Hmeljarski bilten / Hop Bulletin 26(2019) ______________ 5 GENETSKE RAZISKAVE HMELJA IN NJEGOVIH ŠKODLJIVIH ORGANIZMOV V SLOVENIJI – POGLED NAZAJ Branka JAVORNIK 1 Pregledni članek / review paper Prispelo / received: 23. 10. 2019 Sprejeto / accepted: 2. 12. 2019 Izvleček V prispevku je opisan pregled genetskih raziskav hmelja in nekaterih njegovih škodljivih organizmov, fitopatogene glive Verticillium nonalfalfae ter viroidov HLVd in CBCVd, v katere sem bila vključena v preteklih letih. Predstavljen je osebni pogled na opravljeno delo na področju razvoja molekulskih markerjev in vrednotenja genetske variabilnosti hmelja, ter izdelave genskih kart hmelja. Opisane so nekatere diagnostične metode hmeljnih patogenih organizmov, temeljne študije interakcij med hmeljem in povzročiteljem hmeljeve uvelosti, genomske in proteomske študije virulence glive V. nonalfalfae ter karakterizacija potencialnih efektorskih proteinov odgovornih za virulenco. Ključne besede: hmelj, molekulska genetika, Verticillium nonalfalfae, HLVd in CBCVd GENETIC STUDIES OF HOP AND ITS PATHOGENS IN SLOVENIA – A RETROSPECTIVE Abstract The paper presents a personal overview of the genetic research of hop and hop pathogens (Verticillium nonalfalfae and viroids HLVd in CBCVd) in which I was involved in past years. This includes the development of hop molecular markers, assessment of hop genetic variability and genetic mapping. Some pathogen diagnostic methods are described, together with basic studies of hop-pathogen interactions, proteomic and genomic studies of V. nonalfalfae virulence and characterization of its effector proteins. Key words: hop, molecular genetics, Verticillium nonalfalfae, HLVd in CBCVd 1 Zaslužna profesorica Univerze v Ljubljani, Kongresni trg 12, 1000 Ljubljana, e-pošta: branka.javornik@bf.uni-lj.si 6 Hmeljarski bilten / Hop Bulletin 26(2019) ______________ 1 UVOD Pri genetskih raziskavah hmelja in njegovih škodljivih organizmih, ki so potekale v zglednem sodelovanju med Biotehnično fakulteto (BF) in Inštitutom za hmeljarstvo in pivovarstvo Slovenije (IHPS), sem sodelovala skoraj 25 let. V tem času se je od skromnih začetkov okoli leta 1994 pa do leta 2019 samo na omenjenem področju nabralo obsežno število izvirnih znanstvenih člankov (57), preglednih znanstvenih in strokovnih člankov (13), kratkih znanstvenih prispevkov (5), vabljenih predavanj na znanstvenih konferencah (19), objavljenih znanstvenih prispevkov na konferencah (47) in več kot 100 objavljenih povzetkov znanstvenih prispevkov na konferencah (Javornik, B.: https://bib.cobiss.net/bibliographies/si/). Raziskave so bile financirane s strani preko 15 temeljnih, aplikativnih in strokovnih projektov ter v letih 1999–2018 iz obsežnega raziskovalnega programa Kmetijske rastline – genetika in sodobne tehnologije (Javornik, B.: https://www.sicris.si). Na problematiki hmelja in njegovih škodljivih organizmih je bilo samo pod mojim mentorstvom vključenih 8 mladih raziskovalcev in opravljeni so bili 3 magisteriji ter 11 doktoratov (Javornik, B.: https://www.sicris.si). V začetku 90 let prejšnjega stoletja se je izkazalo, da lahko sodobni molekulsko genetski pristopi bistveno prispevajo k učinkovitejši vzgoji izboljšanih novih kultivarjev kmetijskih rastlin. Zato smo tudi pri hmelju zastavili molekulsko genetski program, ki naj bi prispeval k boljšemu poznavanju lastnosti, pomembnih za ekonomsko opravičeno pridelovanje hmelja ter za razvoj molekulskih orodij, ki bi lahko neposredno služila v žlahtnjenju hmelja. Vabilo IHPS k sodelovanju in uvajanju sodobnejših metod pri raziskavah hmelja je bilo zame, genetičarko, velika čast in privilegij glede na bogato žlahtniteljsko prakso inštituta in razpoložljiv obsežen genski material. Hmelj v Sloveniji pridelujemo že več kot 100 let in je pomemben kmetijski pridelek, ki je večinoma namenjen izvozu. Svetovni trg narekuje vedno nove zahteve po kakovosti hmelja, zato so potrebe po novih sortah stalno prisotne. Željeni so na primer določeni tipi hmelja (visok odstotek alfa- kislin, aromatični ali dišavni hmelj), spreminjajo se tehnologije pridelovanja, se pojavijo nove bolezni in škodljivci. Pri hmelju enostavna introdukcija iz drugih hmeljarskih območij dostikrat ni uspešna, zato na IHPS poteka žlahtnjenje hmelja že od leta 1952. Pod vodstvom vrhunske žlahtniteljice dr. Dragice Kralj je bilo v letih 1971–1990 potrjenih 11 novih, pretežno aromatičnih sort hmelja, med katerimi izstopa sorta Aurora, ki se še zdaj predeluje na okoli 60 % hmeljišč. Žlahtniteljska tradicija inštituta se je nadaljevala pod vodstvom dr. Andreje Čerenak, uspešne žlahtniteljice z 9 novimi, pretežno dišavnimi sortami hmelja, potrjenimi v obdobju 2009–2018. Molekulsko genetski program hmelja se je začel oblikovati s prihodom Jelke Šuštar Vozlič, takrat zaposlene na IHPS, v naš laboratorij in na pobudo dr. Dragice Kralj, ki mi je leta 1995 predlagala udeležbo na IHGC – Scientific-Technical Comission Hmeljarski bilten / Hop Bulletin 26(2019) ______________ 7 v Strasbourgu, kjer sem predstavila naše prve molekulske rezultate na kultivarjih hmelja. Na teh srečanjih smo bili pozneje vedno zaželeni in cenjeni udeleženci. Program, ki sem ga pozneje vodila oz. pri njem aktivno sodelovala, se je med leti dopolnjeval glede na doseženo predhodno znanje in je bil sestavljen iz posameznih med seboj povezanih sklopov: 1. Razvoj molekulskih markerjev hmelja 2. Vrednotenje genetske variabilnosti hmelja 3. Izdelava genskih kart hmelja za identifikacijo markerjev vezanih z visoko vsebnostjo alfa kislin, pridelkom in odpornostjo na hmeljevo uvelost 4. Diagnostika hmeljnih patogenih organizmov 5. Temeljne študije interakcij med hmeljem in povzročiteljem hmeljeve uvelosti (Verticillium nonalfalfae) 6. Genomske in proteomske študije virulentnih dejavnikov povzročitelja hmeljeve uvelosti (V. nonalfalfae) 7. Karakterizacija potencialnih efektorskih proteinov povezanih z virulenco V. nonalfalfae Za izvajanje tega programa je bilo potrebno razviti ustrezna znanja in priskrbeti potrebno raziskovalno opremo, da smo lahko večino dela opravili v domačem laboratoriju. Razvite platforme so služile tudi pri proučevanih drugih kmetijskih rastlin in škodljivih rastlinskih organizmih ter za izobraževanje dodiplomskih in podiplomskih študentov. Delo smo usklajevali na rednih sestankih ožje skupine za »genetiko« v okviru raziskovalne programske skupine, na katerih smo se seznanjali z doseženimi rezultati, reševali nastale probleme, izmenjavali mnenja in ideje ter planirali prihodnje korake v raziskavah, ki bi vodile do zastavljenih ciljev. Razvili smo tudi dobro mednarodno sodelovanje na področju hmelja preko Mednarodne hmeljarske organizacije IHGC - Scientific-Technical Comission ter z drugimi uveljavljenimi raziskovalnimi skupinami na področjih posameznih znanstvenih problematik. 