Razvoj polielektrolitne nanoobloge na mikrodelcih uœinkovine
Razvoj polielektrolitne nanoobloge na mikrodelcih uœinkovine
Development of polyeleytrolyte nanocoating on drug microparticles
Andrej Dolenc, Julijana Kristl
Povzetek: Nanooblaganje omogoœa izdelavo obloge z debelino od nekaj deset do nekaj sto nanometrov. Nanooblogo na mikrodelcih ibuprofena smo izdelali z metodo nanoplastenja (plast na plast nanooblaganje), ki temelji na izmeniœni elektrostatski adsorpciji nasprotno nabitih polielektrolitov. Deset- do tridesetplastno nanooblogo smo izdelali z zaporedno izmeniœno adsorpcijo hitosana in alginata. Z merjenjem zeta potenciala delcev smo potrdili nanos posamezne polimerne plasti, obstoj izredno tanke plastne obloge pa po konœanem postopku ĝe s posnetki optiœnega in vrstiœnega elektronskega mikroskopa. Takĝne polielektrolitne obloge lahko uporabimo za spreminjanje povrĝinskih lastnosti snovi, kot so izboljĝan stik povrĝine z bioloĝkim materialom, biokompatibilnost ter kontrolirano raztapljanje.
Kljuœne besede: ultratanka obloga, metoda nanoplastenja (plast na plast), nanooblaganje, polielektrolit, hitosan, alginat
Abstract: Nanolayering can be used to produce a coating with thickness in a range of few tens to hundreds nanometers. Ibuprofen microparticles were used as cores for ultrathin coating produced using a layer-by-layer nanoassembly technique based on electrostatic adsorption of oppositely charged polyelectrolytes. 10- to 30-layered nanocoatings were made by alternating adsorption of chitosan and alginate. Each addition of the oppositely charged polyelectrolyte layer was confirmed by measuring its zeta potential. Optical and scanning electron microscopy were used to ascertain the presence of polyelectrolyte nanocoating. Such coatings can be used to change surface properties to give, for example, better contact with biologic material, higher biocompatibility and controlled dissolution.
Key words: ultrathin film, layer-by-layer nanoassembly, nanocoating, polyelectrolyte, chitosan, alginate
1 Uvod
Biokompatibilni polimeri imajo veliko vlogo v sodobnem oblikovanju zdravil in ĝtevilnih medicinskih pripomoœkov. Dobro desetletje jih uporabljajo tudi za izdelavo nanooblog, ki so najmanj 1000-krat tanjĝe kot ĉe dolgo znane filmske obloge. Novejĝa metoda za izdelavo nanooblog je nanoplastenje (plast na plast nanooblaganje), ki temelji na zaporedni adsorpciji nasprotno nabitih polimerov na doloœeno nabito povrĝino. Metodo je leta 1991 uvedel Decher s sodelavci (1). Vsak korak vodi do tvorbe nove plasti in inverzije naboja. Rezultat je obloga, sestavljena iz veœ plasti, stabiliziranih z moœnimi elektrostatskimi vezmi (slika 1). Debelino obloge lahko s tovrstnim oblaganjem kontroliramo v obmoœju nekaj nanometrov (2-6).
Za tvorbo nanoobloge so najprimernejĝi polielektroliti, ki se elektrostatsko veĉejo na oblaganec. Prvi sloj se veĉe neposredno na njegovo povrĝino, zato mora le-ta imeti doloœen naboj. Pri oblagancu z manjĝo sposobnostjo tvorjenja elektrostatskih interakcij se pri prvih nanosih ojaœa povrĝinska funkcionalnost. Na povrĝino se veĉe plast polielektrolita, ki ima veœ skupin za vezavo naslednje plasti (2-5).
