Zbornik predavanj, 9.izobraževalni dan programa ZORA – ZORA 2019 31 Umestitev tekočinske citologije v program ZORA: predstavitev pilotne raziskave Veronika Kloboves Prevodnik 1 , Mario Poljak 2 , Anja Oštrbenk Valenčak 2 , Jerneja Varl 1 , Margareta Strojan Fležar 3 , Špela Smrkolj 4 , Urška Gašper Oblak 5 , Leon Meglič 4 , Maja Primic Žakelj 6 in Urška Ivanuš 6 1 Oddelek za citopatologijo, Onkološki inštitut Ljubljana, Zaloška 2, Ljubljana 2 Inštitut za mikrobiologijo in imunologijo, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Zaloška cesta 4, Ljubljana 3 Inštitut za patologijo, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Korytkova 2, Ljubljana 4 Ginekološka klinika, Univerzitetni klinični center Ljubljana, Zaloška 7, Ljubljana 5 ZD Ljubljana Moste-Polje enota Fužine, Preglov trg 14, Ljubljana 6 Državni program ZORA, Onkološki inštitut Ljubljana, Zaloška 2, Ljubljana Uvod V Sloveniji že od leta 2003 deluje državni presejalni program ZORA, ki je s preventivnimi pregledi celic v brisu materničnega vratu (BMV) in zdravljenjem pre- drakavih sprememb zmanjšal incidenco raka mater- ničnega vratu za polovico (1). Trenutno se v večini presejalnih programov kot presejalni test uporablja citološki pregled BMV, v katerem se iščejo maligne celice in celice s predrakavimi spremembami. Gine kolog s posebnim loparčkom in krtačko odvzame ce- lice transformacijske cone materničnega vratu in do- datno materničnega kanala, da pridobi vzorec, ki ga razmaže na objektno stekelce. Z mikroskopskim pre- gledom na stekelcih fiksiranih in obarvanih celic je mogoče odkriti celične spremembe, ki bi lahko vodile v razvoj raka materničnega vratu (2). Čeprav je cito- loška ocena BMV dolgo časa veljala za zlati standard v presejalnih programih, ima določene omejitve, ki Povzetek Državni presejalni program ZORA je od leta 2003 prepolovil incidenco raka materničnega vratu (RMV) med slovenskimi ženskami. Zaradi odlične kakovosti in rezultatov konvencionalne citologije do sedaj ni bilo potrebe po spremembi presejalne politike. Zaradi novih evropskih smernic in vstopa prvih ge- neracij deklic, cepljenih proti HPV v program pa se moramo tudi v Sloveniji počasi pripraviti na prehod na primarno HPV presejanje vsaj za del presejalne populacije. Glavna prednost testa HPV je boljša ob- čutljivost za odkrivanje predrakavih sprememb (CIN2+) in večja varnost pred RMV v primerjavi s cito- logijo. Vendar pa visoka občutljivost testa lahko vodi v odkrivanje prehodnih in klinično nepomembnih HPV okužb, kar zniža specifičnost presejanja. Tudi zaradi tega evropske smernice svetujejo, da se pri uvedbi primarnega HPV presejanja uvede tudi refleksno triažno testiranje, ki omogoča izvedbo prese- jalnega in triažnega testiranja iz istega vzorca. V Sloveniji z obstoječo tehnologijo, ki jo uporabljamo v programu ZORA, tega trenutno ni mogoče izvesti. Zato je pred uvedbo primarnega HPV presejanja nujna uvedba tekočinske citologije (TC), pri kateri se celice namesto na steklo prenesejo v tekočinski medij. Takšen odvzem in shranjevanje vzorca nam omogoči, da se na enem vzorcu izvede več različnih testov. Kljub temu moramo biti pri uvedbi TC previdni, ker se morfološke značilnosti celic v preparatih TC in konvencionalne citologije razlikujejo, kar lahko vpliva na pravilnost ocene celičnih sprememb. Z uvedbo TC v Sloveniji in v programu ZORA se občutljivost