prvi dve skupini sprememb sta izrazito benigni, v skupino prekanceroz ali nevarnostnega epitelija uvrščamo le atipično hiperplazijo (13, 22).
Prekanceroza naj bi bila epitelijska sprememba sluznice grla, iz katere se bo verjetno v določenem času, iz nam še neznanih vzrokov, razvila maligna novotvorba. Pri današnjem pomanjkljivem znanju o nastanku karcinoma grla, predvsem pa zaradi zapletenega in večkrat tudi neuspešnega zdravljenja, je večina avtorjev mnenja, da so za izid bolezni izredno pomembni zgodnja spoznava prekanceroz, njihovo pravilno vrednotenje ter zgodnje zdravljenje (13, 22).
Natančna vloga prekanceroze v procesu maligne preobrazbe še ni jasno opredeljena in prav tako ne njene biološke lastnosti, etiologija in histološka slika. Tako nikoli ne moremo zanesljivo trditi, da se bo iz določene vrste hiperplastičnih sprememb sluznice grla razvil karcinom. Rakasta rašča se namreč lahko razvije iz na videz popolnoma zdravega tkiva, in to najbrž pogosteje kot iz tako imenovanih prekanceroz. Zato menimo, da bi namesto izraza prekanceroza, ki že sam po sebi nekaj vnaprej določa, raje uporabljali izraz nevarnostni ali rizični epitelij (13,22). Ta izraz ničesar vnaprej ne določa, opozarja pa nas, da moramo biti pri obravnavanju bolnika s takšno spremembo sluznice grla zelo previdni in da ga moramo nenehno nadzorovati.
Kljub številnim epidemiološkim, eksperimentalnim in kliničnim raziskavam etiopatoge-neza epitelijskih hiperplastičnih sprememb sluznice grla do danes še ni povsem znana (13). Domnevajo, da na njihov vznik vpliva več bolj ali manj pomembnih etiopatoge-netskih dejavnikov:
-	kajenje;
-	prekomerno uživanje alkoholnih pijač;
-	ionizirajoče sevanje;
-	pomanjkanje vitamina A;
-	genetični dejavniki;
-	hormoni;
-	izpostavljenost azbestu;
-	toplotna radiacija;
-	kronične okužbe.
Glede na dejstvo, da je 88-98% bolnlkov, zbolellh za rakom grla, aktlvnlh kadllcev ln nekaj manj prekomernlh užlvalcev alkoholnlh pljač, večlna avtorjev danes menl, da sta kajenje ln alkohol (zlastl v komblnacljl) najpomembnejša etlološka dejavnlka v etlopa-togezl teh sprememb (13). PollakUcm aromatskl ogljlkovodlkl (metllholantren, benzopl-ren ln benzantracen) ter mtrozamlm, osamljen lz tobaka, so izraziti kardnogern za sluz-nlco grla. Natančen mehanlzem karclnogenega delovanja etanola še m jasen, domnevajo pa, da je le-ta verjetno sodejavnlk, kl spodbuja karclnogeno delovanje druglh kar-clnogenov ln ne samostojen karclnogen (13).
Tabela 2. Pregled vseh pomembnejših molekularno-viroloških raziskav okužbe s humanimi virusi papiloma v ploščatoceličnih karcinomih grla. HPV— humani virusi papiloma, SB — hibridizacija po Southernu, ISH — hibridizacija in situ, PCR — verižna reakcija s polimerazo.
Raziskovalna skupina	Leto raziskave	Število primerov	Metode, uporabljene za dokazovanje okužbe s HPV	Rezultatl razlskave
Kahn in sod. (52)	1986	42	SB; tlp 30	HPV tlp 30 dokazan v 1/42 karclnomov
Scheurlen in sod. (53)	1986	36	SB; tlp 16	HPV tlp 16 dokazan v 1/36 karclnomov
Stremlau in sod. (54)	1987	30	SB; tlpl 1,2,4,8-11,13,16,18	HPV tlp 16 dokazan v 3/30 karclnomov
Syrjanen in sod. (55)	1987	116	ISH; tlpl 6/11,16,30	HPV tlp 16 dokazan v 15/116 karclnomov
Zarod in sod. (56)	1988	1	SB, tlpa 6 ln 11	dokazan HPV tlp 6
Brandsma in sod. (38)	1989	60	SB; tlpl 6,11,16,18,31	HPV tlp 16 dokazan v 3/60 karclnomov
Kiyabu in sod. (57)	1989	10	PCR; tlpa 16 ln 18	HPV tlp 16 dokazan v 4/10 karclnomov
Lindeberg in sod. (58)	1989	4	ISH; tlpl 6,11,16,18,30	HPV tlp 11 dokazan v 2/4 karclnomov
Hoshikawa in sod. (59)	1990	34	PCR; tlpl 6b,11,16	HPV tlp 6b dokazan v 1/34 ln tlp 16 v 3/34 karclnomov
Perez-Ayala in sod. (60)	1990	48	PCR; tlpa 11 ln 16	HPV tlp 16 dokazan v 26/48 karclnomov
Somers in sod. (61)	1990	25	SB; tlpl 2,6,11,16,18,30,31,33	HPV tlp 16 dokazan v 1/25 karclnomov
Watts in sod. (62)	1991	9	SB ln PCR; tlpl 2,6/11,16/18,13	HPV tlpa 6 ln 11 dokazana v 4/9 ln tlpa 16 ln 18 v 1/9 karclnomov
Brandwein in sod. (63)	1993	40	PCR z grupno-speclflčnlml začetnlml ollgonukleotldl	HPV tlp 16 dokazan v 3/40 karclnomov
Clayman in sod. (64)	1994	78	PCR z grupno-speclflčnlml začetnlml ollgonukleotldl	HPV dokazanl v 30/78 karclnomov
Simon in sod. (65)	1994	1	ISH; tlpl 11,16,18,31,33,35,39,42	dokazana HPV tlpa 18 ln 33
Poljak (16)	1995	20	ISH; tlpl 6/11,16/18,31/33/51 ln PCR z grupno-speclflčnlml začetnlml ollgonukleotldl	HPV tlp 16 dokazan s PCR v enem karclnomu
Za razliko od epitelijskih hiperplastičnih sprememb sluznice v genitalnem traktu smo v dostopni literaturi zasledili le eno poročilo o povezavi okužbe s HPV z nastankom epitelijskih hiperplastičnih sprememb sluznice grla s klinično sliko kroničnega laringitisa (51).
V	literaturi smo zasledili več poročil o dokazu posameznih tipov HPV v posameznih primerih karcinoma grla. Pregled vseh pomembnejših molekularno-viroloških raziskav okužbe s HPV v ploščatoceličnem karcinomu grla je prikazan v tabeli 2.
Naše dosedanje raziskave epitelijskih hiperplastičnih sprememb sluznice grla s klinično sliko kroničnega laringitisa so temeljile na iskanju objektivnih histomorfoloških kriterijev za razvrščanje teh sprememb v posamezne skupine, kar je odločujoče za pravilno izbiro ustreznega zdravljenja in napovedi bolezni (13, 15, 22, 44, 47-50). Temeljile so predvsem na uporabi tradicionalnih svetlobnomikroskopskih, histokemičnih, imuno-histokemičnih in elektronskomikroskopskih metod. Z molekularnimi metodami smo želeli ugotoviti, ali je med etiološkimi dejavniki pri nastanku teh sprememb treba upoštevati tudi virusno okužbo.
V	raziskavo povezave med okužbo s HPV in nastankom epitelijskih hiperplastičnih sprememb sluznice grla s klinično sliko kroničnega laringitisa smo vključili 61 tkivnih vzorcev, fiksiranih v formalinu in vklopljenih v parafin, odvzetih 38 bolnikom, ki so se zdravili na Kliniki za otorinolaringologijo in cervikofacialno kirurgijo v Ljubljani v obdobju od leta 1985 do 1992 (16). Bolniki, vključeni v raziskavo, so bili izbrani naključno.
Po Kambič-Lenartovi klasifikaciji (44) smo tkivne vzorce v 14 primerih histopatološko opredelili kot navadno hiperplazijo, v 13 primerih kot abnormno, v 14 primerih kot atipično hiperplazijo ali nevarnostni epitelij ter v 20 primerih kot intraepitelijski ali invaziv-ni ploščatocelični karcinom grla.
