KRALJEVINA SRBA, HRVATA I SLOVENACA
UPRAVA ZA ZAŠTITU KLASA 30(6)
INDUSTRIJSKE SVOJINE
IZDAN 1. SEPTEMBRA 1923.
PATENTNI SPIS BR. 1285.
Elektro-Osmose A. G. (Gral Schv/erin Ges.) Berlin
Postupak za prenošenje takozvanih imun-materija sa specifičnih belančevina na nespecifične ili na takvu belančevinu u kojoj ima drugojačih imun-tela.
Prijava od 22. jula 1921.	Važi od 1. decembra 1922.
Pravo prvenstva od 11. jula 1918. (Nemačka).
U takozvanim imun serumima, t. j. u serumima od životinja koje su imunizL rane toksinima bakterija ili kulturama bakterija, dakle u opšte takozvanim am tKenima, ili u krvi individua koje su po prebolevanju jedne infekcije stekle imm nitet, specifične osobine su, shodno is^ kustvu, vezane za belančevinu. Te spe« cifične osobine ne raspodeljuju se rav= nomerno na belančevine koje se u krvi nalaze, tako da se mora praviti razlika izmedju specifičnih i nespecifičnih be; lančevina. U antitoksičnim adelom i bak-tericidnim serumima, kao na pr. serum difterije i tetanusa, ali isto tako j u serumu antistreptokopa, kao i serumu pneumokoka, pokazali su se na pr. kao potpuno nespecifične:	belančevina cr«
venih i belih krvnih zrnaca, fibrmogen, resp. fibrin, i albunimi. Kao svojstveni nosioci specifičnih osobina dolaze dakle isključivo globulini u obzir, pa i na ovu grupu belančevina, specifične osobine nisu ravnomcrno raspodeljene već pm stoji jedna graduelna razlika u efikas* nosti nerastvornih ili suglobulina i ras; tvorni ili para odnosno pseudio*globu= bulina, a naime tako da se ovi posled« nji imaju po sve smatrati kao glavni nosioci specifičnih sila u imunserumirna dok je efikasnost euglobulina relativno manja.
Nadjeno je sada da ovo osobeno
raspodeljivanje specifične efikasnosti počiva na jednom gradueno različitom afinitetu ili sili privlačnosti koju imaju belančevine prema specifičnim imun2 telima. Utvrdjeno je da fibrinogen i ah buminj nemaju nikakav, da euglobulin ima slab, a para ili pseudoglobulini imaju najjači afinitet za specifična imun tela. Ovo saznanje stečeno je konstata* čijom da se uspeva da se odvoje od em globulina za njih vezana imumtela, po« moću rastvora paraglobulina, pri čemu se može specifična efikasnost preneti na po sebi nespecifične paraglobuline, ili pak paraglobulini malog specifičnog dejstva preobratiti u belančevinu jače efikasnu- Na istom putu uspeva se da se na jednu istu belančevinu fiksiraju kom« binacije različitih vrsta imumtela.
Nadjeno je dalje da prenašanje spe« cifične efikasnosti s iedne belančevine na drugu polazi za rukom ne samo pri upotrebi belančevina jedne iste životinj« ske vrste nego i tada kad euglobulin vodi poreklo iz krvi jedne životinjske vrste, na pr- serum konja, dok su para« globulini dobijeni iz krvi ma koje druge vrste, na pr čovečije krvi-
Postupak u pojedinostima sastoji se u tome što se euglobulin, ponajbolje na elektroosmotskom putu, prevede u ne« rastvoran oblik, i tako izolovan euglobu« lin pusti da dejstvuje na paraglobulin,
Din. 3
dobij en isto tako elektroosmbtični pri čemu je sasvim svejedno dali odgovara? jući paraglobulin ima ili nema specifične osobine iste ili drugojače prirode.
Euglobulini imaju ::pm-obnosti da se vrlo lako i bez ostatka rastvaraju u vo« denim rastvorima parag'lobulina, u pri* sustvu i najmanjih količina neutralnih soli. Ako se kakav euglobulin u kome ima specifičnih imumtela, kao na pr. euglobulin izdvojen na elektron-mot* ikom putu iz difteričnog seruma rastvo* ri u rastvoru paraglobulina, pri istovre* menom dodatku male k< nčine konjske soli, nastupa ubrzo prelazak specifičnih imun*tela sa euglobulina na paraglc* bulin.