2 RAZVOJ MOLEKULSKIH MARKERJEV HMELJA S pričetkom raziskovalnega dela pri hmelju smo razpolagali predvsem z metodološko preprostejšimi molekulskimi metodami, kot je na primer RAPD metoda (naključno namnožena polimorfna DNA; RAPD markerji), za razvoj katere ima največ zaslug dr. Bojka Kump, ki je sicer delala na genestki variabilnosti ajde. Z RAPD markerji, ki so se izkazali ustrezni pokazatelji polimorfizma, smo vrednotili raznolikosti in sorodstvene odnose tako med domačimi sortami (Jakše in sod., 1994) kot tudi med genotipi, zbranimi v obsežni kolekciji kultivarjev hmelja IHPS (Šuštar-Vozlič in Javornik, 1999). Zaradi večje informacijske vrednosti drugih molekulskih markerjev smo pričeli najprej z uporabo mikrosatelitov (SSR markerji), ki so jih razvili za hmelj avstralski raziskovalci (Jakše in sod., 2004) in nato z razvojem in karakterizacijo lastnih mikrosatelitskih lokusov hmelja (Jakše in 8 Hmeljarski bilten / Hop Bulletin 26(2019) ______________ Javornik, 2001, Jakše in sod. 2002, Štajner in sod. 2005, Jakše in sod. 2008, Jakše in sod. 2011). Izolacija in karakterizacija mikrosatelitskih markerjev hmelja se je izkazala kot delovno in finančno obsežna naloga, vendar je odtehtalo spoznanje, da so to visoko informativni vrstno specifični markerji, nepogrešljivi predvsem za kartiranju genoma heterozigotnih rastlin kot je hmelj. Sedaj razpolagamo z več kot 300 SSR markerji hmelja, žal pa nismo uspeli izdelati javno dostopnega kataloga markerjev ter pri vseh ovrednotiti njihove informacijske vrednosti. Gonilna sila pri pri izolaciji SSR je bil kolega dr. Jernej Jakše, ki je skupaj s kolegicami dr. Natašo Štajner, dr. Zlato Luthar in dr. Dunjo Bandelj, opravil veliko delo in si zasluži izrecno pohvalo za izkazane napore. Tudi sicer je bil Jernej Jakše duša genetskega in genomskega laboratorija, saj se je korajžno lotil novih in zahtevnih metodoloških pristopov ter je nesebično pomagal in svetoval drugim kolegom in kolegicam pri njihovih raziskavah. Vzporedno s SSR markerji je bil vpeljan tudi AFLP markerski sistem; najprej z barvanjem s srebrom (Jakše in sod., 2001) in nato z avtomatsko fluorescenčno detekcijo (Štajner in sod., 2003), ki omogoča relativno hitro analizo genoma brez predhodnega poznavanja nukleotidnih zaporedij. Za uporabo AFLP (dolžinski polimorfizem amplificiranih fragmentov) markerjev pri različnih organizmih pa so bile potrebne posamezne optimizacije postopkov (Radišek in sod., 2001). Za uspešnejše odkrivanje genov, ki pogojujejo odpornost hmelja na hmeljevo uvelost ali druge bolezni in škodljivce, smo proučevali in razvili nekaj markerjev (RGA, analogi rezistenčnim genom) neposredno vezanih z odpornostnimi geni (Kozjak in sod., 2009; Majer in sod., 2014). V sodelovanju z mednarodnim DArT konzorcijem za hmelj pa smo uvedli tudi visoko zmogljivo metodo za genotipizacijo hmelja z DArT markerji (Howard in sod., 2011). Zaključimo lahko, da smo pri razvoju molekulskih markerjev hmelja naredili dober metodološki napredek ter da smo razpolagali z zadovoljivo opremo in znanjem tudi za zahtevnejše molekulske analize rastlin in rastlinskih patogenov. Razviti markerji hmelja so bili vzporedno praktično uporabljeni med drugim za identifikacijske namene pri določanju pristnosti kultivarjev hmelja z RAPD (Jakše in sod., 1994) in s SSR markerji (Čerenak in sod., 2003), določevanju spola hmeljnih rastlin z RAPD markerji (Čerenak in sod., 2000), z SSR markerji (Jakše in sod., 2008, Škof in sod., 2012) in markerji razvitimi s pomočjo DArT genotipizacije (Čerenak in sod., 2019). Uporabili smo RAPD markerje v povezavi z odpornostjo na hmeljevo uš (Čerenak in Javornik, 2002), pri nejasnostih označb akcesij divjega hmelja v genski banki (Jakše in sod., 2000) in pri diagnosticiranju patotipov V. nonalfalfae z AFLP markerji (Radišek in sod., 2003). Hmeljarski bilten / Hop Bulletin 26(2019) ______________ 9 3 VREDNOTENJE GENETSKE VARIABILNOSTI HMELJA Sodobni kultivarji hmelja so vzgojeni s križanji, ki so omogočila vnos in kombiniranje lastnosti za pridelek, hmeljno grenčico in aromo ter za odpornosti na bolezni in škodljivce. Sedanja žlahtniteljska praksa uporablja pri ustvarjanju novih kombinacij različnih lastnosti kot izhodiščni žlahtniteljski material hmeljne kultivarje, žlahtniteljske linije in divje hmelje, ki izražajo željene lastnosti, običajno ocenjene s fenotipskimi znaki. Današnji osnovni žlahtniteljski material se vzdržuje v kolekcijah hmeljne dednine, s katerimi razpolagajo največji žlahtniteljski centri hmelja v svetu, med njimi tudi IHPS. V teh kolekcijah je ohranjena biodiverziteta hmelja, ki se je generirala skozi daljša obdobja načrtne selekcije in žlahtnjenja ter z zbiranjem divjih akcesij hmelja. Za učinkovitejšo uporabo ohranjene biodiverzitete za vzgojo novih sort hmelja pa je dobrodošlo natančno poznavanje obsega in porazdelitve obstoječe genetske variabilnosti ter genetskih odnosov med razpoložljivimi hmeljnimi genotipi. Za opis kolekcij hmelja in vrednotenje genetske diverzitete hmelja so se največ uporabljali morfološki in kemijski podatki. Te vrste raziskav so opredelile razdelitev hmeljnih akcesij na dve osnovni veliki, geografsko ločeni skupini, ameriški grenčični hmelj in evropski aromatični hmelj (Small, 1978; Stevensu in sod., 2000) ter kultivarje hmelja v skupine, ki so odražali njihovo geografsko poreklo in njihove kakovostne lastnosti (Kralj in sod., 1991; Henning in sod., 2003). Prva