Z ISH smo okužbo s HPV-tipoma 6/11 dokazali le v enem primeru navadne hiperplazi-je (slika 2). Okužbe s HPV-tipi 16/18 in 31/33/51 nam ni uspelo dokazati z ISH v nobenem od pregledanih 61 tkivnih vzorcev. S PCR z grupno specifičnimi začetnimi oligo-nukleotidi MY09 in MY11 smo potrdili okužbo s HPV v ISH-pozitivnem vzorcu navadne hiperplazije sluznice grla in jo dokazali v enem primeru invazivnega ploščatoceličnega karcinoma grla. Za opredelitev HPV-tipa smo uporabili metodo encimske razgradnje PCR-pridelka ter encimsko oligonukleotidni test. Obe metodi sta pokazali prisotnost HPV-ti-pa 6 v tkivnem vzorcu navadne hiperplazije in HPV-tipa 16 v vzorcu invazivnega ploš-čatoceličnega karcinoma grla. Delce beta-globinskega gena smo uspešno pomnožili z uporabo začetnih oligonukleotidov GH20/PC04 in KM29/RS42 iz 60 oz. 59 tkivnih vzorcev.
Skupno smo torej, kljub uporabi trenutno najbolj občutljivih metod, dokazali okužbo s HPV-tipom 6 le v enem primeru navadne hiperplazije ter s HPV-tipom 16 le v enem primeru karcinoma grla (16). O podobno nizki prevalenci okužbe s HPV v nekaterih epitelijskih hiperplastičnih spremembah sluznice grla so nedavno poročali tudi Rihkanen in sodelavci (51).
V	literaturi smo do konca leta 1994 zasledili dvanajst pomembnejših molekularno viro-loških raziskav povezave med okužbo s HPV in nastankom ploščatoceličnega karcinoma grla (tabela 2). Rezultati teh raziskav, opravljenih z različno občutljivimi in specifič-
Slika 2. Primer navadne hiperplazije epitelija sluznice grla, v kateri smo s hibridizacijo in situ dokazali navzočnost humanega virusa papiloma tipa 6/11. Pozitivna reakcija je vidna v rdeče rjavo obarvanih jedrih v zgornjih dveh tretjinah plosčatoceličnega epitelija. Kontrastirano z Mayerjevim hematoksilinom.
nimi metodami, so si nasprotujoči. Prevalenca dokazane okužbe s HPV v raziskavah v obdobju pred uporabo PCR se giblje med 2 in 12% (16). Več kot 90% HPV, dokazanih v karcinomih grla, je bilo v teh raziskavah opredeljenih kot HPV-tip 16. Tri raziskovalne skupine so s PCR dokazale okužbo s HPV v 40-54% pregledanih tkivnih vzorcev ploščatoceličnega karcinoma grla (57, 60, 64), nasprotno pa je bila ugotovljena prevalenca okužbe s HPV v treh raziskavah, vključno z našo, nižja od 10% (16, 59, 63).
Pomembne razlike v prevalenci okužbe s HPV, ugotovljene v navedenih študijah, so lahko rezultat več dejavnikov. PCR je izredno občutljiva metoda in lažno pozitivni rezulta-
ti so pri vsakodnevnem delu sorazmerno pogosti (18). Zatorej menimo, enako kakor Brandwein in sodelavci (63), da obstaja velika možnost, da so nekateri od HPV-pozitivnih kar-cinomov grla, odkriti v študijah z zelo visoko prevalenco okužbe s HPV (57, 60, 64), posledica kontaminacije oz. lažno pozitivni rezultati. V vseh treh študijah z ugotovljeno zelo visoko prevalenco okužbe s HPV raziskovalci namreč niso uporabljali nobenega od priporočenih specifičnih postopkov za zmanjševanje možnosti lažno pozitivnih rezultatov PCR. Uporabljali so samo nekatere nespecifične postopke, ki po rezultatih več mul-ticentričnih študij niso dovolj učinkoviti za preprečevanje pojava lažno pozitivnih rezultatov PCR (17). Nasprotno sta bila v raziskavi Brandweina in sodelavcev (63) in v naši raziskavi v delo vključena posebna, specifična postopka za preprečevanje pojava lažno pozitivnih rezultatov PCR, in sicer N-uracil glikozilazni postopek in PCR z začetkom na visoki temperaturi (angl. hot start PCR).
Obstaja tudi možnost, da je majhen delež HPV-pozitivnih ploščatoceličnih karcinomov grla, odkritih v študijah z nizko prevalenčno stopnjo okužbe s HPV, posledica lažno negativnih rezultatov v teh študijah, čeprav je po našem mnenju takšna možnost zelo majhna. V vseh treh raziskavah z odkrito nizko prevalenčno stopnjo okužbe s HPV so raziskovalci namreč poleg delcev HPV istočasno pomnoževali tudi delce najmanj enega vse-prisotnega gena oz. izvajali notranje kontrolno pomnoževanje. Dodatno so v vseh treh raziskavah za dokazovanje specifičnosti PCR-pridelka uporabljali zelo občutljivi in specifični metodi, kot sta hibridizacija po Southernu ali encimsko oligonukleotidni test. Z navedenimi ukrepi je bila možnost lažno negativnih rezultatov PCR zmanjšana na najmanjšo možno mero.
Različna prevalenca okužbe s HPV, ugotovljena v ploščatoceličnih karcinomih grla, je po mnenju Brandweina in sodelavcev (63) posledica večje povezanosti okužbe s HPV z nastankom in razvojem teh novotvorb v določenih zemljepisnih področjih sveta, tako kot je to npr. dokazano za ploščatocelične karcinome požiralnika. Menimo, da tudi ta razlaga ni pravilna, saj ploščatocelični karcinom grla ni novotvorba z izrazito zemljepisno razporeditvijo, za razliko od ploščatoceličnega karcinoma požiralnika, ki se v določenih področjih sveta pojavlja tudi 500-krat pogosteje od svetovnega povprečja.
Čeprav je bila naša raziskava opravljena na relativno majhnem številu tkivnih vzorcev, lahko zaključimo, da pri bolnikih v Sloveniji okužba s HPV verjetno ni pomembnejši etio-loški dejavnik pri vzniku in razvoju epitelijskih hiperplastičnih sprememb sluznice grla s klinično sliko kroničnega laringitisa, vključno s ploščatoceličnim karcinomom grla. Rih-kanen in sodelavci (51) so nedavno objavili zelo zanimivo študijo, v kateri so s PCR odkrili prisotnost DNA HPV tudi v manjšem odstotku tkivnih vzorcev klinično in histološko normalnega grla. Glede na to, da smo v naši študiji ugotovili prevalenco okužbe s HPV v hiperplastičnih spremembah sluznice grla podobno prevalenci v normalnem grlu, menimo podobno kot Rihkanen in sodelavci (51), da o etiološki povezavi med okužbo s HPV in novotvorbami grla, v katerih virusno DNA odkrijemo v nizkem odsotku, ne smemo sklepati samo na osnovi dokaza prisotnosti virusne DNA.
Ploščatocelični papilomi požiralnika in humani virusi papiloma
Ploščatocelični papilom požiralnika je zelo redka benigna epitelijska novotvorba. Do sedaj je v literaturi opisanih le 168 primerov (67). Običajno je to resičasta ali cvetačasta, rožnato rdečkasta sprememba, velikosti od 0,4 do 1,5 cm. Najdemo ga kjerkoli na sluznici požiralnika, najpogosteje v spodnji tretjini. Papilomi so večinoma posamezni, številne so našli v manj kot 10 % primerov. Papilom požiralnika se pojavlja enako pogosto pri moških in ženskah, predvsem pri odraslih. Histološko je papilom grajen iz resičaste vezivno-žilne strome, ki jo odeva večplasten ploščatoceličen, včasih poroženevajoč epi-telij (slika 3).
Slika 3. Pregledna slika ploščatoceličnega papiloma požiralnika, ki kaže razvejano vezivno-žilno stromo, ki jo odeva neporoženevajoč večskladen ploščatocelični epitelij.
Klinična znamenja so odvisna od velikosti in lokalizacije spremembe. Več kot polovica bolnikov je brez kliničnih znakov bolezni; pri njih papilome najpogosteje odkrijejo slučajno pri endoskopskem pregledu zaradi drugih težav. Večji papilomi, še posebej tisti v spodnji tretjini požiralnika, povzročajo nelagodje ali epigastrične bolečine, večkrat tudi oteženo požiranje. V literaturi do sedaj ni poročil o spontani maligni preobrazbi teh novotvorb (66-68).