Ovo dolazi do svoga izraza na taj na* čin što je rastvor paraglobulina, po uda* 1 javan ju euglobulina, stekao one speci fične osobine koje su prethodno bile ve* zane za euglobulin: što će se dakle na pr. iz jednog rastvora euglobulina iz dii* teričnog seruma u paraglobulinu iz nor* malne krvi konja govečeta ili čoveka, dobio po izdvai. nju ovih eugh.bulina, rastvor paraglobulina koji s drži anti* toksina.
Prema tome, postupak se u pojedino* stima sastoji u izdvajanju cuglebunnaiz specilienih imun=seruma, dalje u sprav* ljanju paraglobulin i iz m rmalnih ili specifičnih imun*:seruma, i treće, u eks* frakciji specifičnih imun*tcl ; iz euglobu* lina pomoću rastvora paraglobulina, koji pak sa svoje strane mogu poticati bili iz normalnih bilo iz specifičnih imun*:se* ruma.
Pošto postupak za preradu različitih seruma i pojedinih njihovih kembinaci* ia ima čitav jedan niz zajedničkih ta* čaka, to će sc ovde najpre, pre nego što se udje u izlaganje odredjer.ih primera, govoriti o onim postupcima koji se pri preradi različitih normalnih i specifič* nih seruma uvek na isti način ponav* ljaju.
1. Dobijanje euglobulina.
Za dobijanje euglobulina upotrebijuje se krvni serum ili krvna plazma bez fu biincgena. Za izdvajanje euglobulina, iv ovih tečnosti upotrebljavalo se je do sada taloženje pomoću sirćetne kiseline ili ugljene kiseline po prethodnom ja* kom razblaživanju krvnog seruma ili plazme vodom ili pak zbog dialice, teku* o n vodom do uklanjanja soli. Ali (ivi postupci pružali su velike nezgode- Ta-
loži kiselina naime ne mogu nikada da se kvantitativno stalože pošto je produ* kat taloženja, naime euglobulin, penova rastvoran u najmanjem suvišku kiše* line; pokraj toga, morali su serumi ili plazme često biti razblaženi sa vrlo velikim količinama vode, da bi se postiglo optimalno taloženje, usled čega obrada velikih količina biva nepogodna S druge strane, da bi se postiglo potpiu no o vh badjanje od seli, morala je dia* miza biti i. vodjena za vreme od više nevolja. Za nju su bile petrebne velike količine vode i ona. je pružala uvek opasnost bakterielnog zagadjivanja tečno sti bogatih u belančevinama, koje su lako podložne kvarenju.
Nasuprot t#me, u pokušajima koji se ovde opisuju, upotrebljavan je, za iz* dvajanje euglobulina iz krvnog seruma ili plazme, uvek elektrooismotski poste pak, koji, na suprot starijim metodama pruža to preimućstvo da je ovde talo* ženje euglobulina apsolutno kvantita* tivno; da je povećavanje volumena tečnosti i azhlaživan jem vodom nepotrebno, i da je najzad isključena svaka opasnost zagadjivanja bakterijama, pa prc* ■na teme i opasnost kvarenja specifič nih imun*tela.