Nanooblaganje izvedemo tako, da povrĝino oblaganca izmeniœno izpostavljamo raztopinam nasprotno nabitih polielektrolitov (slika 1). Koncentracija polielektrolitov v raztopinah obiœajno znaĝa nekaj mg/ml in je velikokrat precej veœja, kot je potrebna za samo oblaganje, vendar s takĝno doseĉemo hitrejĝe prekritje celotne povrĝine. Po doloœenem œasu, ki je potreben, da se na povrĝino veĉe polielektrolitni sloj (obiœajno 10 do 30 min), oblaganec dva- ali trikrat speremo s preœiĝœeno vodo, da odstranimo nevezane ter ĝibko vezane polielektrolitne molekule, ki bi bile moteœe ob dodatku nasprotno nabitega polielektrolita. Oœiĝœeno povrĝino nato izpostavimo raztopini nasprotno nabitega polielektrolita ter jo po preteku inkubacije ravno tako speremo s preœiĝœeno vodo. Cikel ponavljamo tako dolgo, da dobimo oblogo z ĉelenim ĝtevilom polielektrolitnih plasti na povrĝini, ki jo oblagamo (7, 8, 9).
V dobrem desetletju po uvedbi te metode so za oblaganje uporabljali veœ razliœnih snovi. Najveœ raziskav so opravili s polistirensulfonatom, polialilamin kloridom, poliakrilno kislino, polidimetildialilamonijevim kloridom ter polietileniminom. Materiali za farmacevtske namene
asist. Andrej Dolenc, mag. farm., Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Aĝkerœeva 7, 1000 Ljubljana prof. dr. Julijana Kristl, mag. farm., Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Aĝkerœeva 7, 1000 Ljubljana
farm vestn 2008; 59 273
FV 5 2008 prelom.xp:FV 2 2007 prelom zadnji.xp 11/18/08 8:15 AM Page 274
-^-
Pregledni znanstveni œlanki - Review Scientific Articles
morajo biti biokompatibilni, poleg tega pa je zaĉeleno, da so tudi biorazgradljivi. Med primerne polimere za oblaganje uvrĝœamo kationske in anionske polielektrolite. Primeri kationskih so: hitosan, ĉelatina in poli-D-lizin, anionskih pa: karboksimetilceluloza, dekstran sulfat in alginat (2, 5). Obstaja pa tudi moĉnost uporabe drugih naravnih polimerov z nabojem (npr. ksantan) (10), ter polimerov, ki jih uporabljajo za izdelavo t. i. inteligentnih hidrogelov (za pH, temperaturo, glukozo ali proteine obœutljivi polimeri) (11). Spojine naravnega izvora imajo prednost pred sinteznimi zaradi lahke dostopnosti, nizke cene in relativno majhne toksiœnosti. Poleg tega jih lahko na razliœne naœine modificiramo, da dobimo ĉelene lastnosti (12).
Slika 1: Shematski prikaz nanoplastenja s polielekroliti. Povrĝino za oblaganje izmeniœno izpostavljamo raztopinam polianionov (1) in polikationov (3), vmes pa spiramo s preœiĝœeno vodo (2, 4) (prirejeno po 7)
Figure 1: Schematic illustration of layer-by-layer nanocoating with polyelectolytes. The substrate to be coated is dipped alternately in solutions of polymers with negative (1) and positive charges (3) with intermediate washing cycles (2, 4) (edited from 7).
Nanoobloga prispeva h konœni prostornini in masi oblaganca obiœajno le minimalno, medtem ko zaradi spremenjenih povrĝinskih lastnosti lahko moœno vpliva na obnaĝanje v organizmu (28). Sprva so oblagali predvsem veœje in ravne povrĝine, sœasoma pa so tovrstno oblaganje razĝirili tudi na povrĝine drugaœnih oblik. Z enakomerno in stabilno oblogo so obloĉili vsadke, delce uœinkovine, celice ipd. Razvoj odpira ĝtevilne moĉnosti za oblikovanje obloge z zelo specifiœnimi lastnostmi, kar ĝiri obmoœje njihove uporabnosti.