Zdravljenje je najpogosteje kirurško. Ponovitve bolezni so redke (67).
Zaradi redkosti papilomov požiralnika je etiopatogeneza teh novotvorb še vedno neraz-jasnjena. Kot najpomembnejši etiopatogenetski dejavnik navajajo kronično vnetje požiralnika zaradi gastroezofagalnega refluksa pri različnih boleznih zgornjih prebavil
(hiatalna hernija, peptična razjeda). Po natančni analizi dostopnih kliničnih podatkov vseh do sedaj objavljenih primerov ploščatoceličnih papilomov požiralnika so Orlowska in sodelavci (67) nedavno zaključili, da je etiopatogenetska povezava med nastankom teh novotvorb in kroničnim vnetjem sluznice požiralnika zaradi drugih bolezni zgornjih prebavil bolj naključna kot stvarna. Pri več kot polovici opisanih primerov bolnikov s papi-lomi požiralnika namreč ni bilo zaslediti druge bolezni zgornjih prebavil, in dodatno, ze-
Tabela 3. Pregled vseh raziskav okužbe s humanimi virusi papiloma v ploščatoceličnih papilomih požiralnika. EM — elektronska mikroskopija, IHC — imunohistokemične metode, ISH — hibridizacija in situ, PCR — verižna reakcija s polimerazo.
Raziskovalna skupina	Leto raziskave	Število primerov	Metode, uporabljene za dokazovanje okužbe s HPV	Rezultati raziskave
Colina in sod. (70)	1980	3	poskus kultivacije in EM	poskus kultivacije neuspešen, z EM ni dokazanih virusnih delcev
Syrjanen in sod. (69)	1982	1	IHC	dokazana velika plaščna beljakovina
Lesec in sod. (71)	1985	1	IHC	dokazana velika plaščna beljakovina
Toet in sod. (72)	1985	4	EM	ni dokazanih virusnih delcev
Winkler in sod. (73)	1985	2	IHC	ni dokazana velika plaščna beljakovina
Sablich in sod. (74)	1988	11	EM	ni dokazanih virusnih delcev
Hording in sod. (75)	1989	1	dot-blot; tipi 6/11,16,18	dokazana HPV tipa 6/11
Janson in sod. (76)	1991	1	ISH	dokazana HPV tipa 6/11
Fontolliet in sod. (77)	1991	33	ISH; tipi 6/11,16/18,31/33/35	HPV tipi 31,33,35 dokazani v 6/33 papilomov (šibek hibridizacijski signal)
van Cutsem in sod (78)	1991	1	IHC in EM	dokazana velika plaščna beljakovina
Chang in sod. (68)	1991	12	ISH in PCR; tipi 6,11,16,18	DNA HPV ni dokazana
Politoske (79)	1992	1	ISH; tipi 6/11,16/18,31/33/35	dokazana HPV tipa 6/11
Odze in sod. (80)	1993	26	PCR; tipi 6b/11,16,18	HPV tip 16 dokazan v 9 papilomih, HPV tipa 16 ir 18 v 3 papilomih in HPV tipa 6b in 11 v enem papilomi
Carr in sod. (81)	1994	23	ISH; tipi 6/11,16/18,18,31/33/51 in PCR z grupno-specifičnimi začetnimi oligonukleotidi	HPV tipa 6/11 dokazana z ISH in PCR v enem papilomu
Poljak in Cerar (8)	1994	7	ISH; tipi 6/11,16/18,31/33/51 in PCR z grupno-specifičnimi začetnimi oligonukleotidi	HPV tip 6 dokazan s PCR v enem papilomu
Poljak in sod. (11)	1995	29	ISH; tipi 6/11,16/18,31/33/51 in PCR z dvema paroma grupno-specifičnih začetnih oligonukleotidov	HPV tip 6 dokazan s PCR v enem papilomu
lo nizka prevalenca papilomov požiralnika, ugotovljena v dosedanjih študijah, je v nasprotju z velikim številom bolnikov z boleznimi zgornjih prebavil kot sta peptična razjeda ali hiatalna hernija. Dodatno je bila več kot polovica objavljenih primerov ploščatocelič-nih papilomov požiralnika endoskopsko odstranjena iz srednje ali zgornje tretjine požiralnika, kjer je vpliv gastroezofagalnega refluksa na sluznico požiralnika bistveno manjši.
Okužbo s HPV je kot možen dejavnik v etiopatogenezi papilomov požiralnika prvič omenil Syrjanen leta 1982 (69), ko je dokazal prisotnost velike plaščne beljakovine HPV v enem primeru papiloma požiralnika. Kasneje je raziskovalcem z uporabo imunohistokemičnih in hibridizacijskih metod ter PCR uspelo dokazati prisotnost antigenov HPV ali DNA HPV še v 26 primerih ploščatoceličnih papilomov požiralnika, medtem ko v 95 papilomih okužba ni bila dokazana (tabela 3). Čeprav so bile omenjene študije opravljene večinoma na majhnem številu papilomov (sedem na enem samem primeru) in z uporabo različno občutljivih in specifičnih metod, lahko sklepamo, da večina papilomov požiralnika verjetno ni etiološko povezana z okužbo s HPV.
V želji, da preverimo navedeno domnevo, smo v sodelovanju z Oddelkom za gastroen-terologijo Medicinskega centra za podiplomsko izobraževanje iz Varšave zbrali do sedaj največjo zbirko papilomov požiralnika, na kateri smo izvedli raziskavo vloge HPV v etiopatogenezi teh novotvorb (8, 11). V raziskavo smo vključili 36 arhivskih tkivnih vzorcev teh novotvorb, fiksiranih v formalinu in vklopljenih v parafin ali paraplast. 23 tkivnih vzorcev, odvzetih istemu številu bolnikov, smo izbrali iz histopatoloških arhivov Inštituta za patologijo Medicinske fakultete v Ljubljani, medtem ko smo 13 vzorcev 12 bolnikov izbrali iz arhivov Oddelka za gastroenterologijo Medicinskega centra za podiplomsko izobraževanje iz Varšave. V raziskavo vključeni tkivni vzorci so bili stari od 1 do 14 let.
Najmlajši bolnik je bil v času študije star 25, najstarejši pa 83 let. Povprečna starost bolnikov je bila 50,2 let. En bolnik je imel v požiralniku dva papiloma, ki sta bila istočasno endoskopsko odstranjena. Vsi ostali bolniki so imeli v požiralniku en sam papilom. 22 papilomov je bilo endoskopsko odstranjenih iz spodnje, 7 iz srednje in 7 iz zgornje tretjine požiralnika. Makroskopsko so bili papilomi požiralnika resičastega ali cvetačastega videza, rožnate ali rdeče barve, v premeru veliki od 2 do 20 mm (povprečni premer 4,4 mm). Histološko so bili grajeni iz rahle razvejane vezivno-žilne strome, ki jo je odeval nepo-roženevajoč večskladen ploščatocelični epitelij brez znakov celičnih atipij.
Z ISH nismo uspeli dokazati okužbe s HPV v niti enem od 36 pregledanih ploščatoceličnih papilomov požiralnika. S PCR z grupno specifičnimi začetnimi oligonukleotidi MY09/MY11 in GP5/GP6 smo dokazali okužbo s HPV v dveh tkivnih vzorcih ploščatoceličnih papilomov požiralnika (slika 4). Oba para grupno specifičnih začetnih oligonu-kleotidov sta za HPV-pozitivna spoznala ista tkivna vzorca. Za opredelitev tipa HPV v pozitivnih vzorcih ploščatoceličnih papilomov požiralnika smo uporabili metodo encimske razgradnje PCR-pridelka MY09/MY11 in encimsko oligonukleotidni test. Obe metodi sta pokazali prisotnost HPV tipa 6 v obeh tkivnih vzorcih papilomov požiralnika. Delce be-ta-globinskega gena smo uspešno pomnožili z uporabo začetnih oligonukleotidov GH20/PC04 in KM29/RS42 iz 36 oz. 35 tkivnih vzorcev. Za uspešno pomnoževanje del-
Slika 4. Primeri uspešnega (elektroforezni koloni C in G) in neuspešnega (elektroforezne kolone B, D, E, F in H) pomnoževanja delcev DNA humanega virusa papiloma iz tkivnih vzorcev ploščatoceličnih papilomov požiralnika. Elektroforezna kolona A, pozitivna kontrola. Elektroforezna kolona M, molekularni označevalec VI (Boehringer Mannheim GmbH, Nemčija).
cev beta-globinskega gena iz dveh vzorcev DNA je bilo potrebno dodatno redčenje izhodiščne DNA 1:10.
