izvirno znanstveno delo UDK 665.327.3-543-061 TOKOFERO U V OLJČNI H OLJiH SLOVENSKE iSTRE V TREH ZAPOREDNI H LETIH Bojan BUTINAR ZRS, Si-6000 Koper, Garibalciijeva 18, E-msii: Bojan.Bittinar@zrs-kp.si Milena 8UČAR-MIKLA VČIČ LABS, 6310 izoia, Zelena ulica 8, L-maii: Milena.Miklavcic@guest.arnes.si Darinka ČALIJA LABS, Si-6310 Jzola, Zelena ulica 8, IZVLEČEK Antioksidanti so spojine, ki oljčna olja (OO) varujejo pred staranjem. Vitamin E je antioksidant, ki se predvsem v obliki a-tokoferola pojavlja v ekstra deviških OO. Rezultati analiz vsebnosti skupnih tokoferolov (ST) v OO slovenske Istre (letniki 1995, 1996 in 1997) so 3,18 mg/100 g; 6,73 mg/100 g in 4,09 mg/100 g. Pri treh vzorcih OO letnika 1995, pri katerih smo raziskovati vpliv neustreznega skladiščenja na vsebnost ST, je vsebnost le-teh padla pod 1 mg/100 g. Ključne besede: antioksidanti, hidroksitirosol, oljčno olje, polifenoli, tirosol LiVO D ranjem" (deterioracijo in razpadom). Olje je zaščiteno pred oksidacijo vse dotlej, dokler je v njem še kaj Znano je, da ekstra deviška oljčna olja vsebujejo antioksidantov. Najvažnejši dejavnik, ki vpliva na vseb­precej visok delež tako imenovanih neumiijivih sesta- nost vitamina E, je prav gotova sorta, potem pa sledijo vin, takih, ki ne spadajo k triacilglicerolom. Vse te klimatske razmere v času dozorevanja plodov ter seveda spojine olja senzorično bogatijo - dajejo jim aromo. Še način predelave in skladiščenja. Na si. 1 je kemijska posebej zanimivi so vitamin E in (polijfenoii, saj so ie-ti formula homologa vitamina E, a-tokoferola. antioksidanti, spojine torej, ki olje varujejo pred "sta- Sl. 1:3D kemijska formula homologa vitamina E a-tokoferola. Fig. 1:3D structural formula ofa homologue of vitamina E a-tocopherol. Bojan fJUTINAR mat: TOKOFEROLI V OLJČNIH OlJiK SLOVENSKE !STRE V TREH ZAPOREDNIH LETtH, 37-16 PREGLED DOSEDANJIH OBJAV Poznanih je osem naravnih substanc, ki jih gene-rično imenujemo vitamin E. Kemijsko jih delimo v sku­pini tokotrienolov in tokoferoiov. Tokoferoii in tokotri­enoli (s skupnim imenom tokoli) so visokomolekularnt ciklični alkoholi. Tokoferoii in tokotrienoli združujejo a, ß, y in 6 ho­mologe. SI. 2 prikazuje njihove strukture. TOKOFEROL ! R i R3 a - tokoferol CH , CH , CH 2 [CH 2 CH ? CH(CH,)CH 2 } 3 H ß - tokoferol CH , H CH2[CH2CH2CH P > y > 8. Pri povišanih temperaturah {50-100°C) pa se antioksi­dativna moč obrne: a > p > y. 8 tokoferol je biološko daleč najbolj zastopan tokolni homolog - njegova biološka aktivnost je dvakrat večja od P in 5 homologov ter 100 krat večja od y homologa (Madhavi et a!., 1996). Omenili smo, da tokoli olja varujejo pred staranjem ­pred razpadom in deterioracijo. E.den izmed glavnih razlogov za deterioracijo olja sta encimatski in oksi­dacijski proces. Tokoli preprečujejo oksidacijo olj in lipidnih sestavin v živilih tako, da kot antioksidanti preprečujejo avtooksidacijo in fotooksigenacijo. Avtooksidacija Avtooksidacija je vrsta radikalske substitucijske reak­cije, ki