Serum ili plazma stavi se u sređnj prostor jednog troćeličnog aparata koji se — u pored i sa crtežom sastoji iz jednog četvrtastog sanduka i koji je u svojoj unutrašnjosti podeljen dvem polu	propustiljivim (semi*permeobil-
nim) membranama ili diaframama hicu tri komore. Neposredno iza diafragma zategnute su fine platinske mreže d i ; koje dovode električnu struju ka tečnosti (serumu i plazmi) što se nalazi iz* medju oke diafragme. Napon i jačina struje podešavaju se ovde prema sadr žaju seruma u elektrolitima tako da se u početku procesa dobi ja struja relativno slabog napona i visoke struj ine jačine, na kraju procesa pak, struja visokog na* pena i vi-’o slabe strujine jačine. Za početak procesa iznosi napon oko 20 vol ti, •••Irujina jačina oko 15 ampera. Napon i strujina jačina prolaze tada kroz >ve faze, sve dok se ogled, pri naponu od 500 volti i struiinoj jačini od 0,1—0 2 ampera, ne prekine. Celokupno trajanje utica ja električne struje do o-slobodj vanja od elektrolita, iznosi prosečno 2 sata. Reakcija je u srednjem pri tor aparata u početku slabo alkalna, ali po
sle kratkoj« vremena postaje neutralna, zatim prelazno jače alkalna, da bi se najzad izmenila u kiselu reakciju- Sa po= javom kisele reakcije počinje taloženje euglobulina koje dostiže svoj maksimum u momentu potpunog osustva soli- 1 krajnji produkat ima vrlo slabu kiselu reakciju koja je, kao što je poznato, svojstvena za čiste belančevine- Po za= vršetku procesa isprazni se srednji prostor aparata, suglobulini se skupe bilo filtriranjem bilo pomoću centrifuge, i brižljivo isperu u vodi slodnoj od soli. Ispiranje ima za cilj da potpuno odstra* ni svu rastvornu belančevinu koja se još za talog drži.
Pri upotrebi specifičnog seruma na* stupa raspodeljivanje specifičnih imun* tela na staloženi euglobulin i na belan* čcvine koje ostaju u rastvoru i to tako da se od prilike jedna petina specifič* nih imumtela veže za euglobulin, a osta* tak za rastvornu belančevinu. Kvarenje specifičnih imumtela električnom stru* jom pri preradi seruma u troćeličnom aparatu ne nastupa nikada, što je kon* statovano bezbrojnim eksperimentima sa životinjama, bez zamerke.
Difterični serum, sadrži na pr., u 1 cm3 250 antitoksienih jedinica (A- J.), pri sadržaju belančevine od 10,0% U jednom litru seruma bilo je prema tome
250.000	A. J- i 100 gr belančevine, tako da je 1 gr. belančevine sadržavao tačno 25000 A. J. Elektroosmotskim poistup* kom dobijeno je iz jednog litra ovog seruma:
30 gr. ostatka (euglobulin) sa 1800 A. J. na 1 gr.	- 54000 A- J. i- t-
960 sms tečnosti (70 gr. rastv. belanč.) sa 280 A. J. na 1 sms 196000 A. J. i. t Svega: 250000 A J.
Iz ovoga izlazi da nikakvo kvarenje antitoksina nije nastupilo električnim postupkom.
Za dalju preradu, euglobulin se upo* trebljava u vlažnom stanju, dakle kao pasta.
2. DOBIJANJE PARAGLOBULINA:
Za dobi janje paraglobulina iz seruma ili plazme, odvoji se najpre euglobulin na elektroosmofcskom putu, kao što je to pod 1 opisano, centrifugat smeša za* jedno sa vodom od ispiranja, i ta meša* vina preradjuje se na poznat način fak* cioniranim taloženjem soli. 1 ako na pr-dodaje se mešavini ovih centrifugata,
filtrata i vode od ispiranja, ista količina zasićenog rastvora anom*sulfata, i tom prilikom izlučeni paraglobulin skupi fil* triranjem ili pomoću centrifuge. Po sa* vesnom ispiranju sa poluzasićenim ras* tvorom amomsulfata, rastvori se ovaj talog u vodi i rastvor, u pergamentskim cevima, podvrgne dializi vodom koja u suprotnom pravcu teče, sve dok se ne postigne oslobadjanje od soli. Na taj se način dobije jedan rastvor ponajčešće slabo žuto obojen i približno slobodan od soli, koji se ;!a konzerviranje ponaj* bolje u prostoru sa razredjenim vazdu* hom i na nilskoj temperaturi isparava dok se ne dobije jedan suv preparat lako rastvoran u vodi je trajno nepromen* ljivo stabilan.
3- EKSTRAKCIJA, SPECIFIČNIH
IMUN*TELA IZ EUGLOBULIN A POMOĆU RASTVORA PARAGLO* BULINA.