Vsadke so najpogosteje oblagali, da bi izboljĝali njihovo biokompatibilnost, saj so pogosto izdelani iz snovi s sicer ustreznimi mehanskimi lastnostmi (trdnostjo, elastiœnostjo ipd.), toda telo jih lahko zavrne zaradi neprimernih povrĝinskih lastnosti. Tako so obloĉili vsadke iz titana (13, 14, 15), silikona (2) ali polietilentereftalata (16, 17, 18, 19) in znotrajĉilne ĉiœne opornice (16, 20, 21). Raziskujejo tudi nanooblaganje kostnih vsadkov z oblogo, v katero so vkljuœili veœ uœinkovin (protivnetne in protiboleœinske uœinkovine, antibiotike ter
rastne faktorje), ki se sproĝœajo v doloœenem œasovnem zaporedju in tako omogoœajo, da telo najbolj optimalno sprejme vsadek.
S to metodo je mogoœe izdelati tudi prazne mikrokapsule z debelino ovojnice v nanometrskem obmoœju in jih napolniti z razliœnimi zdravilnimi uœinkovinami ter tako zagotoviti zaĝœito vsebine in njeno prirejeno sproĝœanje (6). Na ta naœin so izdelali bioadhezivne oblike za oko s ciprofloksacinom. Delce Ca-fosfata ter eritrocite so uporabili kot jedra, na katera so nanesli 10-plastno nanooblogo, sestavljeno iz polialilamin klorida ter alginata. Nato so obloĉene delce inkubirali v 10 % raztopini ciprofloksacin klorida in pod doloœenimi pogoji odstranili jedra. Ugotovili so, da se je uœinkovina v zadostni meri zadrĉala v polielektrolitni oblogi oz. mikrokapsuli. Nato so z in vivo poskusi na zajcih dokazali, da bi jih lahko uporabili kot varen in uœinkovit sistem s podaljĝanim sproĝœanjem za dostavo uœinkovine na oko (22). V drugem primeru so na jedra Zn-oksida nanesli nanooblogo, za katero so poleg anionskih polielektrolitov (dekstran sulfata, polistirensulfata) kot kationsko plast uporabili pozitivno nabit aminoglikozidni antibiotik tobraminsulfat. Tudi v tem primeru so odstranili jedra in ugotovili, da bi tudi ta sistem lahko uporabili za kontrolirano dostavo uœinkovine na oko (23).
Izjemno tanke polielektrolitne nanoobloge na delcih farmacevtskih uœinkovin je mogoœe uporabiti podobno kot klasiœne obloge za uravnavanje sproĝœanja, zaĝœito uœinkovine, ciljno dostavo ipd. S polielektrolitno veœplastno oblogo so tako dosegli zadrĉano sproĝœanje mikrodelcev fluoresceina, ibuprofena ter furosemida. Ravnanje z uœinkovinami v obliki delcev mikrometrskih velikosti je dokaj enostavno, saj jih lahko spiramo na filtru ali enostavno loœimo od disperznega medija s centrifugiranjem (2-6, 8, 22).
V primerjavi s tradicionalnimi metodami za oblaganje uœinkovin, ima metoda nanoplastenja s polielektroliti naslednje prednosti:
-     debelino obloge in premer mikro- oziroma nanokapsule je mogoœe izdelati z natanœnostjo nekaj nanometrov;
-     obloga je lahko sestavljena iz veœ razliœnih snovi, vanjo pa lahko vkljuœimo tudi polimere, lipide, encime, DNK, nanodelce idr.;
-     obloĉiti je mogoœe delce s premerom, primernim za intravensko dajanje;
-     s pripenjanjem specifiœnih ligandov lahko doseĉemo ciljno dostavljanje obloĉenih delcev;
-     za oblaganje uporabimo zelo malo pomoĉnih snovi (3, 13, 20, 24, 25).