vrednotenja genetske diverzitete akcesij hmelja z molekulskimi markerji je izvedla naša skupina, ki so ji sledile še druge študije (Jakše in sod., 1994; Šuštar- Vozlič in Javornik, 1999; Seefelder in sod., 2000; Jakše in sod., 2001; Patzak, 2001). RAPD in AFLP analize so nedvoumno potrdile ločitev dednine hmelja v dve geografski skupini, evropsko in severno-ameriško, ter znotraj evropske skupine genetsko opredelile grupiranje kultivarjev hmelja v podskupine, ki so odražale preteklo žlahtniteljsko prakso v posameznih regijah (Anglija, Bavarska, Češka) ali značilnosti žlahtniteljskih programov (Slovenija, ZDA, Anglija, Japonska, Nova Zelandija, Avstralija). Molekulsko genetske študije so relativno dobro opredelile raznolikosti in variabilnosti ženskih kultiviranih akcesij v kolekcijah hmelja. Manj raziskav pa je bilo opravljenih na divjem hmelju ter moških akcesijah. Za žlahtnitelje pa je lahko zanimiv podatek o stopnji raznolikosti med kultiviranim in divjim hmeljem, kar je analizirala naša skupina (Jakše in sod., 2004). Za evropski hmelj je bilo ugotovljeno, da se divji in kultiviran hmelj sicer signifikantno razlikujeta, vendar se nahaja vsa diverziteta znotraj obeh skupin, ki izkazujeta približno enako stopnjo variabilnosti. Ali povedano drugače, variabilnost med kultivarji hmelja je enako velika kot variabilnost med divjimi akcesijami, vendar se obe razlikujeta, s čimer se nakazuje, da divji hmelji vsebujejo še neuporabljen vir genetske variabilnosti. Nadalje smo opravili analizo strukture genoma hmelja s 10 Hmeljarski bilten / Hop Bulletin 26(2019) ______________ pomočjo večjega števila SSR markerjev na setu izbranih divjih in kultiviranih akcesij hmelja (Štajner in sod., 2008). Rezultati te analize, ki je ena najbolj temeljitih študij variabilnosti dednine hmelja, je pokazala delitev hmeljev v sedem jasno ločenih genskih skupin, in sicer na štiri skupine divjih hmeljev (akcesije z izvorom iz Altaja, Gruzije, Severne Amerike in območja nekdanje Jugoslavije) ter na tri skupine kultiviranih hmeljev (evropski kultivarji, žlahtnjeni v Nemčiji in Češki; kultivarji, žlahtnjeni v Angliji in Sloveniji; kultivarji s pretežno severno ameriško dednino). Iz rezultatov analize je tudi bilo mogoče razbrati deleže posamezne dednine v hibridnih kultivarjih, kar je sovpadalo z znanimi rodovniki teh kultivarjev hmelja ter introgresijo dednine kultivarjev v divjih hmeljih kot posledica križanja med kultiviranimi in divjimi hmelji. Ta znanja o populacijski strukturi bodo lahko v pomoč pri efektivni uporabi diverzitete s pomočjo asocijacijskih študij ter za identifikacijo in pravilno interpretacijo povezav med funkcijsko in molekulsko diverziteto. Iz problematike razvoja molekulskih markerjev in vrednotenja genske variabilnosti hmelja so doktorirali Jelka Šuštar Vozlič (1997), Jernej Jakše (2003), Nataša Štajner (2003) in Petra Kozjak (2006). 4 KARTIRANJE GENOMA HMELJA Za kartiranje genoma hmelja smo se odločili, ker smo želeli poiskati markerje, vezane za kvantitativne lokuse, ki so povezani z visoko vsebnostjo alfa-kislin, pridelkom ter za določitev markerjev, vezanih z odpornostjo na hmeljevo uvelost. Uspešna identifikacija takšnih markerjev bi lahko služila neposredno v žlahtnjenju hmelja in bi lahko bistveno doprinesla k učinkovitosti in krajšemu času vzgoje novih sort hmelja. Genske karte so uporabne za kartiranje monogenih lastnosti kot tudi za razčlenitev kvantitativnih lastnosti (več genov skupaj na kromosomski regiji). Osnovni princip kartiranja za obe vrsti lastnosti je podoben, to je tesna vezanost med markerjem in fenotipom ter skupna segregacija pri kontroliranem križanju. Monogene lastnosti z lahko določljivim fenotipom, kot na primer nekatere bolezni, je relativno enostavno vključiti v gensko karto, medtem ko je kartiranje kvantitativnih lastnosti bolj kompleksno, ker jih pogojuje več genov, katerih ekspresija je večkrat odvisna od zunanjih dejavnikov. Za kartiranje kvantitativnih lokusov za vsebnost alfa-kislin smo uporabili družino potomcev križanja Magnum x 2/1 (visoka ter nizka vsebnost alfa kislin) ter AFLP in SSR markerje. Ta družina je segregirala kvantitativno glede vsebnosti alfa-kislin v letih 2002-2004. Najprej smo izdelali moško in žensko gensko karto vezanih markerjev, nato pa smo z analizo kvantitativnih lastnosti določili štiri kvantitativne lokuse kot pokazatelje visoke vsebnosti alfa-kislin (Čerenak in sod. 2006). To karto Hmeljarski bilten / Hop Bulletin 26(2019) ______________ 11 smo nato nadgradili z dodatnimi SSR markerji in merjenjem vsebnosti alfa-kislin in parametrov pridelka v nadaljnjih dveh letih (Čerenak in sod., 2009). Določili smo kvantitativni lokus z mejnima AFLP markerjema za vsebnost alfa-kislin, ki je bil povezan tudi z do 36 % višjo vsebnostjo alfa-kislin ter locirali kandidatne kvantitativne lokuse za parametre pridelka. Za kartiranje lokusov za odpornost na hmeljevo uvelost je bila vzgojena družina križancev iz odporne sorte Wye Target in domače občutljive moške žlahtniteljske linije 2/1. Za izdelavo genske karte smo genotipizirali 156 križancev z okoli 200 različnimi molekulskimi markerji, za analizo kvantitativnih lokusov pa smo uporabili fenotipske podatke ocenjevanja bolezenskih znakov hmeljeve uvelosti pri 90 križancih. Identificirali smo signifikantni kvantitativni lokus na eni sami kromosomski regiji, ki je povezan z odpornostjo na hmeljevo uvelost. Mendelska analiza fenotipskih podatkov (neobjavljeno) je nakazala vključenost dveh genov v odpornost hmelja na hmeljevo uvelost, kar je v skladu s predhodnimi dognanji (Darby, 2001). Kvantitativna analiza vsebnosti alfa-kislin in parametrov pridelka na tej karti je potrdila predhodne kvantitativne lokuse, dobljene na potomcih staršev Magnum x 2/1in pod drugačnimi rastnimi pogoji (Jakše in sod., 2013). Rezultati kvantitativnega kartiranja so vzpodbudni, škoda je le, da je nadaljnje delo za izdelavo vezanih markerjev za analizirane fenotipske lastnosti uporabnih v žlahtnjenju zastalo. Izdelava genskih kart in iskanje vezanih markerjev je relativno zahteven projekt zaradi obsežnosti dela pri vzgoji in vzdrževanju družine