RAZISKAVE IN RAZVOJ Papir za notranjost revije PAPIR je prispevala papirnica Goričane, tovarna papirja Medvode, d.d. Sora Matt + 80 g/m 2 . Papir za notranjost revije PAPIR je prispevala papirnica Goričane, tovarna papirja Medvode, d.d. Sora Matt + 80 g/m 2 . RAZISKAVE IN RAZVOJ Raziskujemo in razvijamo Raziskujemo in razvijamo | junij 2018 | 19 | XLVI | junij 2018 | 19 | XLVI 1 UVOD V naravi se nahajajo ogromne zaloge lignocelulozne biomase, vendar je tehno- loško izkoriščen sorazmerno majhen del. Materiali, kot so npr. invazivne rastline, ostanki kulturnih rastlin po žetvi, ostanki iz kmetijske in lesne predelave ter zeleni odrez, so bogat vir vlaknin, ogljikovih hi- dratov, lignina, ekstraktivnih spojin in anor- ganskih snovi. Zato predstavljajo potenci- alno, alternativno surovino za proizvodnjo celuloze, sladkornih komponent, različnih kemikalij, bioplastike, kompozitnih mate- rialov in biogoriv. Za učinkovito izrabo oz. predelavo razpoložljive biomase je potreb- no predhodno okarakterizirati njene mor- fološke, kemične in fizikalno-mehanske lastnosti, ki narekujejo njeno uporabnost v industriji. Kemična sestava biomase je odvisna od vrste in starosti rastlinskega materiala, vrste tkiva (stebla, veje, listi, cvetovi, sadeži, ko- renine), pogojev rasti in časa žetve. Zaradi raznolikosti biomase, načina vzorčenja, po- gojev predobdelave in skladiščenja je treba vsak material reprezentativno vzorčiti in izvesti večje število analiz, da dobimo čim bolj realne, povprečne podatke o strukturi snovi. Za kemijsko karakterizacijo celulo- ze, hemiceluloze, lignina, ekstraktivov in pepela se rutinsko uporabljajo večinoma standardne in uporabne kemijske metode preizkušanja (SIST, EN, ISO, TAPPI, SCAN, ASTM), ki bazirajo na selektivnem razklopu snovi z uporabo ustreznih reagentov. V primeru določanja celuloze, hemiceluloze in lignina, slednje izoliramo kot netopni preostanek in jih gravimetrično ovredno- timo. Tako imenovani klasični postopki so sorazmerno dolgi, pri čemer porabimo precejšnje količine kemikalij, vode in ener- gije, hkrati pa nastajajo odpadni produkti, ki jih moramo odstranjevati. Informacija, ki jo dobimo, je zgolj vsebnost posamezne komponente, ne pa tudi njene kemič- ne lastnosti, npr. vsebnost funkcionalnih skupin v ligninu, sestava hemicelulozne frakcije, ekstraktivov in pepela. Zaradi po- rabljenega časa in materialnih stroškov so analize biomase po standardnih postopkih drage in zato manj primerne za velike serije vzorcev (1). Alternativa dolgotrajnim standardnim te- stom so spektroskopske metode, pred- vsem infrardeča spektroskopija (FTIR), ki je primerna za kvalitativno in kvantitativno karakterizacijo plinskih, tekočih in trdnih vzorcev. FTIR tehnika je hitra in nedestruk- tivna, obravnavani materiali pa morajo biti zgolj mehansko obdelani (sušenje, mletje, homogenizacija). Osnovni princip je inte- rakcija IR-elektromagnetnega valovanja s preiskovano snovjo, pri čemer dobimo ka- rakterističen absorpcijski spekter, na osnovi katerega lahko identificiramo komponen- te vzorca. Vrhovi v spektru predstavljajo nihanja in vibracije molekulskih vezi, do katerih pride pri interakciji snovi z IR-valo- vanjem. Tehnika je absolutna, kar pomeni, da so spektri čistih snovi