Pokazalo se je da se za ekstrakciju specifičnih euglobulina ponajbolje upo* trebljuje jedan 5%*ni rastvor paraglobu* lina. Euglobulin je rastvoran u rastvoru paraglobulina; da bi se ova rastvorlji* vost povećala, i da bi rastvor u isto vreme stekao potrebnu sposobnost elek* tričnog provodjenja, dodaje se rastvo* ru paraglobulina 0,4 — 0,5% kujnske soli U ovaj rastvor unese se vlažna pa* sta euglobulina, i to toliko, da tečnost koja iz toga proizilazi, sadrži paraglobu* Una i euglobulina odprilike u jednakoj količini, zajedno oko 10% • Mešavina pa* raglobulina i euglobulina ostaje 24 časa na niskoj temperaturi, ponajbolje u apa* ratu za hladjenje, i potom se ponova u* nosi u srednji prostor jednog troilič* nog aparata, i izloži utica ju električne struje. Relacija struje je opet ista kao i ona koja je opisana već prilikom sprav* ljanja euglobulina iz seruma; reakcija prolazi isto tako kroz sve faze od al* kalnog do kiselog stanja, i prilikom oslo* badjanja od soli dolazi se do taloženja euglobulina. Ovaj se opet izdvoji iz teč* nosti filtriranjem ili pomoću centrifuge, pri čemu se dobije jedan rastvor para* globulina slobodan od soli, koji se raz* likuje cd prvobitne g rastvora samo po tome što on sada ima one specifične osobine koje su ranije bile vezane za euglobulin. Povećavanje koje je na taj način neizbežno, ne može se gravime* trijski dokazati.
Poznatom reakcijom precipitina sa jednim specifičnim antkserumom može se dobiti izvesnost da rastvor paraglo* bulina dobijen na ovom putu ne sadrži nikakvu heterogenu belančevinu-
Dalje pojedinosti postupka mogu se ponajbolje videti iz sledečih specijalnih primera.
PRIMERI:
1. Prenašanje antitoksima difterije iz konjskog seruma na čovečju belanče* vinu izvedeno je kao što slednje: antb toksin ili serum sadržavao je na 100 delova.
9.8	gr. suve substance
8.9	gr. organske substance 0,9 gr. anogranske substance 8,8 gr. belančevine, a naime
2.3	gr. euglobulina 4,5 gr paraglobulina
2,0	gr- albumina Svega: 8,8 gr-
1 crna antitoksima ili seruma saržavao je 250 difteričnih antitoksičnih jedinica (A. J.)
2 litra ovoga seruma obradjivani su prema gore opisanom postupku za dobu janje euglobulina. Prema tome je za obradu došlo 176 gr. belančevine sa
500.000	A- J. Na završetku dobljena je jedna vlažna pasta sa 46 gr. suve sufu stance (euglobulin) i 92000 A. J.
Jedan serum iz čovečije krvi sadržan vao je na 100 delova:
9.4	gr. suve substance
8.4	gr. organske substance
1,0	gr anorganske substance
8,4	gr. belančevine, a naime
2.2	gr. euglobulina
2,0	gr. paraglobulina
4.2	gr. albumina Svega 8,4 gr.
U serumu se nije mogao dokazati ni najmanji trag difteričnog antitoksina.
Iz jednog litra seruma izdvoji se naj; pre suglobulin prema elektroosmotskom postupku, gore pod 1 opisanom- Izku čeni euglobulin se dobro ispere, voda od ispiranja se spoji sa filtratom, t. j. cem trifugatom elektroosmotski dobij enog taloga euglobulina, i u cilju uglavljavanja albumina, postupi se prema metodi gore pod 2 navedenoj. Na taj način dobi jena jc jedna potpuno bistra tečnost, koja je, isparena u vakumu na niskoj tempera« turi, dala 20 gr. sasvim čistog, približ* no je da je 1 gr. ovog čovečjeg paraglo«
Pošto pribavljajne čovečjeg seruma, koji se može prigodno dobiti iz bolnica u obliku krvohptenja ili krvi operacija, nije uvek izvodljivo, to se za spravljanje čovečjeg paraglobulina upotrebijuje u prilikama i ascitna tečnost (tečnost tr= bušne vodene bolesti), koja, prema iss kustvu, u odnosu na svoj kvalitativni sastav, potpuno se podudara sa krvnim serumom čoveka, i koja se lako može dobiti iz bolnica u proizvoljno velikim količinama.