in specifičnost citologije za odkrivanje CIN2+ ne smeta zmanjšati, saj bi s tem lahko ogrozili zdravje slovenskih žensk in dobre rezultate programa ZORA. Zato je nujno slovenske presejalce in citopatologe izšolati za ocenjevanje preparatov, narejenih iz tekočinskega vzorca. S tem namenom pripravljamo pilotni projekt, s katerim želimo ocenjevanje TC varno umestiti v vse citopatološke laboratorije, ki sodelujejo v državnem programu ZORA. Ključne besede: presejanje RMV, program ZORA, tekočinska citologija, pilotna raziskava Zbornik predavanj, 9.izobraževalni dan programa ZORA – ZORA 2019 32 jih je delno mogoče premostiti s ponavljanjem testi- ranja vsake 3 leta. Glavna pomanjkljivost pregleda BMV je majhna občutljivost (povprečna 53%) za od- krivanje predrakavih sprememb (CIN2+) (3). To je lahko posledica neustrezno odvzetega vzorca, neus- trezne priprave preparata ali napačne interpretacije (4). Poleg tega so citološke ocene za spremembe nizke stopnje slabo ponovljive in imajo nizko stopnjo strinjanja, celo med strokovnjaki v kakovostnih, nad- zorovanih presejalnih programih (5). Da bi premostili te pomanjkljivosti, so raziskovalci začeli razvijati nove metode, kot je tekočinska citologija (TC). Pri TC se celice namesto na steklo prenesejo v tekočinski medij. Po svoji sestavi je medij fiksativ, ki v veliki meri ohrani morfološke, antigenske in molekularne last- nosti celic. Celice, suspendirane v mediju, se nato z metodo filtracije ali sedimentacije v posebnem apa- ratu nanesejo na stekelca in pobarvajo po metodi Pa- panicolaou. TC zmanjša kontaminacijo vzorca s krv- nimi celicami, sluzjo in gnojem, kar dokazano zmanjša število neuporabnih vzorcev. Dodatna pred- nost TC je tem, da je mogoče opraviti več testov na istem vzorcu (npr. HPV test), kar zmanjša stroške in obseg dela. Najpogostejša medija, ki se uporabljata pri metodi TC, sta ThinPrep (Hologic, Marlborough, MA, ZDA) in BD SurePath (BD, Franklin Lakes, NJ, ZDA). Od nedavnega sta na tržišču še medija Roche Cell Collection Medium podjetja Roche (Basel, Švica) ter NOVAprep podjetja Novacyt (Vélizy-Villacoublay, Francija). Številne raziskave so že primerjale TC s konvencionalno citologijo, vendar so bile večinoma izvedene na vzorcih, shranjenih v ThinPrep ali Su- rePath mediju. V teh raziskavah so ugotovili, da upo- raba TC zmanjša število neuporabnih vzorcev, nima pa večjega učinka na občutljivost in specifičnost. Nizka občutljivost je tako še vedno glavna omejitev tako konvencionalne kot tekočinske citologije (6). Dodatna omejitev je slaba ponovljivost rezultatov, ki je posledica razlik v ocenjevanju morfoloških lastno- sti preparatov, tako med laboratoriji kot med ocenje- valci. Zato se občutljivost in specifičnost citologije pomembno razlikujeta med različnimi laboratoriji in med ocenjevalci. Zaključki nedavne raziskave o rezul- tatih konvencionalne citologije v evropskih in se- verno ameriških državah so pokazali, da je povprečna občutljivost enega testa za odkrivanj e C I N 2 + 5 3 % , vendar z zelo visoko specifičnostjo. Majhna občutlji- vost testa je posledica variabilnosti med državami in se giblje od 18,6 % v Nemčiji in 76,7 % v Veliki Britaniji (7). Ti rezultati so skladni z nedavno raziskavo, ki je pokazala, da je občutljivost citologije za odkrivanje CIN2+ v Sloveniji 66,2 % (8). To pomeni, da v deželah z nizko občutljivostjo citologije predrakave