pri enakih ekspe- rimentalnih pogojih ponovljivi. Pri večkom- ponentnih vzorcih se lahko v določenih delih spektra posamezni spektralni vrhovi komponent prekrivajo, vendar je možno s pomočjo računalniškega procesiranja spek- trov identificirati tipične spektralne karakte- ristike posameznih komponent, kar je tudi osnova za kvantitativno delo, saj je višina oz. površina vrha sorazmerna koncentraciji spojine v vzorcu. Potrebna je kalibracija, ki jo izvedemo s pomočjo standardnih zmesi znanih koncentracij. Spektralno območje snemanja FTIR spektrov se razteza med va- lovnimi dolžinami 25 in 2,5 µm oz. valov- nimi števili med (400 in 4000) cm -1 . Tipični IR absorpcijski vrhovi celuloze so (895, 1046, 1161, 1253, 1323, 1375, 1417, 1638, 2916 in 3416) cm -1 in lignina (780, 850, 945, 1130, 1220, 1270, 1330, 1425, 1500, 1595, 1655, 1710, 3500) cm -1 (1,2). IZVLEČEK Uporabnost lignocelulozne biomase je odvisna od njene kemične sestave. Standardni analizni postopki za karakterizacijo so zamudni, dragi in operativno zahtevni. Sodobne instrumentalne tehnike, med katere sodi tudi infrardeča spektroskopija (FTIR), omogočajo hitro in enostavno analizo komponent biomase, kot so celuloza, hemiceluloza, različni sladkorji in lignin. V sklopu raziskave smo uporabili tehniko ATR-FTIR za napovedovanje vsebnosti lignina in sladkorjev v vzorcih biomase. Eksperimente smo izvedli s pomočjo umetno pripravljenih zmesi čistih komponent celuloze, lignina, ksiloze in manoze. Z merjenjem višine karakteris- tičnih absorpcijskih vrhov v spektrih v odvisnosti od koncentracije smo izdelali umeritveni krivulji za lignin s koeficientom linear- nosti R 2 – 0,978 in za ksilozo z R 2 – 0,999. Izračun vsebnosti obeh komponent v referenčni zmesi na osnovi posnetih spektrov je pokazal, da vrednosti odstopajo od teoretičnih za manj kot 15 %, na osnovi česar ugotavljamo, da je spektroskopija ATR-FTIR po- tencialno zanimiva tehnika za kvantitativno analizo komponent biomase, vendar bo potrebna optimizacija postopka. Ključne besede: FTIR, infrardeča spektroskopija, kvantitativna analiza, biomasa, celuloza, lignin, ksiloza, manoza ABSTRACT The utilization of lignocellulose biomass depends on its chemical structure. Standard analytical procedures for its characterization are time-consuming, expensive and labor-intensive. Modern instrumental techniques, including infrared spectroscopy (FTIR) enable fast and simple analysis of biomass components, e.g. cellulose, hemicellulose, different sugars and lignin. Within our research of biomass composition, we tested the suitability of ATR-FTIR technique for the prediction of lignin and sugar contents. The experiments were carried out by using artificially prepared mixtures of pure cellulose, lignin, xylose and mannose. Calibration curves for lignin and xylose were prepared by measuring the characteristic absorption peak heights as a function of concentration. The obtained linearity coefficient R 2 for lignin was 0.978 and 0.999 for xylose. The calculated content of both components in a reference mixture using spectral data indicated that the values deviated from the theoretical ones by less than 15 %, which made the ATR-FTIR spectroscopy a potentially interesting analytical tool