Sveža ascitna tečnost sadrži, na 100 delova:
6,6 gr suve substance
1,12 gr- anorganske substance
5.4	gr. organske substance
5,2	gr. belančevine, a naime
1,2	gr. euglobulina
1.5	gr. paraglobulina
2.5	gr. albumina Svega: 5,2 gr.
Iz dva litra ascitne tečnosti dobijemo je 30 gr. najčistijeg paraglobulina.
Ekstrakcija difteričnog antitoksima iz eugobuina pomoću rastvora paraglobu« lina, izvodi se na sledeči način: 50 gr-čovečjeg paraglobulina rastvoreno je najpre u 1000 cm:! vode, sa dodatkom 5. gr kujnske soli. U ovaj rastvor unesu se u formi vlažne paste, euglobulini izo. lovani iz difteričnog konjskog krvnog seruma, čija je suva substanca iznosila 46 g. sa sadržajem antitoksina od 92000 jedinica. Iz toga se dobije jedan sasvim potpun rastvor euglobulina.Ova meša« vina čovečjeg paraglobulina i euglobulina iz konjskog krvnog seruma ostavi se najpre samoj sebi za vreme od 24 časa, na niskoj temperaturi (aparat za hladjenje) i potom ponova unese u sred« nji prostor troćeličnog aparata, i izloži uticaju električne struje Po ponovnom taloženju euglobulina dobije se jedna bistra tečnost, koja se sastoji iz najča« stijeg čovečjeg paraglobulina, a naime njegova celokupna vrednost iznosi opet 50 gr. suve težine.
Pri opredeljivanju antitoksina nadje na je da je 1 gr. ovog čovečjeg pa ragi bulina sadržavao 1()()() antitoksičnih je« dinica, dakle 50 gr. 5000 A. J. i prema t< « me, iz antitoksičnog euglobulina iz konj skog seruma od 92.000 A. J., od prilike polovina antitoksina prenesena jc na čovečju belančevinu.
U jednom daljem opitu, unesena je u isti rastvor čovečjeg paraglobulina jed«
na dalja količina od 50 gr- euglohulina dohijenog iz diiteričnog konskog sc* ruma. Sadržaj u antitoksinu ovoga cu globulina iznosio je 100000 A. .1. iJo pos novnom elektroosmotskom izdvajanju ovoga euglohulina, dobijen je jedan ra« stvor eovečjeg paraglobi-hna sa 50 gr. suve substance, koja je sadržavala u ce= losti 100.000 A. .1- Ovaj rastvor se u pro stom sa razredjenim vazduhom i pri n: skoj temperaturi toliko skoncetrisava, da je sada dobijeni rastvor sadržavao na 100 delov?. 10 gr. čovečje belančevine. 1 cm:i ovoga rastvora sadržavao je 200 A. J. On je prema torne prestavljao je^ dan serum čiji je sadržaj u antitoksinu bit; dovoljno visok, da može naći praks tične primene za profilaktičke i terapev tičke svrhe.
2. Iz dva litra seruma antistreptokoka sa sadržajem u suvoj substanci od 9,7/t, koja se sastoji od 8,9'/ belančevine i 0,8% anogranskih materija, izdvoji se takodje euglobulin na elektroosmotskom putu. Time je dobijena jedna vlažna pasta, čiji sadržaj u suvoj substanci iznosi 60 gr. Biološka proba pokazala je da ovaj euglobulin sadrži oko 25% imie ntela, koja su se mogla konstatovati u prvobitnom serumu antistreptokoka-
S druge strane, iz dva litra seruma pneumokoka, spravljena su 2 litra jed* nog rastvora paraglobulina, čiji je sa* držaj u suvoj substanci iznosio 48 gr. U ovaj rastvor unetc je 30 gr. euglobu* lina iz seruma antistrentokoka i sa isto* vremenim dodatkom od 10 gr. kujnske seli, rastvoren. Po ponovnem izdvajanju ovoga euglohulina na elektroosmotskom putu, dobijen je jedan rastvor belanče* vine, koji se je pokazao kao efikasan, protiv streptokoka isto tako kao i pro* tiv pneumokoka. Po izvršenoj konce* traciji u prostoru sa razredjenim vaz* duhom j na niskoj temperaturi, mogao je ovaj serum biti upotrebljen za suz* bijanje mešovitih infekcija streptokoka i pneumokoka.