Oba HPV-pozitivna ploščatocelična papiloma požiralnika smo odkrili pri slovenskih bolnikih. Prvi je bil odstranjen iz srednje tretjine požiralnika 61-letni bolnici, po poklicu gospodinji, kadilki, ki je bila endoskopsko pregledana zaradi ponavljajočih se epigastričnih bolečin. Pri pregledu so kot osnovni vzrok epigastričnih težav ugotovili refluksni ezofagi-tis. Odstranjeni papilom je bil rožnate barve in je v premeru meril 4 mm. Drugi HPV-pozi-tivni papilom požiralnika je bil odstranjen iz spodnje tretjine požiralnika 41-letnemu moškemu, po poklicu kovaču, kadilcu, ki je bil endoskopsko pregledan zaradi ponavljajočega se epigastričnega nelagodja. Pri pregledu so kot vzrok nelagodja ugotovili samo papilom požiralnika. Odstranjeni papilom je bil prav tako rožnate barve in je v premeru meril 7 mm.
Domnevo, da večina papilomov požiralnika verjetno ni etiološko povezana z okužbo s HPV, smo torej potrdili tudi z našo raziskavo, v kateri nam je uspelo dokazati okužbo s HPV le v 2 od 36 preiskanih papilomov požiralnika (8, 11).
Tudi z uporabo tako občutljive metode kot je PCR, HPV niso pogosto odkrili v papilomih požiralnika. V treh od štirih do sedaj objavljenih PCR-raziskavah, vključno z našo, je bila prevalenca okužbe s HPV v papilomih požiralnika med 0 in 5,5% (8, 11, 68, 81). Nasprotno so Odze in sodelavci (80) nedavno objavili rezultate raziskave, v kateri so s PCR dokazali okužbo s HPV v 50% (13 od 26) papilomov požiralnika. Za razliko od ostalih raziskav, v katerih so dokazali navzočnost nizkorizičnih HPV-tipov 6 ali 11, so Odze in sodelavci v papilomih požiralnika dokazali predvsem visokorizična HPV-tipa 16 in 18.
Pomembna razlika v prevalenci okužbe s HPV, ki je bila ugotovljena v navedenih PCR-študijah, je lahko posledica več dejavnikov. Podobno kot pri študijah ploščatoceličnih kar-cinomov grla z ugotovljeno zelo visoko prevalenco okužbe s HPV (glej prejšnje poglav-
je) menimo, da obstaja velika možnost, da so nekateri od HPV-pozitivnih papilomov požiralnika, odkriti v študiji Odzeja in sodelavcev (80), posledica kontaminacije oz. lažno pozitivni rezultati. Vzroki za to so predvsem:
-	visoka prevalenca okužbe s HPV, ugotovljena v tej študiji, ki ni primerljiva z ostalimi študijami;
-	dokaz prisotnosti za to vrsto novotvorb precej neobičajnih tipov HPV;
-	uporaba samo nespecifičnih postopkov za zmanjševanje možnosti lažnopozitivnih rezultatov.
Podobno kot pri raziskavah karcinoma grla obstaja tudi možnost, da je majhno število HPV-pozitivnih papilomov požiralnika, odkritih v študijah z nizko prevalenčno stopnjo okužbe s HPV, posledica lažno negativnih rezultatov v teh študijah, čeprav je po našem mnenju takšna možnost zelo majhna. V vseh raziskavah z odkrito nizko prevalenčno stopnjo okužbe s HPV (8, 11, 68, 81)so namreč raziskovalci pred pomnoževanjem delcev HPV pomnoževali delce najmanj enega vseprisotnega gena oz. izvajali notranje kontrolno pomnoževanje. Vse tri raziskovalne skupine, vključno z našo, so v študijo uvrstile le vzorce DNA, v katerih je bilo notranje kontrolno pomnoževanje uspešno oz. v katerih ni bilo prisotnih zaviralcev pomnoževanja. Naslednja možnost za nastanek lažno negativnih rezultatov je prisotnost takšnih tipov HPV v tkivnih vzorcih, ki jih z izbranimi začetnimi oligonukleotidi ne moremo zajeti (18). Za zmanjševanje te možnosti so vse tri raziskovalne skupine uporabljale grupno specifične začetne oligonukleotide, ki zajamejo veliko število tipov HPV, med njimi tudi vse, ki so zaenkrat opredeljeni kot pomembni v patologiji človeka. V naši raziskavi smo v ta namen uporabljali dva različna para grupno specifičnih začetnih oligonukleotidov. Z uporabo začetnih oligonukleotidov GP5/GP6, ki pomnožujeta relativno kratek delec DNA HPV (140-150 baznih parov), smo dodatno zmanjšali možnost nastanka lažno negativnih rezultatov zaradi znane, nekoliko slabše učinkovitosti pomnoževanja večjih delcev DNA iz arhivskih tkivnih vzorcev (36). Dodatno so v vseh treh raziskavah za dokazovanje specifičnosti PCR-pridel-ka uporabljali zelo občutljivi in specifični metodi, kot sta hibridizacija po Southernu ali encimsko oligonukleotidni test. Z vsemi navedenimi ukrepi je bila po našem mnenju možnost lažno negativnih rezultatov PCR v vseh treh raziskavah z ugotovljeno nizko pre-valenco okužbe s HPV v papilomih požiralnika zmanjšana na najmanjšo možno mero.
Na osnovi naših rezultatov lahko zaključimo, da okužba s HPV verjetno ni pomembnejši etiološki dejavnik pri vzniku in razvoju ploščatoceličnih papilomov požiralnika. Podobno kot Carr in sodelavci (81) menimo, da občasno odkritje DNA HPV v ploščatoceličnih papilomih požiralnika ni posledica virusne okužbe, ki bi pripeljala do razvoja teh novotvorb, ampak prej naključne kolonizacije ali nedejavne okužbe papilomov, ki so vznik-nili in se razvili pod vplivom drugih, še neznanih etioloških dejavnikov.
Ploščatocelični karcinomi požiralnika in humani virus papiloma
Ploščatocelični karcinom predstavlja 90% vseh malignih novotvorb požiralnika. Polovica teh novotvorb zraste v srednji tretjini požiralnika, 30 % v spodnji in 20 % v zgornji tretjini. Makroskopsko raste karcinom najpogosteje v obliki eksofitične tvorbe, redkeje kot
razpadajoča razjeda ali infiltrativno. Karcinom požiralnika se pogosto hitro razrašča v okolico in zaseva v področne bezgavke (82).
Začetni rak požiralnika je običajno brez kliničnih znamenj. Prvo znamenje karcinoma je pogosto povečana bezgavka na vratu ali nad ključnico. Ko se pojavita prva klinična znaka, oteženo požiranje in hujšanje, je bolezen navadno že razširjena. Bolečina pri poži-ranju se pojavlja pozno in izžareva v hrbet. Pogosta znaka sta tudi regurgitacija in bruhanje. Zaradi prizadetosti in pareze levega n. laryngeus recurrens s posledično paralizo glasilk se pogosto pojavi tudi hripavost. Krvaveče bolezenske spremembe so lahko vzrok za hematemezo ali meleno. Zdravljenje je kirurško z dodatnim obsevanjem in kemoterapijo (83).
Ploščatocelični karcinom požiralnika je novotvorba, za katero je značilna izrazita zemljepisna razporeditev bolezni (82, 83). V večini dežel je incidenca bolezni na 100.000 prebivalcev 2,5-8 pri moških in 1,5-2,5 pri ženskah (84). Nasprotno so številne epidemiološke raziskave pokazale, da je v določenih manjših zemljepisnih področjih, iz dosedaj še nedokončno pojasnjenih razlogov, incidenca te novotvorbe tudi do 500-krat večja od svetovnega povprečja. V ta področja prištevamo: provinco Linxian na Kitajskem, HongKong, področje okoli Kaspijskega jezera v Iranu, Singapur, provinco Transkei v Južnoafriški republiki, ter provinci Calvados in Bas Rhin v Franciji (84). V Sloveniji zboli letno od 70 do 100 ljudi; incidenca znaša 7,3 za moške in 1,7 za ženske (84). Po incidenčni stopnji Slovenijo uvrščamo med dežele s srednjo stopnjo tveganja za razvoj ploščato-celičnega karcinoma pri moških ter z nizko pri ženskah.