križancev, merjenju fenotipskih lastnosti ter laboratorijskih in statističnih analiz. Kolegica dr. Andreja Čerenak in sodelavci IHPS so opravili gigantsko delo pri kontroliranem križanju izbranih staršev in vzdrževanju družine križancev na polju skozi več let ter pri analizi fenotipskih lastnosti. Andreja, ki je leta 2004 doktorirala iz prvih dveh genskih kart, si zasluži veliko zahvalo za vloženo delo in vztrajnost pri delu na genskih kartah, ki so, vsaj po moji oceni, ene najboljših do sedaj izdelanih genskih kart hmelja. Na tem mestu si posebno zahvalo zasluži tudi kolega dr. Sebastjan Radišek, ki je opravil obsežno in pomembno delo, ko je marljivo in natančno ocenjeval bolezenske znake hmeljeve uvelosti na razmnoženih in z V. nonalfalfae umetno okuženih okoli 1000 potaknjencih. Pomembno delež pri izdelavi genskih kart hmelja je s svojo ekspertizo na področju genomske statistike prispeval dr. Zlatko Satović iz Agronomske fakultete v Zagrebu. 12 Hmeljarski bilten / Hop Bulletin 26(2019) ______________ 5 DIAGNOSTIKA PATOGENIH ORGANIZMOV HMELJA Molekulske metode so se razširile tudi na področje diagnostike škodljivih organizmov in ponujajo odlično dopolnitev uveljavljenim in standardiziranim metodam. Za uspešno aplikacijo molekulskih metod v diagnostiki patogenov pa sta potrebna dober fitopatolog in usposobljen molekulski laboratorij. V primeru diagnostike hmeljnih škodljivih organizmov je to kombinacijo tvoril dr. Sebastjan Radišek z IHPS, ki se je skozi leta razvil v uglednega fitopatologa in dr. Jernej Jakše v našem laboratorij na BF. Od začetnih diagnostičnih analiz predvsem na patotipih fitopatogene glive V. nonalfalfae in viroida HLVd smo raziskave razširili na temeljna proučevanja interakcije patogen-gostitelj ter na natančnejše opredelitve virulentnih dejavnikov V. nonalfalfae. Zgodba se je intenzivirala po izbruhu letalne hmeljeve uvelosti v slovenskih hmeljiščih leta 1997 in s prihodom Sebastjana v naš laboratorij za opravljanje magisterija in doktorata na tej problematiki. Sebastjan je na IHPS vzpostavil vse ustrezne razmere za rokovanje z izolati V. nonalfalfae, kamor med drugim sodijo izolacija, gojenje in hranjenje izolatov, testiranje virulence izolatov z umetnim okuževanjem testnih kultivarjev hmelja in ocenjevanje bolezenskih znakov. Pri tem delu mu je bilo v pomoč predhodno znanja in prakse, ki jih je razvila odlična fitopatologinja IHPS mag. Marta Dolinar. V okviru njegovega izobraževanja pa smo si zastavili naslednje okvirne cilje: - Razviti molekulsko metodo za ločevanje blagih in letalnih patotipov V. nonalfalfae - Izdelati molekulsko metodo za specifično določanje letalnih patotipov V. nonalfalfae - Ovrednotiti genetsko variabilnost in virulenco pri izolatih iz evropskih hmeljišč Vsi zastavljeni cilji so bili doseženi, seveda pa ni manjkalo vzponov in padcev, premagovanje dvomov in neprespanih noči, ki so običajni sopotniki izdelave vsakega doktorata. Sebastjan je zaključil doktorat leta 2004. Z razvitimi AFLP markerji smo kot prva raziskovalna skupina uspeli razločiti blage in letalne patotipe V. nonalfalfae (Radišek in sod., 2003), poiskati letalno specifične AFLP markerje in na njihovi osnovi izdelati poenostavljen protokol za določanje letalnih patotipov (Radišek in sod., 2004), ki je bil objavljen tudi v obliki mednarodnega diagnostičnega standarda z angleškimi raziskovalci (Down s sod., 2007). Z AFLP smo uspeli primerjati virulenco med izolati V. nonalfalfae iz evropskih hmeljišč, kar je služilo tudi za ugotavljanje izvora letalnih izolatov, ki so se pojavili v slovenskih hmeljiščih (Radišek in sod., 2006). Hmeljarski bilten / Hop Bulletin 26(2019) ______________ 13 Prvotno mnenje glede zadnjega je bilo, da imajo predvsem angleški in slovenski letalni izolati različen izvor ter da so se verjetno razvili iz blagih patotipov V. nonalfalfae, ki so že dolgo prisotni v hmeljiščih, vendar so zaradi blagih bolezenskih znakov neopazni in gospodarsko manj pomembni. Podobno mnenje smo imeli tudi po izbruhu letalne hmeljeve uvelosti v nemških hmeljiščih in na osnovi tega smo nadalje gradili proučevanja med blagimi in letalni patotipi s proteomskimi in genomskimi pristopi. To mnenje je bilo podkrepljeno tudi s primerjalno proteomsko analizo micelijskih proteinov blagega in letalnega patotipa iz Slovenije in Anglije, ki je pokazala geografsko ločitev obeh skupin patotipov in jasne razlike v njihovi virulenci (Mandelc in sod., 2009). Pri latentnem hmeljnem viroidu HLVd se je zgodba začela s problemi dr. Jelke Šuštar Vozlič s tkivnimi kulturami hmelja, kjer se je pojavil sum na prisotnost viroida. Za njegovo določitev je bilo potrebno privzeti metodo detekcije, ki je bila takrat uveljavljena v svetu (elektroforeza), vendar so bili prvi poskusi manj uspešni. Pozneje se je te problematike z veliko entuziazma lotila Vlasta Knapič z IHPS v okviru svojega magisterija (Knapič in Javornik, 1999), vendar se je pozneje odločila za odhod na Ministrstvo za kmetijstvo in gozdarstvo RS (MKGP). Leta 2002 smo pridobili Ciljni raziskovalni projekt za razvoj metode za določevanje viroida, pri katerem sta Jernej in Sebastjan vzpostavila molekulsko metodo RT- PCR in Dot-blot za rutinsko določanje HLVd (Jakše in sod., 2003). Problematika viroida, kot potencialnega povzročitelja bolezni, se je vrnila v naš laboratorij s pojavom hude zakrnelosti rastlin v hmeljiščih in z ugotavljanjem povzročitelja te bolezni. Trajalo je kar nekaj časa za identifikacijo povzročitelja te bolezni, potem pa se je uporabila novejša metoda določanja nukleotidnega zaporedja (NGS) in dopolnjujoče potrdilne metode, ki so razkrile in potrdile prisotnost novega viroida na hmelju CBCVd (slo. viroid razpokanosti skorje agrumov, angl. citrus bark cracking viroid), ki povzroča hudo viroidno zakrnelost rastlin hmelja (Jakše in sod., 2015). Hmelj predstavlja novega gostitelja za CBCVd, ki se je prenesel iz agrumov in povzroča zelo hudo neozdravljivo bolezen hmelja, zato so bila izdana tudi navodila in določeni uradni ukrepi za preprečevanje vnosa in širjenja te bolezni v Sloveniji (Radišek in sod., 2017). Določitev novega patogena v gostitelju je lahko zelo kompleksna naloga, včasih tudi neuspešna, vendar je možnost za uspešno rešitev problema večja ob poznavanju in uporabi novejših metodoloških pristopov. Raziskovanje problematike viroidov uspešno nadaljujejo nekdanji mlajši sodelavci v sodelovanju s češkimi eksperti na tem področju. 