je shematsko ponazorjena na si. 3. LH— > L® INiCiACIJA (nastanek prostega radikala) L ® + 0 2 -» L0 2 ® REAKCIJA RADIKALA S KISIKOM L0 2 * + L H --> L ® + LOO H PROPAGACIJA L0 2 ® + L —> E * + LOO H REAKCIJA Z ANTIOKSID A NTO M E® + E® —> E-E; L® + L®—> L-L TERMINACIjA L H - maščobna kislina, L® - maščobnokislinski radikal, L0 2 ® - peroksi radikal, E - tokoferol, LOO H - hidro­peroksid SI. 3: Radikalski mehanizem avtoksidacijske reakcije v oljih (Deshpande et al., 1996). Fig. 3: Radical reaction mechanism of the autooxi­dation reaction in oils (Deshpande et al.f 1996). V živih tkivih -v celičnih membranah - pa avto­oksidacijsko verigo tvori Še regeneracijska stopnja to­koferola (Deshpande etal., 1996): REGENERACIJA E * + C —* L + C * C - askorbmska kislina C ® +NADP H —-> C + NAD P GS H - reducirani glutation 4- 2GS H F + GSS G GSS G - glutation dtsulfid GSS G + NADPM —» NAD P + 2CS H Hitrost reakcije avtooksidacije in podrobna struktura nastalih hidroperoksidov sta v veliki meri odvisna od resonančno stabiliziranega alilnega radikala L s , ki na­stane iz nenasičene kisline LH. Podrobna geneza inicializacijskega koraka še ni po­polnoma pojasnjena, čeprav je znano, da ga favorizirajo ustrezni radikali, e.g. taki, ki nastajajo s kovinsko ka­taliziranim razpadom predhodno nastalih hidropero­ksidov. Predhodno nastali hidroperoksidi so lahko produkt te iste avtooksidacije oziroma so nastali s fotooksigenacijo, ki pa jo favorizirajo sledovi pigmentov v olju, npr. klorofil. Vidimo torej, da lahko reakcijo avtooksidacije Sojs n SUT1NAR elal.: TOKOFEROLI V OLJČNIH OUIH SLOVENSKE ISTRE V TREH ZAPOREDNIH LETIH, 37-4 6 znatno zavremo, če poskrbimo, da je koncentracija procese, oziroma tako, da z L H tekmujejo za reakcijo z kovin, v glavnem železa in bakra, minimalna. LO2®, pri čemer se tvori veliko bolj stabilni LOO H Antioksidanti pa lahko preprečujejo reakcijo avto- {Cuppett et. al., 1997). Ta proces ponazarjajo reakcije s oksidacije tako, da favorizirajo radikahke terminacijske s). 4. procese in s tem seveda skrajšujejo propagacijske 2H H,O 16n33 Cl6M33 HnO 2H B LOOH LO O LOOH LOO H3c H, C 16^33 C16H33 Si. 4: Oksidacija a-tokoferola (A) v a-tokoferif kinon (B) prek semikinonskih intermediatov (C, D) (Cuppett et al., 1997). Fig. 4: a-tocopherof (A) oxidation to OL-tocopheryi quinone (8) through semiquinone intermediates (C, D) (Cuppett et al., 1997). Fotooksigenacija oij klorofil, jasno je, da ta reakcija uspešno poteče le, če je na voljo svetloba, predsem svetloba z valovno dol- Pogoj za fotooksidacijo je singletni kisik, ki nastane žino iz ultravijoličnega dela spektra (UV). Omenjena re­v reakciji iz tripletnega kisika s pomočjo svetlobe in akcija je prikazana na si. 5. ustrezne spojine (angl. sensitizer), ki je v primeru oljčnih Bojan BUTINAR etil.: TOCOFEROL! V OLJČNIH OL(iH 5I.OVENSKE ISTRE VTREH ZAPOREDNIH LETIH, Yl-Ab KLOROFIL + hV ^LOROFi L 3KLOROFIL 3KL0R0F!l+ 30 2~> 10 2 SI. 5: Shematski prikaz reakcije; pri kateri iz tripletnega