Namen naĝega raziskovalnega dela je bil pridobiti izkuĝnje o metodi nanoplastenja (plast na plast nanooblaganja) ter po tej metodi obloĉiti mikrodelce ibuprofena s polielektrolitoma hitosanom in alginatom. Proces nanoplastenja smo nadzorovali z merjenjem naboja delcev, nastanek obloge pa smo dokazali tudi s posnetki optiœnega ter vrstiœnega elektronskega mikroskopa.
2 Materiali in metode
2.1  Materiali
Ibuprofen (Sigma–Aldrich Chemie, Deisenhofen, Nemœija) je bel kristaliniœen praĝek ali v obliki brezbarvnih kristalov. V vodi je praktiœno netopen, dobro topen pa je v acetonu, metanolu in metilen kloridu. Topi se tudi v razredœenih raztopinah alkalijskih hidroksidov in
274 farm vestn 2008; 59
FV 5 2008 prelom.xp:FV 2 2007 prelom zadnji.xp 11/18/08 8:15 AM Page 275
-^-
Razvoj polielektrolitne nanoobloge na mikrodelcih uœinkovine
karbonatov. Topnost ibuprofena v vodi je 56 mg/l, v 0,1 M HCl pa pribliĉno 36 mg/l. Ibuprofen spada v razred nesteroidnih protivnetnih uœinkovin, po klasifikaciji BCS pa ga uvrĝœamo v razred II, kamor spadajo uœinkovine s slabo topnostjo in dobro permeabilnostjo (26).
Za izdelavo obloge smo uporabili natrijev alginat (Sigma, Nemœija) ter hitosan (Fluka Chemie GmbH), oba nizke viskoznosti. Hitosan je polisaharid, sestavljen iz kopolimerov glukozamina in N-acetilglukozamina, in ga pridobivajo z deacetiliranjem hitina. Je kationski poliamin z veliko gostoto naboja pri pH manj kot 6,5. Stopnja deacetilacije hitosana je veœja od 80 %. Pristotnost ĝtevilnih amino skupin omogoœa, da se elektrostatsko poveĉe z anionskimi skupinami (27). Alginska kislina je linearen polimer, sestavljen iz dveh uronskih kislin: a-L-guluronske (G) in b-D-manuronske kisline (M). Alginati monovalentnih kationov (Na+, K+, NH4+) so topni v vodi in v njej tvorijo viskozno koloidno raztopino s psevdoplastiœnimi lastnostmi (28).
2.2   Postopek nanooblaganja delcev ibuprofena
Nanooblaganje smo izvedli tako, da smo 1 g delcev ibuprofena suspendirali v 40 ml raztopine polielektrolitov s koncentracijo 2 mg/ml, in sicer hitosan v 0,3 % ocetni kislini, alginat pa v preœiĝœeni vodi. Nanooblaganje smo zaradi negativnega naboja delcev zaœeli z raztopino hitosana. Suspenzijo smo rahlo stresali 15 minut, da so se polielektrolitne molekule elektrostatsko vezale na povrĝino delcev. Nato smo delce od disperznega medija loœili s 5-minutnim centrifugiranjem pri 4000 obratih/min. Disperzni medij nad usedlino smo previdno odstranili ter delce dvakrat redispergirali v preœiĝœeni vodi, da smo lahko odstranili nevezane ter ĝibko vezane polielektrolitne molekule. Po dvakratnem spiranju delcev s preœiĝœeno vodo smo jih redispergirali v raztopini polielektrolita z nabojem, nasprotnim od naboja zadnje plasti. Za vsak nanos plasti polielektrolita smo delce redispergirali v sveĉe pripravljeni raztopini, saj smo tako zagotovili zadostno koncentracijo polielektrolita. Postopek smo ponavljali toliko œasa, da smo dobili nanooblogo sestavljeno iz ĉelenega ĝtevila plasti.