Nasuprot tome, elektron smotsko iz* serumi iz antitoksičnih seruma, kao na pr. serum antidifterični antitetanusni, ili takodje mešoviti serumi sa antitok* sičnim i baktericidmm osobinama
Prenašanje specifičnih efikasnih ma* terija za lečenje ili predohranti imun* seruma, sa belančevina, za koje su one u tim serumima slabo vezane, na druge belančevine iz seruma ili krvno tečnosti.
bilo je već do sada poznato na taj način, što se te prve belančevine zajedno su specifičnim materijama za predohranu stalože ili izdvoje, profiltriranju i t. d. i tada tretiraju serumom, pri čemu ma* terija za predohranu prelazi na beiam čevine seruma- Poznati pr.supak koji se je upotrebljavao, izdvajanje, t. j. za pre* našanje specifičnih imun*matcrija na krvni serum t j. krvnu plazmu, sasto* jao se je u tome da se celokupna bolan* čevina iz krvnog seruma pomoću alko* hola i sirćetne kiseline st; loži, i tako staložena belančevina ekstrahuje se jed* nim drugim serumom koji već sadrži iste specifične materije Izvodjenje ovo* ga postupka pak pruža teškoće u toliko što je za svaki krvni serum potreban jedan tačno cdredjen odnos seruma, al* kohola i sirćetne kiseline, koji se ima odrediti predhodnim opitima. Dalje, čak i po utvrdjivanju ovog odnosa, isko* riščavanje imun*tela nije nikada kvan* titativno, pošto nešto belančevina, a s time i specifična imumtela, ostaju u fil* tratu. Dalje, ekstrakcija voluminoznih taloga je vrlo teška, budući da se prili* kom suspenzije u krvnom serumu ili kr* vnoj plazmi javljaju žilave mase koje se teško izdvajaju filtriranjem, tako da fil* triranje i centrifugiranje povlači uvek za sobom znatne gubitke. Tehničko dej* sivo postignuto tim poznatim postup* kom je pri tom relativno slabo, jer naj* veći deo antitoksina nije ekstrahovan iz seruma, nego ostaje sa nerastvornom helančevinom, a taj zaostali deo je za svaku terapevtičku svrhu neupotrebljiv.
Nasuprot tome, elektroosmotskom iz* davanje euglohulina iz krvnog seruma u novom postupku, je veoma pogodno, i potpuno kvantitativno. Pošto je euglo* bulin potpuno rastvoran u rastvorima paraglobulina u prisustvu soli, to prena* šanje imumtela koja su vezana za euglo* bulin na paraglobuline, biva daleko lak* še i u većim količinama, nego u ranijim postupcima. Kako je dalje izdvajanje suglobulina oslobodjenog od antitoksina, iz rastvora paraglobulina postignuto opet na elektroosmotskom putu, može se ono izvesti bez teškoća i bez gubitaka, hto tako, kako su euglobolini nerastvor* ni u osustvu soli i pokraj malih tragova kisielina, ne nalazi se, u krajnjem pro* duktu posle druge osmoze, više ništa od prvobitno upotrebljene belančevine za ekstrakciju, u filtratima i centrifuga*
tima, što je od velike važnosti u prena? šanju specifičnih imumtela sa belanče= vine jedne životinjske vrste na belanče« vine jedne druge vrste.
PATENTNI ZAHTEVI:
1. Postupak za spravljanje takozvanih imununaterija sa specifičnih belanče= vina na nespecifične, ili na takvu belan= čevinu u kojoj ima drugojačih imun=tela, naznačen time, što se iz jednoga imun5 seruma izdvoji euglobulin, taj isti em
globulin rastvori u krvnom serumu ili još bolje u rastvoru paraglobulina iz krvnog seruma, normalnih ili imuniziraš nih individua, pa zatim iz ove mešavine ponovo izdvoji euglobulin.
2 Postupak prema zahtevu 1, nazna* čen primenom različitih vrsta imun=se= iuma da dobijanje takozvanih multivas lentnih seruma t j. takvih rastvora be= lančevina koji istovremeno nose razli; čite, antitoksične i baktericidne oso; bine-