kisika in klorofila s pomočjo svetlobe nastane singletni kisik. Fig. 5; Schematic reaction showing the formation of the singlet oxygen from the triplet oxygen and chlorophyll in the presence of the UV light Tako nastali singletni kisik se adira na olefinski dei nenasičene rnaščobne kisline, v nadaljevanju pride do premestitve dvojne vezi in do spremembe konfiguracije na dvojni vezi iz c/s v trans. Ta mehanizem je prikazan na si. 6. R2 R2 SI, 6: Reakcija fotooksigenacije. Fig. 6: The photooxygenation reaction. Na hitrost reakcije fotooksigenacije v nasprotju z avtooksidacijo ne vplivajo antioksidanti, znatno pa jo zmanjšujejo preprečevale! nastajanja singletnega kisika (angl. radical quencher), e.g. karoteni in tudi tokoli -v oljčnem olju je tetraterpen fi karoten (si. 7). Reakcija fotooksigenacije je znatno hitrejša od re­akcije avtooksidacije. V tab. 1 so navedene relativne reakcijske hitrosti avtooksidacije in fotooksigenacije za kisline C 18:1 (cis-9), C 18:2 (cts 9,12) in C 18:3 (cis­9,12,15), ki so pomembnejše nenasičene kisline v oljčnem olju. Tab. 1: Relativne reakcijske hitrosti oksidacij za po­membnejše nenasičene rnaščobne kisline OO (Gun-stone, 1984). Tab. 1; Relative oxydation reaction rates for the main unsaturated fatty acids of olive oils (Gunstone, 1984). MAŠČOBNE KISLINE PROCE S C 16:1 C 18:2 C 18:3 AVTOOKSIDACIJA 1 27 77 EOTOOKStOiNACUA 3E4 4H 7E4 Reakcijski poti avtooksidacije in fotooksigenacije sta različni, njuni reakcijski hitrosti sta tudi različni -in seveda dajeta tudi različne produkte. Poglejmo si vse hidroperokside, ki nastanejo po obeh reakcijskih poteh iz oleinske kisline C 18:1 (cis-9). Reakcija avtoksidacije da Štiri različne hidroperokside, reakcija fotooksige­nacije pa dva (Bučar-Miklavčič et a!., 1995a in b). SI. 8 in si. 9. Oljčna olja vsebujejo od 5 do 300 mg/kg celokupnih tokoferolov, od tega je cca. 95% a -tokokoferoia in 5% P in y -tokoferola. 5 tokoferoi se v oljčnih oljih pojavlja samo v sledeh, in sicer v koncentracijah od 0,2 mg -2 mg/kg (Boskou, 1996). Zanimivo je, da večina semenskih olj vsebuje znatno višje koncentracije y tokoferola kot pa a tokokoferoia (e.g. sojino olje, koruzno olje, bučno olje) -(Madbavi et al., 1996). To dejstvo lahko tudi izkoristimo pri analit­skem določevanju adulteracije oljčnih olj s semenskimi (Kiritsakis, 1998). Vsebnost tokoferolov v oljčnih oljih je odvisna od sorte, klimatskih razmer v času dozorevanja, časa in načina predelave ter skladiščenja. Olja iz zgodaj ob­ranih in predelanih plodov imajo znatno višje vsebnosti tokoferolov. Kakovostna olja vsebujejo od 100-300 mg/kg tokoferolov (Cimato ef al., 1992), medtem ko imajo olja z visoko vsebnostjo prostih maščobnih kislin nizko vsebnost tokoferolov (Bučar-Miklavčič ef ai, 1995b). SI. 7: R-karoten. Fig. 7: li-carotene. 