14 Hmeljarski bilten / Hop Bulletin 26(2019) ______________ 6 TEMELJNE ŠTUDIJE INTERAKCIJ MED HMELJEM IN POVZROČITELJEM HMELJEVE UVELOSTI (Vverticillium nonalfalfae) Namen teh študij je bil pridobiti osnovna znanja o mehanizmih interakcije med hmeljem in fitopatogeno glivo V. nonalfalfae, ki povzroča letalno obliko bolezni hmeljeve uvelosti. Vprašanji, ki smo si jih zastavili pri teh študijah, sta bili: - ali lahko zaznamo hmeljne gene / proteine, ki se izrazijo ali utišajo po okužbi z V. nonalfalfae v primerjavi z neokuženi rastlinami, na osnovi česar bi lahko sklepali o njihovi vpletenosti v obrambo oz. občutljivost rastline na okužbo; - ali je mogoče zaznati kakšne glivne proteine / gene v rastlini, ki bi lahko predstavljali njene potencialne virulentne dejavnike. Za izvedbo teh študij je bilo najprej potrebno vzpostaviti eksperimentalni sistem okuževanja, za kar smo izbrali na V. nonalfalfae odporen (Wye Target - WT) in občutljiv (Celeia - CE) kultivar hmelja ter nato merili odzive v različnih tkivih (korenine in steblo) ter v različnih časovnih točkah okuženih in neokuženih rastlin. Za izvedbo tega obsežnega eksperimenta, ki smo ga večkrat ponavljali, je odlično poskrbel Sebastjan. Za merjenje odziva odpornih in neodpornih rastlin na okužbo smo izbrali več globalnih pristopov: - transkriptomiko – to je analiza mRNA molekul, ki so prvi produkt genov; izbrali smo tri različne metode: cDNA-AFLP, RNA-seq in qRT-PCR posameznih genov, - proteomiko – to je analiza proteinov, ki so končni produkt genov; izbrali smo 2D-DIGE povezano s sekvenciranjem proteinov. Za vrednotenje rezultatov merjenja odziva pa smo uporabili različna bioinformacijska orodja. Kot številne ekspresijske analize tudi naše niso dale jasnih odgovorov. Rezultati teh študij se zaenkrat ne skladajo preveč dobro, predvsem pa ne ponujajo dokončnega odgovora, kateri geni WT bi lahko bili vključeni v obrambno reakcijo, tako da bo za ta odgovor potrebno še kar nekaj proučevanj. Proteomska študija na koreninah WT in CE ugotavlja akumulacijo genov za obrambo v občutljivem kultivarju CE in ne zazna nobenih infekcijsko specifičnih sprememb v odpornem kultivarju WT, s čimer sklepamo, da je pri WT konstitutivna in ne inducirana odpornost (Mandelc in sod., 2013). Podobne zaključke glede ekspresije genov ponuja tudi globalna študija 23.755 izraženih genskih modelov v koreninah in steblu v WT in CE, merjenih v štirih različnih časovnih točkah po okuževanju (Progar in sod., 2017), medtem ko študija qRT-PCR posameznih (9) diferencialno izraženih genov povezanih s splošnim imunskim odzivom ugotavlja, da so višje izraženi ti geni v WT kot v CE (Švara in sod., 2019). Pri študiju ekspresije genov s Hmeljarski bilten / Hop Bulletin 26(2019) ______________ 15 cDNA-AFLP pa je podana ugotovite, da so značilni geni za odpornostni odgovor induciranih pri obeh kultivarjih, izpostavlja pa močno izražene gene v odpornem kultivarju WT in utišane v CE, to je genov, ki so vpleteni v razgradnjo proteinov (Cregeen in sod., 2015). Zanimivo je, da sta v zadnjih dveh študijah predstavljena precej različna kolonizacijska vzorca glive pri WT in CE, kar bi si zaslužilo vsaj ustrezno interpretacijo, še bolje pa bi bilo ponoviti poskus in primerjati kolonizacijo glive rastlin WT in CE, določeno z qRT-PCR in z morfološkimi prerezi trt obeh kultivarjev. Je pa zadnja študija Cregeen in sod. (2015) identificirala tri glivne gene v transkriptomu hmelja, od katerih je eden (CBD) kazal zelo visoko ekspresijo posebno v občutljivem kultivarju CE. Zaradi visoke ekspresije je ta V. nonalfalfae gen / protein pritegnil našo pozornost in smo ga uvrstili v analize karakterizacije glivnih efektorjev (Volk in sod., 2019). Na tem mestu velja predstavit tudi eno naših prvih proteomskih študij, to je študije proteinov v ksilemskem soku okuženih rastlin hmelja. Leta 2005 smo namreč pridobili projekt za študijo proteinov in z nabavo nove opreme smo vzpostavili proteomski laboratorij pri katerem ima največ zaslug dr. Slavko Mandelc, ki je temeljito obvladal vse skrivnosti proteomske analize. Pri tej prvi proteomski analizi je Slavko na IHPS dneve in dneve potrpežljivo po kapljicah zbiral ksilemski sok z V. nonalfalfae okuženih rastlin Celeie. Proteine ksilema je analiziral z 2D elektroforezo in diferencialno izražene proteine smo nato poslali na identifikacijo v tujino, ki pa je bila bolj ali manj ponesrečena. Vendar smo le prejeli nekaj rezultatov in pozneje se je izkazalo, da so trije od identificiranih proteinov ksilemskega soka proteini glive V. nonalfalfae. Dva od njih smo v nadaljnjih analizah dokazali kot prve virulentne dejavnike V. nonalfalfae (Flajšman in sod., 2016). Iz študij interakcij med hmeljem in povzročiteljem hmeljeve uvelosti je Sara Cregeen diplomirala 2010 (mentor Jernej Jakše), Švara Anže je zaključil M.Sc. diplomo 2016 (mentorica Nataša Štajner), Vasja Progar je doktoriral 2017, Stanislav Mandelc pa je vključno še z dvema tematikama doktoriral leta 2010. 