2.3   Vrednotenje nanooblaganja delcev ibuprofena
Naboj delcev ibuprofena smo doloœili z aparatom Zetasizer 3000 (Malvern Instruments, Worcestershire, UK). Naboj smo vedno doloœili po dvakratnem spiranju delcev s preœiĝœeno vodo, da nevezane oz. ĝibko vezane polielektrolitne molekule ne bi motile meritev.
Nanoobloge na povrĝini delcev ibuprofena smo doloœili tudi s posnetki optiœnega mikroskopa (Olympus BX 50F4; Olympus optical Co. ltd, Tokyo, Japonska) in vrstiœnega elektronskega mikroskopa (SEM Supra 35 VP, Carl Zeiss, Nemœija). Pred analizo z optiœnim mikroskopom smo delce omoœili z vodo in jih pokrili s krovnim steklom. Na ĉeleni poveœavi smo na stik krovnega in objektnega stekla dodali kapljico 1 M raztopine natrijevega hidroksida, ki je difundiral pod krovno stekelce in povzroœil raztapljanje delcev ibuprofena. Delce, ki se v alkalnem mediju raztapljajo, smo posneli pred in med raztapljanjem ter po raztopitvi, ne da bi premikali vidno polje.
3 Rezultati in razprava
Delce ibuprofena smo obloĉili z deset- do tridesetplastno polielektrolitno nanooblogo (HIT/ALG). Ker molekulska struktura ibuprofena vsebuje karboksilno skupino, je bila povrĝina delcev v medijih, v katerih smo izvajali oblaganje, negativno nabita. Tako smo za tvorbo prve plasti nanoobloge uporabili hitosan, ki je pozitivno nabit. Za tvorbo druge plasti smo uporabili alginat, za tretjo zopet hitosan, za œetrto alginat ter tako izmeniœno nadaljevali do ĉelenega ĝtevila plasti. Pogoj za uspeĝno oblaganje je tudi lastnost, da se delci v medijih z raztopljenimi polielektroliti ne raztapljajo.
Naboj neobloĉenih delcev ibuprofena je bil -34 mV. Naboj po nanosu prve plasti hitosana je bil 69 mV, po nanosu druge plasti (alginata) pa -24 mV (slika2). Naboj na povrĝini je sovpadal z nabojem zadnjega uporabljenega polielektrolita (pozitiven je bil, œe je bila zadnja plast hitosanska, oz. negativen, œe je bila alginatna), zato smo zeta potencial doloœili le po nanosu prvih osem plasti polielektrolitov (slika 2).
Slika 2: Zeta potencial obloĉenih mikrodelcev ibuprofena s hitosanom (1, 3, 5 in 7) oziroma alginatom (2, 4, 6 in 8) kot zadnjo plastjo polielektrolitne obloge
Figure 2: Zeta potential of nanocoated ibuprofen microparticles with chitosan (1, 3, 5 and 7) and alginate (2, 4, 6 and 8) as outstanding polyelectrolyte layers.
Naboj na povrĝini je bil najveœji po nanosu prve plasti hitosana. Ker je bil naboj neobloĉenih delcev ibuprofena dokaj majhen (-34 mV) se je verjetno le manjĝi deleĉ naboja prve plasti hitosanskih molekul porabil za nevtralizacijo naboja na povrĝini, preostali del pa izrazil kot pozitiven naboj na povrĝini. Ob vezavi plasti alginatnih molekul se je del naboja porabila za nevtralizacijo naboja hitosanske plasti, zato povrĝina alginatne plasti ni bila tako negativno nabita. Po nanosu zaœetnih plasti pa so postala nihanja v naboju bolj enakomerna. Dobljeni rezultati kaĉejo podoben trend, kot so jih objavili raziskovalci v literaturi, seveda pa so absolutne vrednosti naboja odvisne od uporabljenih materialov.