40 Sojan RUTINA« ctal: TOKOFEROL ! V OLJČNIH OLJIH SLOVENSK E ISTRE' V TRE H ZAPOREDNIH LETIH , 37-46 Si 8: Produkti avtooksidacije oleinske kisline. Fig. 8: The products of the autooxidation of oleic acid. SI. 9: Produkti folooksigenacije oleinske kisline. Fig. 9: The products of the photooxygenatlon of oleic acid. MATERIAL IN METODE Material Oljčna olja Prvi del raziskave srno opravili na 24 vzorcih O O letnika 1995, določitev november 1996; na 27 vzorcih O O letnika 1996, določitev maj 1997 ter na 30 vzorcih O O letnika 1997, določitev maj 1998. Vsa O O so bila do analize skladiščena v temi, v neprodušno zaprtih temnih steklenicah brez zračne atmosfere nad oljem, pri temperaturi 15°C. Pri drugem delu raziskave pa smo na populaciji 5 vzorcev O O letnika 1995 določili koncentracijo to­koferolov takoj po predelavi (december 1995} in pa po 6 mesecih namerno izbranega neustreznega skladiščenja (prozorne steklenice, neposredna svetloba, sobna tem­peratura). izbrani vzorci so bili naslednji: MEŠANICA NOV. 95 (mešanica OO , ki so bila predelana novembra 1995), VISOK O KŠ (mešanica O O z visoko vsebnostjo prostih maščobnih kislin takoj po predelavi), MEŠANICA DEC. 95 (mešanica OO , ki so bifa predelana decembra 1995), MEŠANICA SLANICA (mešanica OO , ki so bila predelana iz plodov, ki so bili pred predelavo hranjeni v slanici) ter O O SB (vzorec O O sorte istrska belica). Standardi Pri karakerizaciji in določevanju koncentracije toko­feroiov smo uporabili standarde prizvajalca Merck (Darmstadt, Nemčija). Pripravili smo umeritveno me­šanico naslednjih koncentracij: tokoferol koncentracija (ng/pL) a - tokoferol 5,1 (3 - tokoferol 6,1 Y - tokoferol 6,0 5 - tokoferol 5,5 Koncentracijo pripravljenih standardov smo preverili po A.O.C.S. metodi Ce 8-89 (AOCS, 1990; Balz et al., 1996). Metode Priprava vzorcev 300 do 500 mg vzorca O O smo natehtali v 4 mL vialo in dodali 3,0 mL metanola. Vialo smo dobro premešali in stresali oziroma ekstrahirali na supersonični kopeli 15 minut. Po končani ekstrakciji smo iz ločene polarne faze odpipetirali cca. 1 mL metanolne raztopine in jo prenesli v temno 2 mL vialo HPLC avtoinjektorja. Oprema Vsebnost tokoferolov smo določevali s pomočjo te­kočinske kromatografije visoke ločljivosti (HPLC) na osnovi retenzijskih časov in koncentracije uporablje­nega standarda. HPL C Uporabljali smo sistem, opremljen z gradientno črpalko, z avtoinjektorjem in UV/VIS detektorjem, mo­del 1050, proizvajalca Hewlett Packard. Tokoferoie smo ločevali na koloni Hypersif OD S 5jjm, 4.6 x 200 mm (HP). Absorbanco eluata smo merili pri 290E-9 m. Sojan BUTINAR « si.: TOKOFEROLt V OLJČNIH OlJiH SLOVENSKE !STRE V TREH ZAPOREDNIH LETIH. 37-46 a b SI. 10: HPLC kromatogram standardne mešanice tokoferolov (a) in pa vzorca OO letnika 1997 (b). Fig. 10: HPLC cbromatogram of the standard mixture of tocopherols (a) and of OO sample from the 1997 crop (b). Za ločevanje smo uporabili mobilno fazo, se-REZULTATI stavljeno iz vode (92%) in metanola (8%). Pretok mo­bilne faze je bil 2 mL/min, čas analize pa 12 minut. Rezultati določitev vsebnosti skupnih tokoferolov za Vbrizg je bil 50 pL metanolnega ekstrakta. Omenjeni O O