Kljub številnim epidemiološkim, eksperimentalnim in kliničnim raziskavam, še posebej v področjih z visoko stopnjo tveganja za razvoj te novotvorbe, etiopatogeneza karcinoma požiralnika do danes še ni povsem znana (82). Domnevajo, da vpliva na nastanek tega tumorja več pomembnih dejavnikov oz. sodejavnikov tveganja (82, 85):
-	kontaminacija hrane z glivami;
-	visoka koncentracija nitritov in nitrozaminov v hrani;
-	pomanjkanje vitaminov A, C, riboflavina, tiamina in piridoksina;
-	pomanjkanje oligoelementov, kot so cink, selen in molibden;
-	kajenje;
-	prekomerno uživanje alkoholnih pijač.
Značilno prehrano v zemljepisnih območjih, kjer je karcinom požiralnika zelo pogost, sestavljajo predvsem maščobe ter malo sveže zelenjave in sadja. Pri takšni prehrani organizmu primanjkuje številnih vitaminov in oligoelementov in prav to pomanjkanje naj bi bil najbolj pomemben dejavnik tveganja za razvoj karcinoma požiralnika. V omenjenih deželah, še posebej na Kitajskem in v Iranu, je pogost tudi kronični nerefluksni ezo-fagitis, ki sčasoma preko atrofije in različnih stopenj displazije preide v karcinom (85).
Opisanega hipotetičnega modela razvoja karcinoma požiralnika ne zasledimo v območjih z nizko incidenco te novotvorbe. Tu se karcinom požiralnika razvije pogosteje pri bolnikih z ahalazijo, brazgotinami po kavstičnih poškodbah in divertiklih požiralnika ter pri kadilcih in osebah, ki uživajo alkoholne pijače v prekomernih količinah. Etanol in kajenje v karcinogenezi verjetno delujeta sinergistično (86). Nitrozamini, osamljeni iz toba-
ka, so najmočnejši karcinogeneni za sluznico požiralnika. Natančen mehanizem karci-nogenega delovanja etanola še ni jasen, domnevajo pa, da je le-ta verjetno le sodejav-nik, ki spodbuja delovanje drugih karcinogenov in ne samostojen karcinogen. Nekateri raziskovalci so mnenja, da etanol samo povečuje prepustnost epitelija požiralnika za druge karcinogene kot so npr. nitrozamini iz tobačnega dima (85, 86).
Med pomembnejšimi dejavniki, ki jih v zadnjem času vse bolj omenjajo v etiopatogene-zi ploščatoceličnega karcinoma požiralnika (še posebej v področjih z visoko incidenco teh novotvorb), je okužba z določenimi tipi HPV. Okužbo s HPV je kot možen karcino-geni dejavnik v etiopatogenezi karcinomov požiralnika prvič omenil Syrjanen leta 1982 (87), ko je opisal histološke spremembe, značilne za to okužbo, v 24 od 60 pregledanih tkivnih vzorcev teh novotvorb. Kasneje je uspelo raziskovalcem iz različnih delov sveta z uporabo imunohistokemičnih in hibridizacijskih metod ter PCR v 0-71 % pregledanih tkivnih vzorcev dokazati prisotnost antigenov HPV ali DNA HPV (tabela 4). Tako veliko razliko v prevalenci okužbe s HPV razlagamo s tem, da so bile raziskave opravljene na populacijah z zelo različno stopnjo tveganja za nastanek karcinoma požiralnika in z uporabo različnih metod za odkrivanje okužbe s HPV. Čeprav so si rezultati dosedanjih raziskav povezave med okužbo s HPV in nastankom karcinoma požiralnika (tabela 4) na prvi pogled nasprotujoči, lahko z njihovo natančno analizo domnevamo, da je prevalenca dokazane okužbe s HPV v karcinomih požiralnika v določeni populaciji sorazmerna incidenčni stopnji karcinoma požiralnika v tej populaciji. Tako se prevalenca dokazane okužbe s HPV v tkivnih vzorcih karcinomov požiralnika v raziskavah, opravljenih v nekaterih področjih z visoko incidenčno stopnjo te novotvorbe (provinca Linxian na Kitajskem (92, 99), provinca Transkei v Južnoafriški republiki (95), provinci Calvados in Bas Rhin v Franciji (96), jugovzhodna Koreja (94)) giblje med 24 in 71 %. Nasprotno v večini študij iz dežel z nizko incidenčno stopnjo karcinoma požiralnika (Avstralija (89), ZDA - populacija belcev (38, 90), Japonska (97), Anglija (98), Švedska (101)) raziskovalcem ni uspelo dokazati okužbe s HPV v niti enem tkivnem vzorcu karcinoma požiralnika (38, 89, 90, 98, 101) ali le v posameznih primerih te novotvorbe (97). Edina izjema med temi raziskavami je študija Lokeja in sod. (93), v kateri raziskovalcem ni uspelo dokazati okužbe s HPV v niti enem od 37 pregledanih karcinomov požiralnika, čeprav so bili le-ti odvzeti bolnikom iz Hong-Konga, ki je znan kot področje z izredno visoko incidenčno stopnjo te novotvorbe. Rezultate te raziskave lahko razložimo z relativno nižjo občutljivostjo metod, ki so jih uporabljali za dokazovanje okužbe s HPV (ISH, dot-blot). Omenjene metode v času, ko je bila raziskava opravljena (1988-1989) tudi še niso bile dokončno izpopolnjene. Prav tako je mogoče, da je bila študija opravljena na populaciji angleških priseljencev in ne na domači populaciji (navedeni populaciji imata namreč popolnoma različne incidenčne stopnje te novotvorbe), kar na žalost ni posebej opredeljeno v objavi.
Z našo raziskavo smo želeli z uporabo visoko občutljivih metod preveriti domnevo, ali je okužba s HPV pomemben etiološki dejavnik pri nastanku karcinoma požiralnika tudi v srednje rizični populaciji, kot je slovenska (7).
V raziskavo smo vključili 28 arhivskih tkivnih vzorcev, fiksiranih v formalinu in vklopljenih v parafin, odvzetih 27 bolnikom, ki so se zdravili na Kliniki za torakalno kirurgijo v Ljub-
Tabela 4. Pregled vseh pomembnejših raziskav okužbe s humanimi virusi papiloma v ploščatoceličnih kar-cinomih požiralnika. IHC — imunohistokemične metode, PCR — verižna reakcija s polimerazo, SB — hibri-dizacija po Southernu, ISH — hibridizacija in situ.