in rakave spremembe na materničnem vratu spregledajo pri približno polovici žensk, ki te spremembe že imajo. Zato je citologijo v presejalnih programih nujno po- trebno večkrat ponoviti v ustreznih presejalnih inter- valih, ki naj ne bi bili krajši od treh let. Na tak način se občutljivost citologije poveča na okoli 70–80 %, specifičnost pa se pomembno ne zmanjša. Odkritje, da je okužba z visokotveganimi človeškimi papilomavirusi (HPV) nujen vendar nezadosten po- goj za razvoj RMV, je omogočilo razvoj številnih mo- lekularnih testov (9) in alternativo citologiji kot pri- marni presejalni test. V randomiziranih kliničnih po- skusih in metaanalizah so ugotovili, da ima HPV-testi- ranje višjo občutljivost za CIN2+ in ponuja večjo in daljšo varnost pred RMV v primerjavi s citologijo (10, 11). Tako so leta 2015 izšle dopolnitve Evropskih smernice za zagotavljanje kakovosti v presejanju za raka materničnega vratu (angl. European guidelines for quality assurance in cervical cancer screening), v katerih se državam članicam Evropske zveze pripo- roča presojo spremembe presejalne politike v orga- niziranih presejalnih programih za raka maternič- nega vratu, in sicer tako, da se pri ženskah (starejših od 35 let in cepljenih proti okužbi s HPV) namesto ci- tološkega pregleda BMV uporabi test HPV (12). Ven- dar visoka občutljivost testa HPV vodi v odkrivanje prehodnih in klinično nepomembnih HPV okužb, ki ne predstavljajo večjega tveganja za razvoj RMV. Nižjo specifičnost HPV testov (11) lahko povečamo z uporabo triažnih testov, ki izmed vseh HPV pozitivnih žensk odkrijejo tiste z večjim tveganjem RMV. Med trenutno najbolj preučevane triažne metode sodijo: refleksna citologija, dvojno p16/Ki-67 imunocito- kemično barvanje (ICK), genotipizacija HPV16/HPV18, metilacija in drugi obetavni moleku- larni testi (13). Omenjene evropske smernice pripo- ročajo refleksno testiranje, ki omogoča izvedbo pre- sejalnega in triažnega testiranja iz istega vzorca, s či- mer znižamo stroške, število (ne)potrebnih pregle- dov ter kolposkopij in obremenitev žensk, ki se ude- ležujejo preventivnih programov (12). V Sloveniji je konvencionalna citologija zelo kako- vostna (delež uporabnih brisov znaša 99.9% (1)) in do nedavnega ni bilo potrebe po vpeljavi TC. Zaradi no- vih evropskih smernic, ki priporočajo uvedbo primar- nega HPV testiranja v organizirane presejalne pro- grame (12), in zaradi vstopa prvih generacij deklic, cepljenih proti HPV v program ZORA, se moramo tudi v Sloveniji pripraviti na spremembo presejalne poli- tike za odkrivanje raka materničnega vratu in more- bitno uvedbo primarnega presejanja s testom HPV pri izbranih ženskah. Prvi korak predstavlja uvedba Zbornik predavanj, 9.izobraževalni dan programa ZORA – ZORA 2019 33 tekočinske namesto trenutne konvencionalne citolo- gije, ki bo omogočila refleksno testiranje, kar je pred- pogoj za uvedbo primarnega HPV testiranja. Pri tem moramo biti previdni, ker se morfološke značilnosti celic v preparatih TC in konvencionalne citologije raz- likujejo, kar lahko vpliva na pravilnost ocene celičnih sprememb. Zato je nujno slovenske presejalce in ci- topatologe pred uvedbo TC izšolati za ocenjevanje preparatov, pripravljenih iz tekočinskega vzorca. Iz- kušnje iz tujine kažejo, da se ob prehodu na tekočin- sko citologijo lahko zmanjšata tako občutljivost kot predvsem specifičnost, še