letnikov 1995, 1996 in 1997 so zbrani v tab. 2 (v kromatografski sistem ne ločuje med (3 in y tokoferolno mg skupnih tokoferolov/100 g OO). izomero, a smo se vendarle odločili zanj, saj sta njuni V drugem nizu eksperimentalnih podatkov pa-so koncentraciji v O O znatno nižji od koncentracije a-to-prikazane vrednosti za vsebnost, skupnih tokoferolov v koferola. Pri umeritvi smo upoštevali vsoto obeh izomer. izbranih vzorcih O O letnika 1995, pri katerih smo Na si. 10 sta HPLC kromatograma standardne meša-raziskovali vpliv staranja v razmerah neustreznega skla­nice in pa vzorca O O letnika 1997. diščenja na količino skupnih tokoferolov. Rezultate si oglejmo v tab. 3. Tab. 2: Dobljeni rezultati za ST v vzorcih OO letnikov 1995, 1996 in 1997. Tab. 2: Results of determination of ST in OO samples from the 1995, 1996 and 1997 crops. LETNIK ŠTEVIL O VZORCE V POVPREČJE STANDARDN I ODKLO N MEDIAN A MI N MA X 1995 24 3,18 2,11 3,05 0,53 8,22 1996 27 6,73 2,26 5,95 3,43 12,13 1997 30 4,09 2,67 3,07 1,35 14,38 Bojan 8UTINAR el si.: TOKOFEROU V OUČNIH OLJIH SLOVENSKE ISTRE V TREH ZAPOREDNIM LETIH, 37-46 SI. 11, 12 in 13 pa prikazujejo vsebnosti skupnih tokoferolov v vzorcih O O letnikov 1995,1996 in 1997. -I I o.o JLmJ . J B B B S O B S B B MMMMMMM M M M M M M Sorta i B istrska betice, L leccrno, M nreSanlca) Si. 11: Grafična ponazoritev vsebnosti skupnih tokoferolov za OO letnika 1995, določitev november 96. Fig. 11: Graphical representation for the total tocopherols content in OO from the 1995 crop, analyzed in November 1996. 12.0 10.0 ­ e 8.o B B B f l B B B B B L L L M M M M M M M M M M M M M M M Sorts { S istraka belica, L teccšno, M meSanlca oziroma sorla, k! ne vsebuje ne tstrake bollee ne fecclrta) SI. 12: Grafična ponazoritev vsebnosti skupnih tokoferolov za OO letnika 1996, določitev maj 97. Fig. 12: Graphical representation for the total tocopherols content in OO from the 1996 crop, analyzed in May 97. Bojan 8UTINAR e< !if.:TOKOFEROL[ V OLJČNIH OLJIH SLOVENSKE !STKE V TREH ZAPOREDNIH LETIH, 37-4G 16.0 14.0 B B S B B B B B B B B B B B B S B B L L L M M M M M M M M M Sorta i D istrsk a belica, L teccino, M i n Si 13: Grafična ponazoritev vsebnosti skupnih tokoferoiov za OO letnika 1997, določitev maj/junij 98. Fig. 13: Graphical representation for the total tocopherols content in OO from the 1997 crop, analyzed in May/June 98. in na si. 14: SI. 14: Primerjalni graf vsebnosti skupnih tokoferoiov v vzorcih oljčnih olj, analiziranih decembra 95 in julija 96 (po 6 mesecih namerno izbranega neustreznega skladiščenja). Fig 14: Comparative graph showing the content of the total tocopherols of OO samples, analyzed in December 95 and June 96 (after 6 months of deliberately chosen inadequate storage). Bo i an BUT1NA.R a ,i/.: TOKOFEROLI V OLJČNIH OLJiH SLOVENSKE ISTRE V TREH ZAPOREDNIH LETIH, 37-4 6 Tab. 3: Vsebnosti ST v vzorcih OO pred začetkom in po 6 mesecih neustreznega skladiščenja (rezultati so v mg skupnih tokoferolov na 100 g OO). Tab. 3: The total tocopherols content in OO before and after 6 months of inadequate storage (results are in mg total tocopherols per 100 g of OO). MEŠANICA NOV . 