16 Hmeljarski bilten / Hop Bulletin 26(2019) ______________ 7 GENOMSKE IN PROTEOMSKE ŠTUDIJE VIRULENTNIH DEJAVNIKOV POVZROČITELJA HMELJEVE UVELOSTI (V. nonalfalfae) Pri iskanju odgovorov za razloge povišane virulence letalnega (L) patotipa v primerjavi z blagim (B) patotipom V. nonalfalfae smo, poleg domneve, da so se letalni patotipi razvili iz blagih s privzemom virulentnih dejavnikov, izhajali iz sledečih predhodnih rezultatov: - Izolati obeh patotipov iz geografsko različnih območij se ne ločijo po morfologiji. - Izolati obeh patotipov iz geografsko različnih območij se ločijo o v virulenci (Radišek in sod., 2003), o na DNA nivoju (Radišek in sod., 2006), o na proteomskem nivoju (Mandelc in sod., 2009). Za nadaljnja proučevanja iskanja odgovorov za razloge povišane virulence letalnega patotipa smo se odločili za primerjalno proteomsko in genomsko analizo treh blagih in treh letalnih patotipov V. nonalfalfae iz Slovenije, Anglije in Nemčije. Primerjalna proteomska analiza sekretornih proteinov pridobljenih iz izolatov gojenih na mediju podobnemu rastlinskemu ksilemskemu soku je sicer razkrila arzenal encimov za razgradnjo celične stene in potencialne efektorje, ki so bistveni za procese patogeneze in tvorijo sedaj pomemben nabor sekretornih proteinov V. nonalfalfae. Nismo pa našli skupnih proteinov prisotnih v vseh treh letalnih patotipih in odsotnih v blagih patotipih. Ti rezultati so nakazovali, da povečana virulenca vseh treh letalnih izolatov nima veliko skupnega glede na blage izolate in da je pomembnejša povišana ekspresija specifične skupine proteinov posameznega letalnega izolata (Mandelc in Javornik, 2015). To je bilo sicer rahlo razočaranje, vendar smo bili mnenja, da ima proteomska analiza 2D-DIGE verjetno prenizko resolucijo zajemanja globalne vsebnosti proteinov. Nekoliko več sreče smo imeli pri genomski analizi, v katero smo prav tako vključili tri letalne (L) in tri blage (B) izolate in sekvencirali njihove celotne genome ter naredili transkriptom domačih izolatov V. nonalfalfae (Rec in T 2), gojenih na mediju podobnemu rastlinskemu ksilemskemu soku (Jakše in sod., 2018). Ta pristop, ki vključuje vrsto (zapletenih) bioinformacijskih postopkov, je bil velik zalogaj za začetnike, vendar smo z dobro zgodbo in vztrajanjem tekom obdelave in analize podatkov ter s pomočjo bolj izkušenih sodelavcev pridobili dragocena znanja in veščine ter se opremili s prepotrebnimi bioinformacijskimi orodji, ki so, širše gledano, prispevala k premiku vsaj dela raziskovalne skupine na drugačen pristop k raziskovalni problematiki. Pri tem delu je bil najbolj angažiran dr. Jernej Jakše, ki se je tekom procesa razvil v dobrega bioinformatika. Hmeljarski bilten / Hop Bulletin 26(2019) ______________ 17 In kaj nam je pokazala primerjalna analiza treh L in treh B izolatov V. nonalfalfae na ravni genomov? Poleg množice bioinformacijkih podatkov, ki so bogat vir informacij za različna proučevanja in so urejeni v bioinformacijskih platformah (JBrowser in Marton in sod., 2018), smo s primerjalno genomsko analizo določili letalno specifične regije, prisotne samo v genomih letalnih izolatov in odsotne v blagih izolatih. Najbolj zanimivo je, da so si bile te letalno specifične regije med seboj zelo podobne v nukleotidnem zaporedju v vseh treh analiziranih genomih letalnih izolatih. To razkritje postavlja pod vprašaj našo predhodno domnevo o različnem izvoru slovenskih, angleških in nemških letalnih izolatov V. nonalfalfae. Namreč, zelo mala je verjetnost, da bi se isti mutacijski dogodki, to je razvoj nukleotidno podobnih regij genoma, dogodili v treh različnih geografskih regijah in v treh različnih časovnih obdobjih. Iz tega je mogoče sklepati, da se je verjetno letalni patotip V. nonalfalfae prenesel z Anglije, kjer se je prvič pojavil leta 1933, v Slovenijo (izbruh letalne hmeljeve uvelosti 1997), v Nemčijo (2005) in pozneje na Češkem, najverjetneje s sadilnim materialom. Vsekakor fitopatologi, ki delajo na hmelju, ne marajo takšnih špekulacij. Naše raziskave pa so pokazale tudi možnosti nastanka L patotipa. V teh letalno specifičnih regijah genoma smo namreč zasledili zaporedja genov, ki so sovpadala z zaporedji genov druge fitopatogene glive iz rodu Verticillum, V. dahliae. To nakazuje na možnost horizontalnega prenosa genov oz. na možnost, da je blag patotip V. nonalfalfae privzel gene iz V. dahliae (preko, pri nitastih glivah znanega paraseksualnega ciklusa) in tako povečal svojo virulenco, ter se torej spremenil v letalni patotip. Vendar je to le domneva, ki bi jo bilo potrebno eksperimentalno dokazati, kar smo tudi načrtovali. Žal pa to delo, ki bi lahko rezultiralo v zelo izvirnih dosežkih, v tem trenutku ostaja nedokončano. Pri analizi transkriptoma domačega L in B patotipa pa smo na samem začetku naše genomsko bioinformacijske avanture naključno izbrali 8 najvišje izraženih genov oz. genskih modelov v transkriptomu L patotipa iz letalno specifične regije genoma, ki smo jih nato vključili v mutacijsko analizo za potrditev njihove vpletenosti v virulenco. 8 KARAKTERIZACIJA POTENCIALNIH EFEKTORSKIH PROTEINOV POVEZANIH Z VIRULENCO V. nonalfalfae Za uspešno okužbo in kolonizacijo rastlin ter razvoj bolezenskih znamenj patogene glive izločajo tako imenovane virulentne dejavnike, med katere uvrščamo encime za razgradnjo celične stene, toksine in proteinske molekule imenovane efektorji, ki zavrejo ali modulirajo imunski odziv gostiteljske rastline ali pa jih rastlina prepozna in sproži obrambni odziv (avirulenčni efektorji). Za efektorje je najbolj 18 Hmeljarski bilten / Hop Bulletin 26(2019) ______________ značilno, da se izražajo v rastlini in da so manjše molekule brez značilnih proteinskih struktur, manj pa je znanega o mehanizmih njihovega delovanja, čeprav v zadnjem času na tem področju potekajo številne raziskave. Mnenja so, da bi identifikacija efektorjev in odkrivanje mehanizmov njihove virulentnosti lahko omogočila postavitev učinkovitih strategij zaščite rastlin pred škodljivimi organizmi. V našem primeru smo si za odkrivanja efektorjev V. nonalfalfae postavli sledeče kriterije: - Izražanje glivnega proteina v okuženi hmeljni rastlini ali v gojišču podobnemu ksilemskemu soku Iz predhodnih raziskav se je nabralo kar nekaj kandidatov: 2 proteina iz ksilemskega soka (Mandelc, 2010), CBD protein iz transkriptoma hmelja (Cregeen in sod., 2015), 8 naključno izbranih proteinov iz letalno specifične regije (Flajšman, 2016) in 5 kandidatnih efektorjev izbranih z bioinformacijskimi orodji (Marton in sod., 2018). - Mutacijska analiza kandidatnih efektorjev Za nedvoumno potrditev virulentnih lastnosti efektorjev smo v letalnem patotipu V. nonalfalfae mutirali (izbili) kandidatni efektorski gen, z mutirano glivo okužili rastline hmelja in spremljali razvoj bolezenskih znamenj. V primeru, da so se pri mutantu pojavila bolezenska znamenja v manjšem obsegu kot pri divjem tipu glive, smo sklepali o vpletenosti kandidatnega efektorja v virulenco