posebej, če so bili rezultati konvencionalne citologije zelo dobri. Z uvedbo TC v Slovenijo in v program ZORA se občutljivost in speci- fičnost citologije za odkrivanje CIN2+ ne smeta zmanjšati, saj bi s tem ogrozili zdravje slovenskih žensk in dobre rezultate programa ZORA. Zato pri- pravljamo pilotni projekt, s katerim želimo ocenjeva- nje TC varno umestiti v vse citopatološke laborato- rije, ki sodelujejo v državnem programu ZORA. Drugi korak verjetne spremembe presejalne politike bo predstavljala uvedba primarnega HPV testiranja in izbor ustrezne triažne metode. Trenutno ni pripo- ročene, enotne triažne metode, s katerim bi HPV po- zitivne ženske ali napotili na kolposkopijo ali vrnili na- zaj v rutinsko presejanje. Izbira ustreznega testa HPV in triažna strategije za HPV pozitivne ženske ostaja eno izmed ključnih vprašanj, s katerimi se trenutno soočajo države pri spremembah presejalnih progra- mov (13). V ta namen bo pilotnemu projektu za ume- stitev TC sledil še drugi del raziskave, v katerem bomo v komercialno dostopnih medijih za tekočin- sko citologijo preverjali zanesljivost različnih testov HPV in ustreznost in možnost izvedbe različnih triaž- nih strategij. Materiali in metode Načrt raziskave: V prvi del raziskave bomo vključili 1.200 žensk, od tega 800 žensk, ki bodo v skladu s slovenskimi smernicami napotene na kolposkopijo, in 400 žensk, ki bodo v skladu s smernicami prišle na redni presejalni pregled ZORA (14). Ginekolog bo vsaki ženski, ki bo prostovoljno pristala na sodelova- nje v raziskavi, odvzel dva BMV, enega za klasično ci- tologijo in drugega za TC. Predvidevamo, da bomo v raziskavo vključili štiri vrste transportnih medijev in za vsako vrsto medija pridobili 300 vzorcev (Slika 1). Iz vsakega vzorca TC bomo nato z ustreznim apara- tom za pripravo vzorcev TC pripravili en preparat za citološko oceno in enega za validacijo dvojnega p16/Ki-67 ICK barvanja. Preostanek vzorca bomo raz- delili na manjše dele (alikvotirali) in jih shranili na - 70°C za nadaljnje raziskave. Vse ženske, ki bodo so- delovale v raziskavi, bodo podpisale Izjavo o zavestni in svobodni privolitvi za sodelovanje v raziskavi po pojasnilu. Protokol raziskave je odobrila Komisija Re- publike Slovenije za medicinsko etiko (št. 0120- 329/2019/8). Odvzem vzorcev: Ginekolog bo ženskam, ki bodo pri- šle na odvzem presejalnega BMV ali bodo v skladu s smernicami napotene v kolposkopsko ambulanto, odvzel dva BMV. Iz prvega BMV bo naredil dva kla- sična razmaza in ju fiksiral z MercoFix (Merck) prši- lom. Drugi BMV bo dal v enega od štirih transportnih medijev, ki jih bomo testirali v raziskavi. Za vsak transportni medij bomo pridobili 300 vzorcev. Priprava vzorcev TC za citologijo: Iz vsakega vzorca bomo na ustreznem aparatu naredili citološke prepa- rate po navodilih proizvajalca. Predvidevamo, da bomo uporabili tri vrste aparatov, enega firme Holo- gic (Marlborough, Massachusetts, ZDA), drugega Novacyt (Vélizy-Villacoublay, Francija) in tretjega BD Totalys SlidePrep (BD Diagnostics, Burlington, North Carolina, ZDA) Priprava preparatov TC bo potekala na Onkološkem inštitutu Ljubljana (OIL). Slika 1. Shematični prikaz prvega dela pilotne raziskave za umestitev tekočinske citologije v državni presejalni program ZORA. Zbornik predavanj, 9.izobraževalni dan programa ZORA – ZORA 2019 34 Barvanje po Papanicolaou: Preparate za citološko