for the quantification of biomass components. However, further optimisation is still needed. Keywords: FTIR, infrared spectroscopy, quantitative analysis, biomass, cellulose, lignin, xylose, mannose Maja FRELIH 1 , Janja ZULE 1 , Lorna FLAJŠMAN 1 ANALIZA LIGNOCELULOZNE BIOMASE S FTIR SPEKTROSKOPIJO QUANTITATIVE ANALYSIS OF LIGNOCELLULOSE BIOMASS BY MEANS OF FTIR SPECTROSCOPY Čeprav je uporaba FTIR še vedno usmerje- na predvsem na proučevanje strukturnih lastnosti biomase, pa je bilo precej razi- skav posvečenih tudi kvantitativni določitvi vsebnosti posameznih komponent, in sicer celuloze, hemiceluloze, lignina in ekstrak- tivov v različnih vrstah biomase. V literaturi smo zasledili primere FTIR-analiz z uporabo KBr tablete in PAS tehnike (fotoakustična spektroskopija) za kvantitativno določanje vsebnosti sladkorjev in lignina v ostankih iz predelave iglavcev (3), koncentracijo lignina, ogljikovih hidratov, ekstraktivov in pepela v slami (4,5), polisaharide (arabino- ksilan) v žitnih otrobih (6), koncentracijo celuloze, hemiceluloze in lignina v slami različnih žitaric (7, 8), koncentracijo lignina v lesu evkaliptusa (9). Namen preliminarne raziskave je bil ugota- vljanje primernosti spektroskopije ATR-FTIR za določanje oz. napovedovanje vsebnosti celuloze, hemiceluloze in lignina na osnovi identifikacije karakterističnih absorpcijskih vrhov in kalibracije instrumenta z upora- bo zmesi standardnih spojin, saj se tehnika ATR uporablja predvsem za identifikacijo neznanih spojin. Bistveno manj je podatkov o njeni uporabi za kvantitativne namene. 2 MATERIALI IN METODE Potencial tehnike FTIR z ATR (attenuated total reflection) snemanjem spektra za kvantitativno delo smo testirali na umetno pripravljenih mešanicah celuloze, lignina, manoze in ksiloze z znano vsebnostjo po- sameznih komponent. Za pripravo mešanic smo uporabili komercialno dostopne kemi- kalije analizne čistosti. 2.1 Priprava vzorcev Natančno smo zatehtali določene mase čistih kemikalij, in sicer mikrokristalinične celuloze (MCC), manoze (D+ manoza) in ksiloze (D+ ksiloza) od proizvajalca Fluke ter lignina, pridobljenega po Milox tehnolo- škem postopku. Pripravili smo mešanice, v katerih se je vsebnost navedenih kompo- nent gibala v območju med 0 % in 100 % (Preglednica 1). Ker velikost delcev vzorca in kontaktna površina s kristalom ATR pri snemanju bistveno vplivata na kakovost spektrov in intenziteto vrhov, smo vse čiste kemikalije in zmesi pred snemanjem spe- ktrov 2 minuti homogenizirali na vibracij- skem krogličnem homogenizatorju Perkin Elmer. Vzorce umetno pripravljenih zmesi (1–6) smo uporabili za kalibracijo, vzorec 7 pa za preverjanje natančnosti oz. primernosti teh- nike ATR-FTIR za kvantitativno vrednotenje. 2.2 Snemanje spektrov Spektre čistih substanc in pripravljenih mešanic smo posneli v tehniki ATR na in- strumentu Perkin Elmer Frontier MIR v ob- močju valovnih števil med 4000 cm -1 in 400 cm -1 . Uporabljena sila na nastavku ATR in kontaktna površina z vzorcem vplivata na Vzorec MCC % Lignin % D+ manoza % D+ ksiloza % 1 24,83 25,84 24,70 24,63 2 50,98 0,00 24,49 24,54 3 52,90 22,62 0,00 24,49 4 52,30 24,09 23,61 0,00 5 25,33 0,00 24,89 49,78 6 0,00 51,18 24,07 24,75 7 33,33 33,10 0,00 33,56 Preglednica 1: Sestava zmesi, uporabljenih za analizo ATR-FTIR Table 1: Composition of mixtures used for ATR-FTIR analysis kakovost spektra, zato je treba pri kvantita- tivnih določitvah zagotoviti enakomerno in- tenziteto spektralnega signala. V ta namen smo najprej definirali optimalni pritisk, pri katerem je bila intenziteta karakterističnih trakov v posnetih spektrih najboljša, nakar smo uporabili enak pritisk pri snemanju spektrov mešanic. 