Raziskovalna	Leto
skupina
Področje raziskave
Število Metode uporabljene za Rezultati primerov dokazovanje okužbe s HPV raziskave
Syrjanen (87)	1982
Hille in sod. (88)	1985
Kulski in sod. (89)	1986
Kiyabu in sod. (90)	1989
Mori in sod. (91)	1989
Brandsma in	1989 sod. (38)
Chang in sod. (92)	1990
Loke in sod. (93)	1990
Kim in sod. (94)	1991
Williamson	1991 in sod. (95)
Benamouzig	1992 in sod. (96)
Toh in sod. (97)	1992
Ashworth	1993 in sod. (98)
Chang in sod. (99)	1993
Poljak in Cerar (7) 1993
Togawa	1994
in sod. (100)
Lewensohn	1994
in sod. (101)
Švedska 60
JAR
ZDA
24
Avstralija 120 ZDA	13
Kitajska 46
12
Kitajska	51
Hong-Kong	37
Koreja	24
JAR	14
Francija	12
Japonska	45
Anglija	10
Kitajska	363
Slovenija	20
veS dežel	72
Švedska	10
histologija histologija IHC
PCR; tipa 16 in 18 IHC
SB; tipi 11,16,18 ISH; tipi 6,11,16,18
ISH, dot-blot; tipi 6/11,16/18
PCR; tipa 16 in 18 PCR
ISH in dot-blot; tipi 6,11,16,18,31,33
PCR ISH; tipi
6/11,16/18,31/33/35
ISH z mešanico HPV-sond in hibridiza-cijo v pogojih nizke strogosti
ISH; tipi 6/11, 16/18,31/33/51 in PCR
PCR PCR
značilne morfološke spremembe dokazane v 24/60 karcinomov
značilne
morfološke spremembe dokazane v 8/24 karcinomov
L1 beljakovina ni dokazana
DNA HPV ni dokazana
L1 beljakov. dokazana v 8/46 karcinomov
DNA HPV ni dokazana
HPV tip 6 dokazan v 3/51, tip 11 v 3/51, tipa 16 in 18 v 16/51 karcinomov
DNA HPV ni dokazana
HPV tip 16 dokazan v 16/24 karcinomov
DNA HPV dokazana v 10/14 karcinomov
HPV tipa 16 in 18 dok. v 5/12 karcinomov
HPV tipa 16 in 18 dok. v 3/45 karcinomov
DNA HPV ni dokazana
HPV 6 in 11 dokazana v 6/363, tipa 16 in 18 v 18/363, tip 30 v 5/363 in neopredeljeni tipi v 59/363 karcinomov
HPV tip 16 dokazan v 2/20 karcinomov
DNA HPV dokazana v 10/72 karcinomov
DNA HPV ni dokazana
ljani v obdobju od leta 1985 do 1992. Bolniki, vključeni v raziskavo, so bili izbrani naključno. Najmlajši bolnik je bil v času študije star 47, najstarejši pa 76 let. Povprečna starost bolnikov je bila 60,2 let. Vsi bolniki, vključeni v raziskavo, so bili moški.
Histopatološko smo 5 tkivnih vzorcev opredelili kot dobro diferencirani, 17 vzorcev kot srednje diferencirani in 6 vzorcev kot slabo diferencirani ploščatocelični karcinom požiralnika. Štiri tumorske tkivne vzorce smo opredelili kot zgodnje karcinome (rakaste celice vidne samo v submukozi), ostalih 24 vzorcev pa kot napredovale karcinome (viden vdor rakastih celic skozi lamino muskularis proprijo v lamino adventicijo ter v nekaterih primerih v mezgovnice in žilje).
Z ISH nismo uspeli dokazati okužbe s HPV v niti enem od pregledanih 28 ploščatoce-ličnih karcinomov požiralnika. S PCR z grupno specifičnimi začetnimi oligonukleotidi MY09 in MY11 smo dokazali okužbo s HPV v dveh tkivnih vzorcih ploščatoceličnih karcinomov požiralnika. Prvi HPV-pozitivni tkivni vzorec je bil zgodnji karcinom, drugi pa napredovali karcinom požiralnika. Za opredelitev HPV-tipa v obeh pozitivnih vzorcih ploščatoceličnih karcinomov požiralnika smo uporabili metodo encimske razgradnje PCR-pridelka MY09/MY11 in encimsko oligonukleotidni test. Obe metodi sta pokazali prisotnost HPV-tipa 16 v obeh tkivnih vzorcih karcinomov požiralnika. Delce beta-globinske-ga gena smo uspešno pomnožili z uporabo začetnih oligonukleotidov GH20/PC04 in KM29/RS42 iz vseh 28 tkivnih vzorcev ploščatoceličnih karcinomov požiralnika.
V naši raziskavi, ki je bila prva, narejena na populaciji s srednjo stopnjo tveganja za nastanek karcinoma požiralnika (v raziskavo so bili vključeni samo moški bolniki), nam je, kljub uporabi visoko občutljivih metod, uspelo dokazati okužbo s HPV le v 2 od 28 (7,1 %) pregledanih tkivnih vzorcev teh novotvorb (7, 16). Ugotovljena prevalenca okužbe s HPV je pri slovenskih bolnikih s ploščatoceličnim karcinomom požiralnika nekje med prevalenco okužbe v področjih z visoko in tisto v področjih z nizko stopnjo tveganja. Zato lahko zaključimo, da rezultati naše študije potrjujejo upravičenost domneve o premo-sorazmernem odnosu med prevalenco okužbe s HPV v karcinomih požiralnika v določeni populaciji in incidenčno stopnjo omenjenega karcinoma v tej populaciji.
Če je navedena domneva pravilna, lahko na osnovi rezultatov dosedanjih raziskav zaključimo, da je okužba z določenimi tipi HPV mogoče eden od tistih karcinogenih dejavnikov, ki v sodelovanju z ostalimi dejavniki odločujoče vpliva na pogostejši pojav teh novotvorb v določenih manjših področjih sveta.
Literatura
1.	van Ranst MA, Tachezy R, Delius H, Burk RD. Taxonomy of the human papillomaviruses. Papillomavirus Res 1993; 4: 61-5.
2.	Uršič-Vrščaj M, Poljak M. Voznik ali sopotnik? Pomen okužbe s humanimi virusi papiloma v etiolo-giji nekaterih novotvorb pri človeku. Zdrav Vestn 1995; 64: 223-8.
3.	Crum CP. Genital papillomaviruses and related neoplasms: causation, diagnosis and classification. Mod Pathol 1994; 7: 138-45.
4.	Laimins LA. The biology of human papillomaviruses: from warts to cancer. Infect Agents Dis 1993; 2: 74-86.
5.	Poljak M, Gale N, Ferluga D, Kambič V. Etiology of laryngeal papillomatosis. Il Friuli Medico 1992; 47: 461-2.
6.	Poljak M, Ferluga D, Gale N, Petrovec M. Molekularna diagnostika okužbe s humanim virusom papiloma (HVP) v patologiji. Zdrav Vestn 1993; 62: 105-9.
7.	Poljak M, Cerar A. Human papillomavirus type 16 DNA in oesophageal squamous cell carcinoma. Anticancer Res 1993; 13: 2113-6.
8.	Poljak M, Cerar A. Detection of human papilloma virus type 6 DNA in an esophageal squamous cell papilloma. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1994; 13: 188-9.
9.	Poljak M, Barlic J. Rapid and simple method for extraction of DNA from archival Papanicolaou stained cervical smears. Acta Cytol (v tisku).
10.	Poljak M, Barlic J, Seme K, Avsic-Zupanc T, Zore A. Isolation of DNA from archival Papanicolaou stained cytological smears using a simple salting-out procedure. J Clin Pathol: Mol Pathol 1995; 48: M55-6.
11.	Poljak M, Orlowska J, Cerar A. Human papillomavirus infection in esophageal squamous cell papillomas: a study of 29 lesions. Anticancer Res 1995; 15: 965-70.
12.	Gale N, Poljak M, Kambic V, Ferluga D, Fischinger J. Laryngeal papillomatosis: molecular, histopathologic, and clinical evaluation. Virchows Arch 1994; 425: 291-5.
13.	Kambic V, Gale N. Epithelial hyperplastic lesions of the larynx. Amsterdam: Elsevier, 1995.
14.	Poljak M, Seme K. Rapid detection and typing of human papillomaviruses by consensus polymerase chain reaction and enzyme-linked immunosorbent assay. J Virol Methods (v tisku).
15.	Gale N, Poljak M, Kambic V, Zidar N, Cor A. Preneoplastic epithelial lesions of the larynx. Semin Diagn Pathol (v tisku).
16.	Poljak M. Pomen okužbe s humanimi virusi papiloma v etiopatogenezi epitelijskih novotvorb grla in požiralnika. Doktorska naloga. Ljubljana: Medicinska fakulteta, 1995.
17.	Bockstahler LE. Overview of international PCR standardization efforts. PCR Methods Applic 1993; 3: 263-7.
18.	Poljak M, Avsic-Zupanc T, Seme K. Verižna reakcija s polimerazo - nova raziskovalna in diagnostična metoda v virologiji. Med Razgl 1994; 33: 379-400.
19.	Bernard H-U, Chan S-Y, Manos MM et al. Identification and assessment of known and novel human papillomaviruses by polymerase chain reaction amplification, restriction fragment lenth polymorphisms, nucleotide sequence, and phylogenetic algorithms. J Infect Dis 1994; 170: 1077-85.
20.	Resnick RM, Cornelissen MT, Wright DK et al. Detection and typing of human papillomavirus in archival cervical cancer specimens by DNA amplification with consensus primers. J Natl Cancer Inst 1990; 82: 1477-84.