Na posnetkih obloĉenih delcev ibuprofena z optiœnim mikroskopom nismo opazili razlik na povrĝini delcev, saj je obloga zelo tanka, poveœava pa sorazmerno majhna za ugotavljanje povrĝinskih razlik (slika 3a). Po dodatku 1 M natrijevega hidroksida na rob krovnega stekla so se mikrodelci ibuprofena zaœeli raztapljati, ostala pa je polielektrolitna obloga (slika 3b, 3c). NaOH smo uporabili, ker je ibuprofen dobro topen v alkalnem, slabo pa v vodi oz. v kislem
farm vestn 2008; 59 275
FV 5 2008 prelom.xp:FV 2 2007 prelom zadnji.xp 11/18/08 8:15 AM Page 276
-^-
Pregledni znanstveni œlanki - Review Scientific Articles
mediju. Ĉe med samim raztapljanjem jeder (slika 3b), predvsem po njihovi popolni raztopitvi, smo opazili ovojnice oziroma obloge okrog mikrodelcev ibuprofena, ki so ostale vidne tudi po raztopitvi jedra in so zadrĉale obliko mikrodelcev (slika 3c). V nekaterih primerih smo opazili skrœenje obloge. Potrdili smo, da je obloga stabilna in se ne raztaplja niti v baziœnem mediju. Obloga je ravno tako stabilna v kislem kot nevtralnem mediju, saj smo v obeh izvajali oblaganje.
Posnetki neobloĉenih in obloĉenih delcev ibuprofena z vrstiœnim elektronskim mikroskopom (SEM) so prikazani na sliki 4(a-c). Debeline obloge iz SEM posnetkov je teĉko natanœno doloœiti, vidno pa je, da je obloga res izjemno tanka. Iz posnetkov smo ocenili, da je tridesetplastna nanobloga debela 100-200 nm, kar je v skladu z literaturnimi podatki, kjer avtorji navajajo, da je debelina ene plasti 2 do 6 nm, odvisna pa je od uporabljenih polimerov (3, 15, 21, 22). Na posnetkih obloĉenih delcev smo opazili luknjasto povrĝino (slika 4b, 4c). Sklepamo, da pred SEM slikanjem povrĝina ni bila poĝkodovana,
saj se je ĝtevilo poĝkodb veœalo med daljĝim opazovanjem vzorca s SEM mikroskopom. Oœitno tako tanke obloge ne prenesejo dolgotrajnejĝe izpostavljenosti elektronom v tovrstnem mikroskopu. Opazili smo, da je poĝkodb pri 10-plastni oblogi veœ (slika 4b) ter se pojavljajo hitreje kot pri 30-plastni (slika 4c), kar je ravno tako posledica tanjĝe obloge.
4 Sklep
Nanoplastenje (plast na plast nanooblaganje) s polielektroliti je metoda, s katero lahko izdelamo zelo tanko oblogo na povrĝinah razliœnih velikosti in oblik. Za izdelavo obloge sta potrebni dve polimerni spojini z nasprotnim nabojem, ki se izmeniœno veĉeta na povrĝino, ki jo oblagamo. Postopek nanooblaganja lahko spremljamo z vmesnim doloœanjem zeta potenciala na povrĝini delcev, po konœanem  oblaganju  pa  s  posnetki  optiœnega  in  vrstiœnega
Slika 3 (a-c): Posnetki obloĉenih delcev ibuprofena z 20-plastno polielektrolitno oblogo z optiœnim mikroskopom. Na sliki a vidimo delce
ibuprofena z 20-plastno nanooblogo pred zaœetkom raztapljanja v 1 M NaOH. Slika b prikazuje ĉe delno raztopljene delce, kjer so ĉe vidne tudi polielektrolitne obloge, na sliki c pa so delci ibuprofena ĉe popolnoma raztopljeni in je vidna samo ĝe polielektrolitna obloga, ki je ohranila obliko in velikost delcev. Merilo na posnetku predstavlja 20 mm.