3 REZULTATI Z RAZPRAVO 3.1 Umeritvene krivulje za določanje koncentracije lignina Za pripravo umeritvene krivulje smo posneli spektre dveh različnih mešanic, ki sta vse- bovali približno 25 % in 50 % lignina ter spekter čistega lignina (100 %). Spremljali smo odvisnost višine karakterističnih trakov lignina od valovne dolžine oz. valovnega števila v spektralnih območjih 1090– 1100 cm -1 , 1200 cm -1 in 1500–1600 cm - 1 . Na spektrih je bila vidna razlika v višini karakterističnih vrhov merjenih vzorcev. Višina je linearno sorazmerna koncentraciji komponente v zmesi. Za pripravo umerit- vene krivulje smo posneli tri spektre čistega lignina in obeh zmesi. Po korekciji bazne linije smo za statistično obdelavo uporabi- li povprečne vrednosti izmerjenih višin pri posameznih znanih koncentracijah lignina. FTIR spektri lignina in zmesi (vzorec 1 in 6) so prikazani na sliki 1, umeritvena krivulja pa na sliki 2. Slika 1: Spektri zmesi 1 (25,84 % lignina) in 6 (51,18 % lignina) in spekter čistega lignina (100 %), uporabljeni za kalibracijo Figure 1: Spectra of mixtures 1 (25.84% of lignin) and 6 (51.18% of lignin,) and spectrum of pure lignin (100%) used for calibration Slika 2: Umeritvena krivulja za kvantitativno napovedovanje vsebnosti lignina Figure 2: Calibration curve for the quantitative prediction of lignin content RAZISKAVE IN RAZVOJ Papir za notranjost revije PAPIR je prispevala papirnica Goričane, tovarna papirja Medvode, d.d. Sora Matt + 80 g/m 2 . Papir za notranjost revije PAPIR je prispevala papirnica Goričane, tovarna papirja Medvode, d.d. Sora Matt + 80 g/m 2 . RAZISKAVE IN RAZVOJ Raziskujemo in razvijamo Raziskujemo in razvijamo | junij 2018 | 19 | XLVI | junij 2018 | 19 | XLVI 3.2 Umeritvene krivulje za določanje koncentracije ksiloze Umeritveno krivuljo za napovedova- nje koncentracije ksiloze smo pripravi- li na enak način kot v primeru ligni- na. Posneli smo spektre dveh različnih mešanic, ki vsebujeta približno 25 % in 50 % ksiloze in spekter čiste ksiloze (100 %). Spremljali smo odvisnost viši- ne karakterističnih absorpcijskih vrhov ksiloze od valovne dolžine oz. valovne- ga števila v območjih 3250–3340 cm -1 in 910–940 cm -1 . Na spektrih je bila tudi v tem primeru opazna razlika v višini vrhov ksiloze, in sicer v odvisno- sti od koncentracije. Posneli smo po tri spektre čiste spojine in obeh zmesi. Po korekciji bazne linije smo tudi tu za sta- tistično obdelavo uporabili povprečne vrednosti višin vrhov. FTIR spektri ksiloze in zmesi (vzorec 1 in 5) so prikazani na sliki 3, umeritvena krivulja za kvantita- tivno napovedovanje vsebnosti ksiloze pa na sliki 4. Slika 3: Spektri zmesi 1 (24,63 % ksiloze) in 5 (49,78 % ksiloze) in čiste D+ ksiloze, uporabljeni za kalibracijo Figure 3: Spectra of mixtures 1 (24.63 % of xylose) and 5 (49.78 % of xylose). and pure D+ xylose used for calibration Slika 5: Spekter zmesi 7 (33,10 % lignina) uporabljen za napovedovanje koncentracije lignina in testiranje postopka Figure 5: Spectrum of mixture 7 (33.10 % of lignin) used for the prediction of lignin content and procedure testingcalibration Slika 5: Spekter zmesi 7 (33,10 % lignina) uporabljen za napovedovanje koncentracije lignina in testiranje postopka Figure 5: Spectrum of mixture 7 (33.10 % of lignin) used for the prediction of lignin content and procedure testingcalibration Slika 4: Umeritvena krivulja za kvantitativno napovedovanje vsebnosti ksiloze Figure 4: Calibration curve for the quantitative prediction of xylose content Vzorec 7 z vsebnostjo 33,33 % celulo- ze, 33,10 % lignina in 33,56 % ksiloze smo uporabili za preverjanje ustreznos- ti kalibracije. Obravnavali smo ga kot neznan vzorec, ki je služil kot referenca pri oceni pravilnosti postopka za napo- vedovanje sestave vzorcev biomase s pomočjo priprave umeritvenih krivulj, upoštevajoč višine karakterističnih vrhov v FTIR spektru (sliki 2 in 4). Postopali smo na enak način kot v primeru pripra- ve umeritvenih krivulj, posneli smo tri spektre in po korekciji bazne linije spek- trov izračunali povprečne vrednosti višin odgovarjajočih, karakterističnih vrhov. Iz umeritvenih krivulj, ki so premice in podajajo zvezo med koncentracijo kom- ponente v zmesi in višino spektralnega vrha, smo s pomočjo računalniškega programa izračunali vsebnost lignina in ksiloze v pripravljeni zmesi. 3.3 Izračun vsebnosti lignina v umetno pripravljeni zmesi Na sliki 5 je prikazan spekter vzorca 7 (preglednica 1). Iz umeritvene krivulje za napovedovanje vsebnosti lignina (sli- ka 2) smo izračunali vsebnost lignina, in sicer je ta znašala 38 %, medtem ko je njegova dejanska koncentracija v zmesi 33,10 %. Razlika med realno in napo- vedano vrednostjo je 12,8 %. Vrednost koeficienta linearnosti umeritvene krivu- lje za lignin je 0,978. 3.4 Izračun vsebnost ksiloze v umetno pripravljeni zmesi Na sliki 6 je spekter zmesi 7 (pregledni- ca 1). Iz umeritvene krivulje za napo- vedovanje koncentracije ksiloze (slika 4) smo izračunali, da znaša vsebnost ksiloze v zmesi 37,7 %, medtem ko je njena dejanska koncentracija, ki smo jo pripravili, 33,56 %. Na osnovi obeh regresijskih enačb oz. umeritvenih pre- mic s koeficientom linearnosti za lignin 0,978 in ksilozo 0,999 ugotavljamo, da lahko s tehniko ATR-FTIR dobimo ab- sorpcijske spektre zmesi spojin z ustre- zno kakovostjo karakterističnih signalov, ki omogoča razvoj kvantitativnih me- tod za hitro in nedestruktivno analizo lignocelulozne biomase. Odstopanje napovedanih oz. izračunanih vrednosti od teoretičnih, in sicer 12,8 % v prime- ru lignina in 12,3 % v primeru ksiloze, je sprejemljivo, zato je metoda primer- na tudi za kvantitativno napovedova- nje vsebnosti strukturnih komponent biomase. Te vrednosti bo možno še bolj približati teoretičnim z optimiranjem pogojev snemanja in ustrezno matema- tično obdelavo podatkov, dobljenih na osnovi ATR-FTIR spektrov. 