oceno, ki jih bomo naredili z aparatom firme Hologic ali Novacyt, bomo pobarvali po metodi Papanico- laou, ki se uporablja rutinsko na Onkološkem inšti- tutu Ljubljana ali po navodilih proizvajalca v barvalcu Leica ST5020 Multistainer (Leica Microsystems, Wet- zlar, Germany). Preparati, ki jih bomo naredili z apa- ratom BD Totalys SlidePrep (BD Diagnostics, Bur- lington, NC) se bodo pobarvali v samem aparatu. Bar- vanje po Papanicolaou bo potekalo na OIL. Validacija dvojnega p16/Ki-67 ICK barvanja: Za vali- dacijo bomo uporabili test CINTeck plus (Roche, Ba- sel, Švica). Za vsak transportni medij bomo validacijo izvedli na 20 vzorcih. Preparate konvencionalne in TC bomo barvali v skladu z navodili proizvajalca na bar- valcu Bench Mark ULTRA ali BechMArk XT (Roche, Basel, Švica) na OIL. Ocena citoloških vzorcev in napotitev na nadaljnjo obravnavo: K sodelovanju v raziskavi bodo povab- ljeni vsi presejalci in citopatologi, ki sodelujejo v DP ZORA. Pred začetkom raziskave se bodo udeležili šo- lanja za oceno preparatov TC, ki ga bomo organizirali na sedežu programa ZORA. Preparate TC bodo oce- njevali na enak način kot konvencionalne BMV. Imeli bodo podatke o starosti ženske, menstruacijskem ciklusu in razlogih za odvzem BMV. Po zaključenem ocenjevanju bomo za vse ocenjevalce preverili skla- dnost citoloških ocen med ocenjevalci in laboratoriji ter ocenili zanesljivost testa za detekcijo CIN2+. Žen- ske bodo na nadaljnjo obravnavo napotene v skladu s smernicami, obravnava žensk se zaradi sodelovanja v prvem delu raziskave ne bo spremenila. Ocenjeva- nje preparatov TC bo potekalo v vseh citopatoloških laboratorijih, ki so vključeni v DP ZORA. Shranjevanje vzorcev: Ostanke vzorcev TC bomo raz- delili na manjše dele in jih shranili na -70°C. Razdeli- tev in shranjevanje vzorcev bo potekalo na Inštitutu za mikrobiologijo in imunologijo (IMI) Medicinske fa- kultete Univerze v Ljubljani. Statistična obdelava: Uporabili bomo osnovne stati- stične metode, metode za ocenjevanje ujemanja re- zultatov testov v različnih medijih, mere veljavnosti testov in medijev za CIN2+ in CIN3+ (občutljivost, specifičnost, pozitivna in negativna napovedna vre- dnost), primerjali bomo rezultate različnih testov in medijev, ter opravili stratificirane analize glede na starost in druge pomembne napovedne dejavnike za opazovani izid. Pričakovani rezultati Pričakujemo: • da se citološke ocene preparatov tekočinske ci- tologije ne bodo bistveno razlikovale od klasične citologije; • da bo citološko ocenjevanje preparatov tekočin- ske citologije enako zahtevno za vse testirane komercialno dostopne transportne medije; • da se bodo sistemi za pripravo preparatov razli- kovali v predpisanih protokolih, v času potreb- nem za pripravo vzorca in nivoju avtomatizacije; • da bo volumen testiranih transportnih medijev zadosten za izvedbo naslednjih triažnih testov: citologija, p16/Ki-67 dvojno imunocitokemično barvanje, več različnih testov HPV z različnimi nivoji genotipizacije in metilacijski testi; • da se učinkovitost citologije, p16/Ki-67 dvoj- nega imunocitokemičnega barvanja, testa(ov) HPV z genotipizacijo in metilacija DNA ne bo raz- likovala med testiranimi komercialno dostop- nimi transportnimi mediji. Literatura 1. National Cervical Cancer Screening Programme ZORA. (Slovenian): DP ZORA: Kazalniki. (online); https://zora.onko-i.si/https://zora.onko-i.si/publika- cije/kazalniki/ (Accessed 2018 Mar 29). 