21.	Longo MC, Berninger MS, Hartley JL. Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions. Gene 1990; 93: 125-8.
22.	Kambic V. Otorinolaringologija. Ljubljana: Mladinska knjiga, 1984: 165-70.
23.	Ullman EV. On the aetiology of laryngeal papilloma. Acta Otolaryngol 1928; 5: 317-38.
24.	Svoboda DJ, Kirchner FR, Provd GO. Electron microscopic study of human laryngeal papillomatosis. Cancer Res 1963; 23: 1084-9.
25.	Stephens CB, Arnold GE, Butchko GM, Hardy CL. Autogenous vaccine treatment of juvenile laryngeal papillomatosis. Laryngoscope 1979; 89: 1689-96.
26.	Boyle WF, Riggs JL, Oshiro LS, Lennette EH. Electron microscopic identification of PAPOVA virus in laryngeal papillomata. Laryngoscope 1978; 83: 1102-8.
27.	Spoendlin M, Kistler O. Papovavirus in laryngeal papilloma. Arch Otorhinolaryngol 1978; 218: 289-92.
28.	Braun L, Kashima H, Eggleston J, Shah K. Demonstration of papillomavirus antigen in paraffin sections of laryngeal papillomas. Laryngoscope 1982; 92: 640-3.
29.	Costa J, Howley PM, Bowling MC, et al. Presence of human papilloma viral antigens in juvenile multiple laryngeal papilloma. Am J Clin Pathol 1981; 75: 194-7.
30.	Terry RM, Lewis FA, Griffiths S, Wells M, Bird CC. Demonstration of human papillomavirus types 6 and 11 in juvenile laryngeal papillomatosis by in situ DNA hybridization. J Pathol 1987; 153: 245-8.
31.	Corbitt G, Zarod AP, Arrand JR, Longson M, Farrington WT. Human papillomavirus (HPV) genotypes associated with laryngeal papilloma. J Clin Pathol 1988; 41: 284-8.
32.	Terry RM, Lewis FA, Robertson S, Blythe D, Wells M. Juvenile and adult laryngeal papillomata: classification by in situ hybridization for human papillomavirus. Clin Otolaryngol 1989; 14: 135-9.
33.	Quiney RE, Wells M, Lewis FA, Terry RM, Michaels L, Croft CB. Laryngeal papillomatosis: correlation between severity of disease and presence of HPV 6 and 11 detected by in situ DNA hybridisation. J Clin Pathol 1989; 42: 694-8.
34.	Tsutsumi K, Nakajima T, Gotoh M, Shimosato Y, Tsunokawa Y, Terada M, Ebihara S, Ono I. In situ hybridization and immunohistochemical study of human papillomavirus infection in adult laryngeal papillomas. Laryngoscope 1989; 99: 80-5.
35.	Levi JE, Delcelo R, Alberti VN, Torloni H, Villa LL. Human papillomavirus DNA in respiratory papillomatosis detected by in situ hybridization and the polymerase chain reaction. Am J Pathol 1989; 135: 1179-84.
36.	Greer CE, Wheeler CM, Manos MM. Sample preparation and PCR amplification from paraffin-embedded tissues. PCR Methods Applic 1994; 3: S113-22.
37.	Lindeberg H, Johansen L. The presence of human papillomavirus (HPV) in solitary adult laryngeal papillomas demonstrated by in situ DNA hybridization with sulphonated probes. Clin Otolaryngol 1990; 15: 367-71.
38.	Brandsma JL, Abramson AL. Association of papillomavirus with cancers of the head and neck. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 1989; 115: 621-5.
39.	Dickens P, Srivastava G, Loong Loke S, Larkin S. Human papillomavirus 6, 11, and 16 in laryngeal papillomas. J Pathol 1991; 165: 243-6.
40.	Rimell F, Maisel R, Dayton V. In situ hybridization and laryngeal papillomas. Ann Otol Rhinol Laryn-gol 1992; 101: 119-26.
41.	Arndt O, Zeise K, Bauer I, Brock J. Der nachweis humaner Papillomviren (HPV) in Larynxpapillo-men. Eine in situ hybridisierungsstudie. Laryngorhinootologie 1992; 71: 132-6.
42.	Shunmugarathnam K, Sobin LH. Histological typing of tumours of the upper respiratory tract and ear. Heidelberg: Springer, 1991: 20-1.
43.	Lindeberg H, Oster S, Oxlund I, Elbrond O. Laryngeal papillomas: classification and course. Clin Otolaryngol 1986; 11: 423-9.
44.	Kambic V, Lenart I. Notre classification des hyperplasies de l'epithelium du larynx au point de vue pronostic. JFORL 1971; 20: 1145-50.
45.	Chang F, Wang L, Syrjanen S, Syrjanen K. Human papillomavirus infections in the respiratory tract. Am J Otolaryngol 1992; 13: 210-25.
46.	Lindeberg H, Elbrond O. Laryngeal papillomas: clinical aspects in a series of 231 patients. Clin Otolaryngol 1989; 14: 333-42.
47.	Kambic V, Gale N. Significance of keratosis and dyskeratosis for classifying hyperplastic aberrations of laryngeal mucosa. Am J Otolaryngol 1986; 7: 323-33.
48.	Kambic V, Gale N, Ferluga D. Laryngeal hyperplastic lesions, follow-up study and application of lec-tins and anticytokeratins for their evaluation. Pathol Res Pract 1992; 188: 1067-77.
49.	Kambic V, Gale N, Ferluga D, Fischinger J, Cör A. Die Bedeutung der immunhistochemischen und histochemischen Methoden zur Klassifizierung der hyperplastischen Aberrationen der Kehlkopfschleimhaut. GBK. Fortbildung aktuell 1993; 63: 29-34.
50.	Kambic V, Gale N, Fischinger J. Local immune response in hyperplastic lesions of the larynx. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec 1994; 56: 217-23.
51.	Rihkanen H, Peltomaa J, Syrjanen S. Prevalence of human papillomavirus DNA in vocal cords without laryngeal papillomas. Acta Otolaryngol 1994; 114: 348-51.
52.	Kahn T, Schwarz E, zur Hausen H. Molecular cloning and characterization of the DNA of a new human papillomavirus (HPV 30) from a laryngeal carcinoma. Int J Cancer 1986; 37: 61-5.
53.	Scheurlen W, Stremlau A, Gissmann L, Hohn D, Zenner HP, zur Hausen H. Rearranged HPV 16 molecules in an anal and in a laryngeal carcinoma. Int J Cancer 1986; 38: 671-6.
54.	Stremlau A, Zenner HP, Gissmann L, zur Hausen H. Nachweis und Organisationsstruktur der DNS menschlicher Papillomviren beim Kehlkopf und Hypopharynxkarzinom. Laryngorhinootologie 1987; 66: 311-5.
55.	Syrjanen S, Syrjanen K, Mantyjarvi R, Collan Y, Karja J. Human papillomavirus DNA in squamous cell carcinomas of larynx demonstrated by in situ hybridization. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec 1987; 49: 175-86.
56.	Zarod AP, Rutherford JD, Corbitt G. Malignant progression of laryngeal papilloma associated with human papilloma virus type 6 (HPV 6) DNA. J Clin Pathol 1988; 41: 280-3.
57.	Kiyabu MT, Shibata D, Arnheim N, John Martin W, Fitzgibbons PL. Detection of human papillomavirus in formalin-fixed, invasive squamous carcinomas using the polymerase chain reaction. Am J Surg Pathol 1989; 13: 221-4.
58.	Lindeberg H, Syrjanen S, Syrjanen K. Human papillomavirus type 11 DNA in squamous cell carcinomas and pre-existing multiple laryngeal papillomas. Acta Otolaryngol 1989; 107: 141-9.
59.	Hoshikawa T, Nakajima T, Uhara H, et al. Detection of human papillomavirus DNA in laryngeal squamous cell carcinomas by polymerase chain reaction. Layngoscope 1990; 100: 647-50.
60.	Perez-Ayala M, Ruiz-Cabello F, Esteban F, et al. Presence of HPV 16 sequences in laryngeal carcinomas. Int J Cancer 1990; 46: 8-11.
61.	Somers KD, Cartwright SL, Schechter GL. Human papillomavirus DNA in squamous cell carcinoma of the larynx and tongue. Proc Ann Meet Am Assoc Cancer Res 1990; 31: A1932.