4 SKLEPI ATR-FTIR infrardeča spektroskopija v srednjem območju valovnih dolžin je najhitrejša tehnika določanja sestave vzorcev organskih in anorganskih snovi. Je preprosta za rokovanje in primerna za direktno karakterizacijo vzorcev, in sicer brez uporabe zahtevnejših postop- kov predpriprave, kot so npr. ekstrak- cija, derivatizacija in raztapljanje. FTIR spektri so ponovljivi, zato obstajajo obsežne podatkovne baze, na osnovi katerih lahko s primerjavo s spektri čis- tih spojin identificiramo sestavo vzorcev. Prvi preliminarni poskusi kvantifikaci- je komponent biomase so pokazali, da je tehniko možno uporabljati tudi za napovedovanje sestave lignocelulozne biomase. Postopek bo treba še nap- rej razvijati in ugotoviti vpliv vlage in velikosti delcev ter določiti optimalno število posnetih spektrov in spektralno ločljivost. FTIR spektroskopska analiza predstavlja velik potencial kot nadome- stilo za časovno zamudne in drage mo- kre kemijske metode. ZAHVALA Delo je bilo opravljeno znotraj razvoj- no-raziskovalnega programa CELKROG »Izkoriščanje potenciala biomase za razvoj naprednih materialov in bio-os- novanih produktov«, ki je sofinanciran s strani Republike Slovenije, Ministrstvo za izobraževanje, znanost in šport in Evropske unije, Evropski sklad za regio- nalni razvoj 2016–2020. 5 LITERATURA 1. ZULE, J., FRELIH, M., FLAJŠMAN, L. Rastlinska biomasa – možni alternativni vir papirnih vlaken. Papir 2017, vol. 45, št. 2, str. 34–37 2. XU, F., YU, J., TESSO, T., DOWELL, F., WANG, D. Qualitative and quantitative analysis of lig- nocellulosic biomass using infrared techniques: A mini-review. Applied Energy, 2013, vol. 104, str. 801–809 3. HAMES, B.R., THOMAS, S.R., SLUITER, A.D., ROTH, C.J.. Rapid biomass analysis. Applied Bio- chemistry and Biotechnology, 2003, vol. 105, str. 5–16 4. TUCKER, M.P ., NGUYEN, Q.A., EDDY, E.P ., KADAM, K.L., GEDVILAS, L.M., WEBB, J.D. Fou- rier transform infrared quantitative analysis of sugars and lignin in pretreated softwood solid residues. Applied Biochemistry and Biotechnolo- gy, 2001, vol. 91, str. 51–614. 5. TAMAKI, J., MAZZA, G. Rapid determination of carbohydrates, ash and extractives contents of straw using attenuated total reflectance Fou- rier transform mid-infrared spectroscopy. Jour- nal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, vol. 59, št. 12, str. 6346–6352 6. TAMAKI, J., MAZZA, G. Rapid determina- tion of lignin content of straw using Fourier transform mid-infrared spectroscopy. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, vol. 59, št. 2, str. 504-512 7. ROBERT, P ., MARQUIS, M., BARRON, C., GUILLON, F., SAULNIER, L. FT-IR investigation of cell wall polysaccharides from cereal grains. Arabinoxylan infrared assignment. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2005, vol. 53, št. 2, str. 7014–7018 8. ADAPA, P .K., TABIL, L.G., , SCHOENAU, G.J., CANAM, T., DUMONCEAUX, T. Quantita- tive analysis of lignocelluloseic components of non-treated and steam exploded barley, canola, oat and wheat straw using Fourier transform infrared spectroscopy. Journal of Agricultural Science and Technology B, 2011, vol. 1, št. 1, str. 177–188 9. RODRIGUES, J., FAIX, O., PEREIRA, H. Deter- mination of lignin content of Eucalyptus glob- ulus wood using FTIR spectroscopy, Holzfor- schung, 1998, vol. 52, št. 1, str. 46–50 Maja Frelih, dr. Janja Zule, Lorna Flajšman Inštitut za celulozo in papir Ljubljana