V. nonalfalfae. Mutacijsko analizo, ki je zapleten postopek, je v našem laboratoriju uspešno vzpostavil dr. Marko Flajšman in je za 16 kandidatnih genov pripravil več neodvisnih mutantov (Flajšman, 2016), ki so bili testirani na občutljivih rastlinah Celeie pod budnim nadzorom Sebastjana. Za 7 mutantov se je izkazalo, da imajo znižano virulenco, en mutant je imel povišano virulenco v primerjavi z divjim tipom (verjetno aviruletni gen), ostali mutanti pa so povzročili podobne simptome na rastlini kot divji tip glive. Proteina iz ksilemskega soka (peroksidaza in majhen sekretorni protein SSP) sta nedvoumno pokazala vpletenost v virulenco in sta prva identificirana virulentna dejavnika pri glivi V. nonalfalfae (Flajšman in sod., 2016). Ostalih pet kandidatnih genov pa še čaka na ustrezno nadaljnjo obravnavo. - Biokemijska karakterizacija kandidatnih efektorjev Nadaljnja stopnja analize kandidatnih efektorjev je njihova biokemijska karakterizacija (interakcije z drugimi molekulami, lokalizacija v celici, struktura molekule, itd.) z namenom osvetliti mehanizme delovanja efektorja v rastlini. To delo uspešno izvaja kolegica dr. Sabina Berne. Hmeljarski bilten / Hop Bulletin 26(2019) ______________ 19 Do sedaj smo analizirali glivni CBD protein iz transkriptoma hmelja, katerega mutant sicer ni kazal zmanjšane virulence, vendar je bil zanimiv zaradi drugih lastnosti. Po obsežni karakterizaciji CBD proteina iz V. nonalfalfae, ki jo je pod somentorstvom Sabine izvajala mlada raziskovalka Helena Volk, se je izkazalo, da je to nov efektorski protein v fitopatogenih glivah, ki ima sposobnost vezave hitina v rastlini po okužbi in zaščiti glivo pred rastlinskimi hitinazami ter zavre s hitinom inducirano rastlinsko imunost (Volk in sod., 2019). Objava je bila deležna posebne pozornosti v ugledni fitopatološki reviji. Za SSP, ki se trenutno intenzivno analizira, pa se nakazuje, da se veže z enim lipidom v rastlinski membrani in tvori pore v njej ter tako omogoča vstop drugim efektorjem v celico. Upajmo, da bodo deležni ustrezne karakterizacije tudi ostali identificirani kandidatni efektorji V. nonalfalfae. Na gornji tematiki, h kateri so doprinesli nova znanja in vzpostavili nove metode, so doktorirali Marko Flajšman (2016), Kristina Marton (2018) in Helena Volk (2019). 9 ZAKLJUČEK Predstavljen je moj osebni pogled in spomini na preteklo delo pri genetiki hmelja in njegovih škodljivih organizmih. V te raziskave je bilo vključenih veliko sodelavcev in sodelavk, ki so doprinesli k rezultatom dela. Opravičujem se vsem, ki jih nisem posebej izpostavila ali omenila, s čimer ne zmanjšujem njihovega vrednega prispevka. Iskrena hvala vsem za zanimivo in lepo obdobje! 10 VIRI Cregeen S., Radišek S., Mandelc S., Turk B., Štajner N., Jakše J., Javornik B. Different gene expressions of resistant and susceptible hop cultivars in response to Infection with a highly aggressive strain of Verticillium albo-atrum. Plant Molecular Biology Reporter. 2015; 33: 689-704. Čerenak A., Jakše J., Javornik B. Application of sex-linked marker in hop (Humulus lupulus L.) breeding. V: 2nd Congress of Genetic Society of Slovenia with International Participation 2000, Bled, Congress Proceedings. 2000; 371-372. Čerenak A., C. Analysis of DNA markers for damson hop aphid resistance in hop. Zbornik Biotehniške fakultete, Kmetijstvo. 2002; 79:361-369. Čerenak A., Jakše J., Javornik B. Identification and differentiation of hop varieties using simple sequence repeat markers. Journal of the American Society of Brewing Chemists. 2003; 62: 1-7. Čerenak A., Šatović Z., Javornik B. Genetic mapping of hop (Humulus lupulus L.) applied to the detection of QTLs for alpha-acid content. Genome. 2006; 49(5):485-494. 20 Hmeljarski bilten / Hop Bulletin 26(2019) ______________ Čerenak A., Kolenc Z., Sehur P., Whittock S., Koutoulis A., Beatson R., Buck E., Javornik B., Škof S., Jakše J. New male specific markers for hop and application in breeding program. Scientific Reports. 2019; 9:1-9. Darby P. Single gene traits in hop breeding. In: Proceedins of Scientific Commission of the International Hop Growers Convention IHGC. Canterbury, UK. 2001; 76–80. Down G., Barbara D., Radišek S. Verticillium albo-atrum and V. dahliae on hop. Bulletin OEPP. 2007; 37: 528-535. Flajšman M. Določanje virulentnih dejavnikov fitopatogene glive Verticillium albo-atrum z mutacijsko analizo : doktorska disertacija. 2016; pp 139. Flajšman M., Mandelc S., Radišek S., Štajner N., Jakše J., Košmelj K., Javornik, B. Identification of novel virulence - associated proteins secreted to xylem by Verticillium nonalfalfae during colonization of hop plants. Molecular Plant-Microbe Interactions. 2016; 29: 362-373. Henning J.A., Steiner J.J., Hummer K.E. Genetic diversity among world hop accessions grown in the USA. Crop Sci. 2003; 44:411-417. Howard E., Whittock S., Jakše J., Carling J., Matthews P., Probasco G., Henning J.A.,Darby P., Čerenak A., Javornik B., Kilian A., Koutoulis A. High-throughput genotyping of hop (Humulus lupulus L.) utilising diversity arrays technology (DArT). Theoretical and Applied Genetics 2011; 122: 1265-1280. Jakše J., Šuštar-Vozlič, J., Javornik, B. Identification of hop cultivars by RAPD markers. V: Proceedings of the International Colloquium IPBA, Rogla, Slovenia. 1994; 147-151. Jakše J., Čerenak A., Javornik B. 2000. Molekularni markerji pri proučevanju genskih virov hmelja (Humulus lupulus L.) V: Novi izzivi v poljedelstvu 2000. Zbornik simpozija. Moravske Toplice. 2000; 144-148. Jakše J., Javornik B. High throughput isolation of microsatellites in hop (Humulus lupulus L.). Plant Molecular Biology Reporter. 2001; 19: 217-226. Jakše J., Kindlhofer K., Javornik B. Assesment of genetic variation and differentation of hop genotypes by microsatellite and AFLP markers. Genome. 2001; 44: 773-782 Jakše J., Bandelj-Mavsar D., Javornik B. Eleven new microsatellites for hop (Humulus lupulus L.). Molecular Ecology Notes. 2002; 2-4:544-546 Jakše J., Radišek S., Javornik B. Detection of hop latent viroid (HLVd) using dot-blot hybridisation assay and RT-PCR. V: 3nd Congress of Genetic Society of Slovenia with International Participation 2003, Bled, Congress Proceedings. 