62.	Watts SL, Brewer EE, Fry TL. Human papillomavirus DNA types in squamous cell carcinomas of the head and neck. Oral Surg Oral Med Oral Pathol 1991; 71: 701-7.
63.	Brandwein MS, Nuovo GJ, Biller H. Analysis of prevalence of human papillomavirus in laryngeal carcinomas. Study of 40 cases using polymerase chain reaction and consensus primers. Ann Otol Rhinol Laryngol 1993; 102: 309-13.
64.	Clayman GL, Stewart MG, Weber RS, El-Naggar AK, Grimm EA. Human papillomavirus in laryngeal and hypopharyngeal carcinomas. Relationship to survival. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 1994; 120: 743-8.
65.	Simon M, Kahn T, Schneider A, Pirsig W. Laryngeal carcinoma in a 12 year old child. Association with human papillomavirus 18 and 33. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 1994; 120: 277-82.
66.	Quitadamo M, Benson J. Squamous papilloma of the esophagus: a case report and review of the literature. Am J Gastroenterol 1988; 83: 194-201.
67.	Orlowska J, Jarosz D, Gugulski A, Pachlewski J, Butruk E. Sqamous cell papillomas of the esophagus: report of 20 cases and literature review. Am J Gastroenterol 1994; 89: 434-7.
68.	Chang F, Janatuinen E, Pikkarainen P, Syrjanen S, Syrjanen K. Esophageal squamous cell papillomas: Failure to detect human papillomavirus DNA by in situ hybridization and polymerase chain reaction. Scand J Gastroenterol 1991; 26: 535-43.
69.	Syrjanen K, Pyrhonen S, Aukee S, Koskela E. Squamous cell papilloma of the esophagus: a tumor probably caused by human papilloma virus. Diagn Histopathol 1982; 5: 291-6.
70.	Colina F, Solis JA, Munoz MT. Squamous papilloma of the esophagus. A report of three cases and review of the literature. Am J Gastroenterol 1980; 74: 410-4.
71.	Lesec G, Gogusev J, Fermaud H, Gorce D, Lemaitre JP, Verdier A. Presence of papilloma group viral antigen in an esophageal papilloma in man. Gastroenterol Clin Biol 1985; 9: 166-8.
72.	Toet AE, Dekker W, Odo Op den Orth J, Blok P. Squamous cell papilloma of the esophagus: Report of four cases. Gastrointest Endosc 1985; 31: 77-9.
73.	Winkler B, Capo V, Reumann W, et al. Human papillomavirus infection of the esophagus. Cancer 1985; 55: 149-55.
74.	Sablich R, Benedetti G, Bugnucolo S, Serraino D. Squamous cell papiloma of the esophagus. Report on 35 endoscopic cases. Endoscopy 1988; 20: 5-7.
75.	Hording M, Hording U, Daugaard S, Norrild B, Faber V. Human papilloma virus type 11 in a fatal case of esophageal and bronchial papillomatosis. Scand J Infect Dis 1989; 21: 229-31.
76.	Janson JA, Baillie J, Pollock M. Endoscopic removal of esophageal condylomata acuminatum containing human papilloma virus. Gastrointest Endosc 1991; 37: 367-9.
77.	Fontolliet C, Hurlimann J, Monnier P, Ollyo B, Levi F, Savary M. Le papillome de l'oesophage est-il une lesion preneoplastique? Etude de 33 cas. Schweiz Med Wochenschr 1991; 121: 754-7.
78.	van Cutsem E, Geboes K, Visser L et al. Squamous papillomatosis of the oesophagus with malignant degeneration and demonstration of the human papillomavirus. Eur J Gastroenterol Hepatol 1991; 3: 561-6.
79.	Politoske EJ. Squamous cell papilloma of the esophagus associated with the human papillomavirus. Gastroenterology 1992; 102: 668-73.
80.	Odze R, Antonioli D, Shocket D, Noble-Topham S, Goldman H, Upton M. Esophageal squamous papillomas. A clinicopathologic study of 38 lesions and analysis for human papillomavirus by the polymerase chain reaction. Am J Surg Pathol 1993; 17: 803-12.
81.	Carr NJ, Bratthauer GL, Lichy JH, Taubenberger JK, Monihan JM, Sobin LH. Squamous cell papillomas of the esophagus: a study of 23 lesions for human papillomavirus by in situ hybridization and the polymerase chain reaction. Hum Pathol 1994; 25: 536-40.
82.	Blot JW. Esophageal cancer trends and risk factors. Semin Oncol 1994; 21: 403-10.
83.	Markovič S. Tumorji požiralnika. In: Kocijančič A, Varl B, eds. Interna medicina. Ljubljana: DZS, 1993:351.
84.	Whelan SL, Parkin DM, Masuyer E. Patterns of cancer in five continents — IARC Scientific Publications No. 102. Lyon: International Agency for Research on Cancer, 1990: 14-104.
85.	Jaskiewicz K. Oesophageal carcinoma: cytopathology and nutritional aspects in aetiology. Anticancer Res 1991, 9: 1847-52.
86.	Yu MC, Garabrant DH, Peters JM, Mack TM. Tobacco, alcohol, diet, occupation, and carcinoma of the esophagus. Cancer Res 1988; 48: 3843-8.
87.	Syrjanen K. Histological changes identical to those of condylomatous lesions found in esophageal squamous cell carcinomas. Arch Geschwulstforsch 1982; 52: 283-92.
88.	Hille JJ, Markowitz S, Margolius KA, et al. Human papillomavirus and carcinoma of the esophagus. N Engl J Med 1985; 312: 1707.
89.	Kulski J, Demeter T, Sterett GF, Shilkin KB. Human papillomavirus DNA in oesophageal carcinoma. Lancet 1986; ii: 683-4.
90.	Kiyabu MT, Shibata D, Arnheim N, John Martin W, Fitzgibbons PL. Detection of human papillomavirus in formalin-fixed, invasive squamous carcinomas using the polymerase chain reaction. Am J Surg Pathol 1989; 13: 221-4.
91.	Mori M, Shimono R, Inoue T, Kuwano H, Sugimachi K, Zhang RG. Papillomavirus and oesophageal cancer in the Japanese and Chinese. Am J Gastroenterol 1989; 84: 1126-7.
92.	Chang F, Syrjanen S, Shen Q, Ji H, Syrjanen K. Human papillomavirus DNA in esophageal precancer lesions and squamous cell carcinomas from China. Int J Cancer 1990; 45: 21-5.
93.	Loke SL, Ma L, Wong M, Srivastava G, Lo I, Bird CC. Human papillomavirus in oesophageal squa-mous cell carcinoma. J Clin Pathol 1990; 43: 909-12.
94.	Kim WH, Song SY, Kang JK, Park IS, Choi HJ. Detection of human papillomavirus DNA from esophageal cancer tissue using the polymerase chain reaction. Gastroenterology 1991; 100: 375.
95.	Williamson AL, Jaskiewicz K, Gunning A. The detection of human papillomavirus in oesophageal lesions. Anticancer Res 1991; 11: 263-6.
96.	Benamouzig R, Pigot F, Quiroga G, et al. Human papillomavirus infection in esophageal squamous-cell carcinoma in western countries. Int J Cancer 1992; 50: 549-52.
97.	Toh Y, Kuwano H, Tanaka S, Baba K, Matsuda H, Sugimacki K, Mori R. Detection of human papillomavirus DNA in esophageal carcinoma in Japan by polymerase chain reaction. Cancer 1992; 70: 2334-8.
98.	Ashworth MT, McDicken IW, Southern SA, Nash JRG. Human papillomavirus in squamous cell carcinoma of the oesophagus associated with tylosis. J Clin Pathol 1993; 46: 573-5.
99.	Chang F, Syrjanen S, Shen Q, Wang l, Syrjanen K. Screening for human papillomavirus infections in esophageal squamous cell carcinomas by in situ hybridization. Cancer 1993; 72: 2525-30.
100.	Togawa K, Jaskiewicz K, Takahashi H, Meltzer SJ, Rustgi AK. Human papillomavirus DNA sequences in esophagus squamous cell carcinoma. Gastroenterology 1994; 107: 128-36.
101.	Lewensohn-Fuchs I, Munck-Wikland E, Berke Z, et al. Involvement of aberrant p53 expression and human papillomavirus in carcinoma of the head, neck and esophagus. Anticancer Res 1994; 14: 1281-6.
Prispelo 20.9.1995