2. Bengtsson E, Malm P: Screening for cervical cancer using automated analysis of PAP-smears. Comput Math Methods Med. 2014; 2014: 842037. 3. Cuzick J, Clavel C, Petry KU, Meijer CJ, Hoyer H, Rat- n a m S , e t a l : O v e r v i e w o f t h e E u r o p e a n a n d N o r t h American studies on HPV testing in primary cervical cancer screening. International journal of cancer. 2006; 119: 1095-101. 4. Siebers AG, Klinkhamer PJ, Grefte JM, Massuger LF, Vedder JE, Beijers-Broos A, Bulten J, Arbyn M: Com- parison of liquid-based cytology with conventional cytology for detection of cervical cancer precursors: a randomized controlled trial. JAMA. 2009; 302(16):1757-64. doi: 10.1001/jama.2009.1569. 5. Feldman S: Human papillomavirus testing for pri- mary cervical cancer screening: is it time to abandon Papanicolaou testing? JAMA Intern Med. 2014; 174: 1539-40. 6. Sigurdsson K: Is a liquid-based cytology more sensi- tive than a conventional Pap smear? Cytopathology. 2013; 24: 254-63. 7. Cuzick J, Clavel C, Petry KU, Meijer CJ, Hoyer H, Rat- nam S, et al: Overview of the European and North American studies on HPV testing in primary cervical cancer screening. International journal of cancer. 2006; 119: 1095-101. 8. Poljak M, Ostrbenk A, Seme K, Sterbenc A, Jancar N, Vrtacnik Bokal E. Three-year longitudinal data on the Zbornik predavanj, 9.izobraževalni dan programa ZORA – ZORA 2019 35 clinical performance of theAbbott RealTime high risk HPV test in a cervical cancer screening setting. J Clin Virol.2016; 76:S29 –S39. 9. zurHausen H: Papillomavirus infections — a major cause of human cancers. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. 1996; 1288: F55- F78. 10. Ronco G, Dillner J, Elfström KM, Tunesi S, Snijders PJ, Arbyn M, Kitchener H, Segnan N, Gilham C, Giorgi- R o s s i P , B e r k h o f J , P e t o J , M e i j e r C J ; I n t e r n a t i o n a l HPV screening working group: Efficacy of HPV-based screening for prevention of invasive cervical cancer: follow-up of four European randomised controlled trials. Lancet. 2014 Feb 8;383(9916):524-32. 11. Koliopoulos G, Nyaga VN, Santesso N, Bryant A, Mar- tin-Hirsch PP, Mustafa RA, Schünemann H, Para- skevaidis E, Arbyn M; Cytology versus HPV testing for cervical cancer screening in the general population. Cochrane Database Syst Rev. 2017; CD008587. doi: 10.1002/14651858.CD008587.pub2. 12. von Karsa L, Arbyn M, De Vuyst H, Dillner J, Dillner L, Franceschi S, et al. European guidelines for quality assurance in cervical cancers screening. Summary of the supplements on HPV screening and vaccination. Papillomavirus Res 2015; 1: 22-31. 13. Cuschieri K, Ronco G, Lorincz A, Smith L, Ogilvie G, Mirabello L, Carozzi F, Cubie H, Wentzensen N, Snijders P, Arbyn M, Monsonego J, Franceschi S. Eurogin roadmap 2017: Triage strategies for the ma- nagement of HPV-positive women in cervical scree- ning programs. Int J Cancer. 2018; 143(4) :735-745. doi: 10.1002/ijc.31261. 14. Ursic-Vrscaj M, Rakar S, Možina A, Kobal B, Takač I, Deisinger I, Ursic-Vrscaj M. (Slovenian) editor. Lju- bljana; Institute of Oncology Ljubljana: 2011. (Guide- lines for management of women with cervical pre- cancerous lesions) https://zora.onko-i.si/filead- min/user_upload/dokumenti/strokovna_priporo- cila/2011_Smernice_web.pdf (cited 2018 Mar 15).