2003; 63-65. Jakše J., Šatovič Z., Javornik B. Microsatellite variability among wild and cultivated hops (Humulus lupulus L.). Genome. 2004; 47:889-899 Jakše J., Luthar Z., Javornik B. New polymorphic dinucleotide and trinucleotide microsatellite loci for hop Humulus lupulus L. Molecular Ecology Resources- 2008; 8: 769-772. Jakše J., Štajner N., Luthar Z., Jeltsch J-M., Javornik B. Development of transcript- associated microsatellite markers for diversity and linkage mapping studies in hop (Humulus lupulus L.). Molecular Breeding. 2011; 28: 227-239. Jakše J., Čerenak A., Radišek S., Satović Z., Luthar Z., Javornik B. Identification of quantitative trait loci for resistance to Verticillium wilt and yield parameters in hop (Humulus lupulus L.). Theoretical and Applied Genetics. 2013; 126:1431-1443. Jakše J., Radišek S., Pokorn T., Matoušek J., Javornik B. Deep-sequencing revealed Citrus bark cracking viroid (CBCVd) as a highly aggressive pathogen on hop. Plant Pathology. 2015; 64: 831-842. Hmeljarski bilten / Hop Bulletin 26(2019) ______________ 21 Jakše J., Jelen V., Radišek S., De Jong R., Mandelc S., Majer A., Curk T., Zupan B., Thomma B. P. H. J., Javornik B. Genome sequence of a lethal strain of xylem-invading Verticillium nonalfalfae. Genome Announcements. 2018; 6 (2): 1-2. JBrowser: http://vert.fri.uni-lj.si/browser Knapič V., Javornik B. Viroidi v slovenskem hmelju. Hmeljar. 1999; 68: 43-47. Kozjak P., Jakše J., Javornik B. Isolation and sequence analysis of NBS-LRR disease resistance gene analogues from hop Humulus lupulus L. Plant Science. 2009; 176: 775- 782. Kralj D., Zupanec J., Vasilj Đ., Kralj S., Pšeničnik J. Variability of essential oils of hops (Humulus lupulus L.). Journal of Institute of Brewing. 1991; 97:197-206. Majer A., Javornik B., Čerenak A., Jakše J. Development of novel EST-derived resistance gene markers in hop (Humulus lupulus L.). Molecular Breeding. 2014; 33: 61-74. Mandelc S., Radišek S., Jamnik P., Javornik B. Comparison of mycelial proteomes of two Verticillium albo-atrum pathotypes from hop. European Journal of Plant Pathology. 2009; 25: 159-171. Mandelc S. Proteomska analiza povzročiteljev hmeljeve uvelosti (Verticillium spp.) in diferencialno izraženih proteinov v hmelju po okužbi s patotipom PG2 Verticillium albo-atrum. Doktorska disertacija. 2010; 98. Mandelc S., Timperman I., Radišek S., Devreese B., Samyn B., Javornik B. Comparative proteomic profiling in compatible and incompatible interactions between hop roots and Verticillium albo-atrum. Plant Physiology and Biochemistry. 2013; 68: 23-31. Mandelc S., Javornik B. The secretome of vascular wilt pathogen Verticillium albo-atrum in simulated xylem fluid. Proteomics. 2015; 5: 787-797. Marton K., Flajšman M., Radišek S., Košmelj K., Jakše J., Javornik B., Berne S. Comprehensive analysis of Verticillium nonalfalfae in silico secretome uncovers putative effector proteins expressed during hop invasion. PloS one. 2018; 13: 1-28. Patzak J. Comparison of RAPD, STS, ISSR and AFLP molecular methods used for assessment of genetic diversity in hop (Humulus lupulus L.). Euphytica. 2001; 121: 9- 18. Progar V., Jakše J., Štajner N., Radišek S., Javornik B., Berne S. Comparative transcriptional analysis of hop responses to infection with Verticillium nonalfalfae. Plant Cell Reports. 2017; 36: 1599-1613. Radišek S., Jakše J., Javornik B. Optimisation of amplified fragment lenght polymorphism (AFLP) analysis of hop wilt (Verticllium alboatrum and Verticillium dahliae). Zbornik Biotehniške fakultete, Kmetijstvo. 2001; 77:139-146. Radišek S., Jakše J., Simončič A., Javornik B. Characterization of Verticillium albo-atrum field isolates using pathogenicity data and AFLP analysis. Plant Disease. 2003; 87:633- 638 Radišek, S., Jakše, J., Javornik, B. Development of pathotype-specific SCAR markers for detection of Verticillium albo-atrum isolates from hop. Plant Disease. 2004; 88:1115- 1122. Radišek S., (avtor, fotograf, urednik), Guček T., Leskovšek G., Benko-Beloglavec A., Jakše J., Javornik B. Huda viroidna zakrnelost hmelja. Žalec: Inštitut za hmeljarstvo in pivovarstvo Slovenije, 2017. Seefelder S., Ehrmaier H., Schweizer G., Seigner E. 2000. Genetic diversity and phylogenetic relationships among accessions of hops, Humulus lupulus, as determined 22 Hmeljarski bilten / Hop Bulletin 26(2019) ______________ by amplification fragment length polymorphism fingerprinting compared with pedigree data. Plant Breeding. 2000; 119: 257-233. Small E. A numerical and nomenclatural analysis of morpho-geographic taxa of Humulus. Systematic Botany. 1978; 3:37-76. Stevens J.F., Taylor A.W., Nickerson G.B., Ivancic M., Henning J., Hanunold A., Deinzer M.L. Prenylflavonoid variation in Humulus lupulus: distribution and taxonomic significance of xanthogalenol and 4’-O-methylxanthohumol. Phytochemistry. 2000; 53:759-775 Škof S., Čerenak A., Jakše J., Bohanec B., Javornik B. Ploidy and sex expression in monoecious hop (Humulus lupulus). Botany. 2012; 90: 617-626. Štajner N., Javornik B., Bandelj-Mavsar D. Protocol used for AFLP by automatic laser flourescence analysis. Zbornik Biotehniške fakultete, Kmetijstvo. 2003; 81:39-45. Štajner N., Jakše J., Kozjak P., Javornik B. The isolation and characterisation of microsatellites in hop (Humulus lupulus L.). Plant Science. 2005; 168:213-221. Šuštar-Vozlič J., Javornik B. Genetic relationships in cultivars of hop, Humulus lupulus L., determined by RAPD analysis. Plant Breeding. 1999; 118: 75-181. Švara A., Jakše J., Radišek S., Javornik B., Štajner N. Temporal and spatial assessment of defence responses in resistant and susceptible hop cultivars during infection with Verticillium nonalfalfae. Journal of Plant Physiology. 2019; 240: 1-12. Volk H., Marton K., Flajšman M., Radišek S., Tian H., Hein I., Podlipnik Č., Thomma B., Košmelj K., Javornik B., Berne S. Chitin binding protein of Verticillium nonalfalfae disguises fungus from plant chitinases and supresses chitin-triggered host immunity. Molecular Plant-Microbe Interactions. 2019; 32: 1378-1390.