95 9.66 2.41 VISOK O KŠ 2.64 0.09 MEŠANICA DEC. 95 4.54 0.23 MEŠANICA SLANIC A 9.30 1.44 O O IB 4.20 0.50 ZAKLJUČEK Vsebnost skupnih tokoferolov v O O letnikov 1995, 1996 in 1997: Primerjalni rezultati analiz vsebnosti skupnih toko­ferolov v O O vseh treh letnikov kažejo na precejšnjo usklajenost vsebnosti tokoferolov. Povprečne vrednosti za letnike 1995, 1996 in 1997 so 3,18+2,11 mg/100 g OO ; 6,73±2,26 mg/100 g O O in 4,09±2,67 mg/100 g OO . Standardni odkloni so za vse tri letnike izenačeni, kar kaže na precej dober izbor vzorcev O O za analizo, na primerljive klimatske in pridelovalne dejavnike znotraj posameznega letnika. V primerjavi s prejšnjimi letniki O O slovenske Istre so vsebnosti skupnih toko­ferolov omenjenih letnikov 95, 96 in 97 znatno nižje, saj so bile te vrednosti pri letniku 1993 med 12 in 14 mg/100 g olja (Bučar-Miklavčič et al., 1994). Ta podatek verjetno bolj kot na kemijske spremembe v času skladiščenja kaze na nizko vsebnost skupnih tokoferolov v plodovih samih oziroma v sveže predelanem olju (verjetno klimatski dejavniki med samo rastjo - količina padavin, temperatura). Staranje izbranih O O letnika 1995 v neustreznih razmerah skladiščenja: Omenili smo, da smo kontrolne vzorce šest mesecev skladiščili na svetlobi pri sobni temperaturi v prozorni embalaži. Takšno skladiščenje je bilo seveda namerno izbrano, saj smo z njim hoteli ugotoviti, do katere največje mere se še zmanjša vsebnost tokoferolov. Ta vrednost je posredno merilo za rok trajanja olja. Ugo­tovili smo, da je v treh vzorcih od petih vsebnost skupnih tokoferolov padla pod 1 mg/100 g. Literatura navaja, da mora biti vsebnost skupnih tokoferolov, ki naj zagotovi minimalno antioksidativno stabilnost oljč­nih olj, vsaj 6 mg/100 g olja (Cimato et al., 1997). Se­veda pa ta podatek ne upošteva morebitnih sinergizmov med vsebnostjo skupnih tokoferolov in skupnih poli­fenolov (Brighenti et al., 1999). Iz vsebnosti skupnih to­koferolov v vzorcih po šestih mesecih neustreznega skladiščenja sledi, da neustrezno skladiščenje znatno zdesetka količino skupnih tokoferolov, kar posledično seveda pomeni, da taka olja niso več antioksidativno varna in se zato hitro pokvarijo. Še posebno nizka ja bila vsebnost skupnih tokoferolov pri vzorcu z začetno visoko vsebnostjo prostih maščobnih kislin ( » 1%). Iz omenjenega sledi, da so vzorci, ki imajo že takoj ob predelavi visoko vsebnost prostih maščobnih kislin, še toliko manj stabilni. ZAHVAL A Laboratoriju LABS smo hvaležni" za moralno in ma­terialno asistenco pri eksperimentalnem delu, društvu DOSI pa za koordinacijo pri zbiranju vzorcev. Bojan BUTINAR etnl.i TOKOF6RO U V OLJČNIH Oljl H SLOVENSKE ISTRE VTREH ZAPOREDNIH LETIH, 37-J 6 TOCOPHEROL S I N OLIV E OIL S FRO M SLOVEN E ISTR A i N THRE E CONSECUTIV E YEAR S Bojan BUTtNAR ZRS, Si-6000 Koper, Garibaldi jeva 18, E-mail: Bojan. Butinar@zrs-kp. si Milena BUČAR-MIKLAVČIČ LABS, 6310 izola, Zelena uiica 8, E-mail: MiSena.Mikiavcic@guest.arnes.si Darinka ČALIJA LABS, SI-6310 Izola, Zelena ulica 8 SUMMARY Antioxidants are compounds that protect olive oils (OO) against ageing. Vitamin E is an antioxidant that occurs, particularly in the form of .!