Figure 3 (a-c): Optical microscope images of ibuprofen particles with 20 polyelectrolyte layers. a Ibuprofen before dissolution in 1 M sodium hydroxide solution. b Partially dissolved particles with a visible residue of polyelectrolyte coating. c Ibuprofen particles totally dissolved leaving only the polyelectrolyte multilayer. The polyelectrolyte multilayer kept the size and the shape of the particles. Size bar represents 20 mm.
Slika 4 (a-c): SEM posnetki neobloĉenih delcev ibuprofena (a) ter delcev, obloĉenih z 10 ((HIT/ALG)5) (b) oziroma 30 plastmi polielektrolitov ((HIT/ALG)15) (c). Merilo predstavlja 20 mm (a, b) oz. 2  m (c).
Figure 4 (a-c): SEM images of (a) uncoated ibuprofen particles, (b) particles coated with 10 polyelectrolyte layers ((HIT/ALG)5), or (c) 30 polyelectrolyte layers ((HIT/ALG)15) (c). Size bars represent 20 mm (a, b) and 2  m (c).
276 farm vestn 2008; 59
FV 5 2008 prelom.xp:FV 2 2007 prelom zadnji.xp 11/18/08 8:15 AM Page 277
Razvoj polielektrolitne nanoobloge na mikrodelcih uœinkovine
elektronskega mikroskopa doloœimo obliko, debelino, homogenost in stabilnost.
Nanooblaganje mikrodelcev ali veœjih povrĝin ni posebno zahteven postopek. Zahtevnejĝe je oblaganje nanodelcev, predvsem zaradi njihovega loœevanja od disperznega medija in stabilnosti tovrstnih sistemov. Oblaganje nanodelcev za parenteralno dajanje zaradi poveœanja biokompatibilnosti ter za ciljano dostavo uœinkovine pa pomeni poseben izziv za raziskovanje v prihodnosti.
5 Literatura
1.   Decher G, Hong JD. Buildup of ultrathin multilayer films by a self-assembly process: I. consecutive adsorption of anionic and cationic bipolar amphiphiles. Makromol Chem, Macromol Symp, 1991; 46: 321-327.
2.   Ai H, Meng H, Ichinose I in sod. Biocopatibility of layer-by-layer self-assembled nanofilm on silicone rubber for neurons. J Neurosci Meth, 2003; 128: 1-8.
3.   Ai H, Jones SA, de Villiers MM in sod. Nano – encapsulation of furosemide microcrystals for controlled drug delivery. J Contr Rel, 2003; 86: 59-68.
4.   Qiu X, Leporatti S, Donath E in sod. Studies on the drug release properties of polysaccharide multilayers encapsulated ibuprofen microparticles. Langmuir, 2001; 17; 5375-5380.
5.   Antipov AA, Sukhorukov GB, Donath E in sod. Sustained release properties of polyelectrolyte multilayer capsules. J Phys Chem B, 2001; 105: 2281-2284.
6.   Homar M, Kristl J. Nanooblaganje – moĉnosti in prednosti. V: Nanotehnologija v farmaciji. Ljubljana: Slovensko farmacevtsko druĝtvo, 2004; p. 65-79.
7.   Decher G. Fuzzy nanoassemlies: Toward layered polymeric multicomposites. Science, 1997; 277: 1232-1237.
8.   Moya S, Donath E, Sukhorukov GB in sod. Lipid coating on polyelectrolyte surface modified colloidal partices and polyelectrolite capsules. Macromolecules, 2000; 33: 4538-4544.
9.   Zahr AS, de Villiers M, Pishko MV. Encapsulation of drug nanoparticles in self-assembled macromolecular nanoshells. Langmuir, 2005; 21: 403-410.
10.  Baumgartner S, Pavli M, Kristl J. Effect of calcium ions on the gelling and drug release characteristics of xanthan matrix tablets. Eur J Pharm Biopharm, 2008; 69 (2): 698-707.