-tocopherol, in extra virgin OO. The results of the analyses of the total tocopherol (ST) content in OO from Slovene Istra (crops J995, 1996 and 1997) are the following: 3.18 mg/100 g; 6.73 mg/100 g in 4.09 mg/100 g. In the OO samples crop 1995, in which the impact of inadequate storage on the ST content was studied, their content fell below 1 mg/100 g. Key words: antioxidants, hydroxytyrosol, olive oil, polyphenols, tyrosol VIRI IN LITERATURA Cimato, A., Baidini, A., Moretti, R. 1997. L'olio do oliva. Firenze. Arsia. A.O.C.S. Official Method Ce 8-89, 1990. Determination of Tocopherols and Tocotrienols in Vegetable Oils and Fats by H PLC. Balz, M., Schulte, E., Thier, H-P. 1996. A new parameter for checking the suitability of a-tocophero! standards. Z. Lebensm Unters Forsch. 202, 80-81. Boskou, D. 1996. Olive Oil - Chemistry and Techno­logy. Champaign, Illinois. AOC S Press. Brighenti, F., Cammarata, T., Pellegrini, N. 1999. Direct evaluation of antioxidant activity of extra-virgin olive oil. Proceedings of the Euro Food Chem X, Volume 2, 464-470. Bučar-Mikiavčič, M., Butinar, Bv Čalija, D. 1994. Tokoferoli oljčnih olj Slovenske Istre letnika 1993, neobjavljen tipkopis. Bučar-Miklavčič, M., Butinar, B., Čalija, D., Koren, F„ Jančar, M., Jloksič, M. 1995a. Nekatere značilnosti izbranih oljčnih olj slovenske Istre letnik 94. Koper, Znanstveno raziskovalno središče republike Slovenije. Bučar-Miklavčič, M., Butinar, B., Čalija, D. 1995b, Tokoferoli oljčnih olj slovenske Istre letnikov 1992­1994, neobjavljen tipkopis. Cimato, A., Modi, G., Alessandri, S., Mattel, A. 1992. Caratteristiche e peculiarity dell'olio extra vergine di oliva prodotto in Toscana. L'lnformatore Agrario, XLVIIi, 18, 55-75. Cuppett, S., Schnepf, M., HaJi, C.ltl, 1997. V; Shahidi, F. (ed.): Natural antioxidants. Champaign, Illinois. AOC S Press. Deshpande, S. S., Deshpande, U. S v Salunkhe, D. K. 1996. V: Madhavi, D. L., Deshpande, S. S., Salunkhe, D. K. (Eds.): Food antioxidants. New York, New York. Marcel Dekker, Inc. Gunstone, F. D. 1984. Reaction of oxygen and unsaturated fatty acids. jAOCS, 61, 2, 441-453. Kiritsakis, K. A. 1998. Olive Oil - From the tree to the table. Trumbull, Connecticut. Food & Nutrition Press, Inc. Madhavi, D. L , Singhal, R. S., Kulkarni, P. R. 1996. V: Madhavi, D. L., Deshpande, S. S., Salunkhe, D. K. (Eds.): Food antioxidants. New York, New York. Marcel Dekker, Inc. Shukla, V.K.S., Wanasundara, P.K.J.P.D., Shahidi, F. 1997. V: Shahidi, F. (ed.): Natural antioxidants. Cham­paign, Illinois. AOCS Press. White, P. J., Xing, Y. 1997. V: Shahidi, F. (ed.): Natural antioxidants. Champaign, Illinois. AOCS Press.