11.  Abramoviċ Z, Kristl J. Inteligentni hidrogeli za dostavo zdravilnih uœinkovin. Farm Vestn, 2004; 55: 555-563.
12.  Bhardwaj TR, Kanwar M, Lal R in sod. Natural gums and modified natural gums as sustained – release carriers. Drug Dev Ind Pharm, 2000; 26 (10): 1025-1038.
13.  van den Beucken JJJP, Vos MRJ, Thune PC in sod. Fabrication, characterization and biological assessment of multilayered DNA-coatings for biomaterial purposes. Biomaterials, 2006; 27: 691-701.
14. Cai K, Rechtenbach A, Hao J in sod. Polysaccharide-protein surface modification of titanium via a layer-by-layer technique: characterization and cell behaviour aspects. Biomaterials, 2005; 26: 5960-71.
15. Schultz P, Vautier D, Richert L in sod. Polyelectrolyte multilayers functionalized by a synthetic analogue of an anti-inflammatory peptide,  -MSH, for coating a tracheal prosthesis. Biomaterials, 2005; 26: 2621-30.
16. Dolenc A, Homar M, Gaĝperlin M, Kristl J. Z nanooblaganjem do izboljĝanja biokompatibilnosti vsadkov. Med Razgl, 2006; 45: 411-420.
17. Fu J, Ji J, Yuan W in sod. Construction o anti-adhesive and antibacterial multilayer films via layer-by-layer assembly of heparin and chitosan. Biomaterials, 2005; 26: 6684-6692.
18. Boura C, Menu P, Payan E in sod. Endothelial cells grown on thin polyelectrolyte multilayered films: an evaluation of a new versatile surface modification. Biomaterials, 2003; 24: 3521-30.
19. Liu Y, He T, Gao C. Surface modification of poly(ethylene terephthalate) via hydrolysis and layer-by-layer assembly of chitosan and chondroitin sulfate to construct cytocompatible layer for human endothelial cells. Colloids Surf B Biointerfaces, 2005; 46: 117-26.
20. Thierry B, Winnik F M, Merhi Y in sod. Bioactive coatings of endovascular stents based on polyelectrolyte multilayers. Biomacromol, 2003; 4: 1564-1571.
21. Yang SY, Seo JY. Cellular interactions on nano-structured polyelectrolyte multilayers. Colloids and Surfaces A: Physicochem Eng Aspects, 2008; 313-314: 526-529.
22. Bhadra D, Gupta G, Bhadra S in sod. Multicomposite ultrathin capsules for sustained ocular delivery of ciprofloksacin hydrochloride. J Pharm Pharmaceut Sci, 2004; 7(2): 241-251.
23. Khopade AJ, Arulsudar N, Khopade SA in sod. Ultrathin antibiotic walled microcapsules. Biomacromolecules, 2005; 6: 229-234.
24. Haidar ZS, Hamdy RC, Tabrizian M. Protein release kinetics for core–shell hybrid nanoparticles based on the layer-by-layer assembly of alginate and chitosan on liposomes. Biomaterials, 2008; Vol 29: 1207-1215.
25. Liu L, Chen Z, Yang S in sod. A novel inhibition biosensor constructed by layer-by-layer technique based on biospecific affinity for the determination of sulfide. Sensors and Actuators B, 2008; 129: 218-224.
26. Kocbek P, Baumgartner S, Kristl J. Preparation and evaluation of nanosuspensions for enhancing the dissolution of poorly soluble drugs. Int J Pharm, 2006; 312: 179-186.
27. Kristl J, Ĝmid-Korbar J, Ĝtruc E in sod. Hydrocolloids and gels of chitosan as drug carriers. Int J Pharm, 1993; 99: 13-19.
28. Rowe RC, Sheskey JP, Weller JP in sod. Handbook of pharmaceutical excipients, 4th edition, 2003: 16-18, 132-135.
farm vestn 2008; 59 277