261 farm vestn 2022; 73
PREGLED
RAZVOJA METOD
ZA DOLOČANJE
VITAMINA D 
V KRVI
DEVELOPMENT OF
METhODS FOR ThE
MEASUREMENT OF
VITAMIN D IN BLOOD –
REVIEW
AVTORJI / AUThORS:
asist. Katarina Mlekuš Kozamernik, dr. med.1, 2
izr. prof. dr. Tomaž Kocjan, dr. med.1, 2
prof. dr. Tea Lanišnik Rižner, dr. med.3
1 UKC Ljubljana, Interna klinika, Klinični oddelek 
za endokrinologijo, diabetes in presnovne bolezni,
Zaloška cesta 7, 1000 Ljubljana
2 Univerza v Ljubljani, Medicinska fakulteta, 
Vrazov trg 2, 1000 Ljubljana
3 Univerza v Ljubljani, Medicinska fakulteta, 
Inštitut za biokemijo in molekularno genetiko,
Laboratorij za proučevanje molekularnih osnov 
in biooznačevalcev hormonsko odvisnih bolezni, 
Vrazov trg 2, 1000 Ljubljana.
NASLOV ZA DOPISOVANJE / CORRESPONDENCE:
E-mail: katarina.mlekuskozamernik@kclj.si
POVZETEK
Vitamin D je maščobotopen vitamin, ki ima številne
pomembne vloge v telesu in omogoča zdravo delo-
vanje več organskih sistemov. Zanimanje za vitamin
je D poraslo v prvem desetletju 21. stoletja, ko se je
pričelo raziskovanje njegove vloge v različnih bole-
zenskih procesih. Takrat se je strmo povečalo pov-
praševanje po laboratorijskem določanju 25-hidrok-
sivitamina D, ki ga uporabljamo za določanje zalog
vitamina D v telesu, zato je morala večina kliničnih
laboratorijev opustiti dolgotrajne ročne metode in
uvesti avtomatizirane. Zaradi različnih metodologij se
je povečala medlaboratorijska variabilnost meritev,
kar je tudi na raziskovalnem področju vodilo do ne-
konsistentnih zaključkov raziskav in metaanaliz. V
zadnjih letih se tako uveljavlja program standardizacije
meritev vitamina D, katerega glavni cilj je zmanjšanje
variabilnosti meritev in spodbujanje primerjav meritev
posameznih laboratorijev z referenčno metodo. 
KLJUČNE BESEDE: 
25-hidroksivitamin D, imunološki testi, masna spek-
trometrija, standardizacija, vitamin D
ABSTRACT
Vitamin D is a fat-soluble vitamin that plays an im-
portant role in the human body and enables the
proper functioning of several organ systems. Interest
in vitamin D grew especially in the first decade of the
21st century when its role in the pathogenesis of
various diseases was first recognised. At that time,
a demand for laboratory measurements of 25-hy-
droxyvitamin D that is used to assess the vitamin D
body stores rose sharply, so most clinical laboratories
had to abandon laborious manual methods and had
to introduce various automated techniques. Due to
different methodologies, the inter-laboratory variability
of measurements increased, which led to inconsistent
conclusions in studies and meta-analyses in this re-
search field. The Vitamin D Standardization Program
has been established in recent years. The main goal
is to reduce the variability of measurements and to
promote comparisons of individual laboratories’
measurements to the reference method. 
KEY WORDS: 
25-hydroxyvitamin D, immunological assay, mass
spectrometry, standardization, vitamin D
P
R
E
G
LE
D
N
I Z
N
A
N
S
TV
E
N
I Č
LA
N
K
I  
in D3, ki ju v organizem vnesemo s hrano, se do jeter pre-
neseta z lipoproteini (večinoma hilomikroni) (4). V jetrih po-
teka hidroksilacija, pri kateri nastajata 25-hidroksivitamin
D3 (25(Oh)D3 ali kalcidiol) in 25-hidroksivitamin D2
(25(Oh)D2). Razmerje med 25(Oh)D3 in 25(Oh)D2 je pri
osebah, ki ne prejemajo ergokalciferola približno 19 : 1 (5).
V ledvicah (nekoliko tudi v drugih tkivih) s pomočjo encima
1α-hidroksilaze nastajata biološko aktivni metabolit 1α,25-
dihidroksivitamin D3 (1α,25-(Oh)2D3 ali kalcitriol) in 1α,25-
dihidroksivitamin D2. V shemi (slika 2) prikazujemo stopnje
v sintezi 1α,25-dihidroksivitamina D3 oz. kalcitriola. 1α-hi-
droksilacija je natančno uravnavan korak v sintezi kalcitriola.
Izražanje gena za 1α-hidroksilazo stimulira paratiroidni hor-
mon (PTh), zavirata pa ga fibroblastni rastni faktor 23
(FGF23) in sam kalcitriol (6, 7). 
2DOLOČANJE RAVNI VITAMINAD V TELESU
Vitamin D ima pomembno vlogo pri homeostazi kalcija v te-
lesu. Uporabljamo ga za preprečevanje rahitisa in osteoma-
lacije. V zadnjem desetletju so objavili številne raziskave, ki
proučujejo vlogo vitamina D v različnih patofizioloških proce-
sih, pri čemer so rezultati nekonsistentni. Zaradi možnih
ugodnih učinkov vitamina D na srčno-žilne, maligne in avtoi-
mune bolezni in celo na smrtnost uporaba prehranskih do-
polnil, ki vsebujejo vitamin D, narašča (9). S tem narašča
tudi pomen meritev vitamina D, saj želimo pri posameznikih
zagotoviti zadostne ravni vitamina D in preprečiti na eni strani
pomanjkanje vitamina D in na drugi strani toksične učinke.
1UVOD
Vitamin D je ime za skupino sekosteroidov, med katerimi
sta najpomembnejša holekalciferol (vitamin D3) in ergokal-
ciferol (vitamin D2). holekalciferol (vitamin D3) lahko tvorimo
endogeno ali vnesemo s hrano živalskega izvora (npr. z ri-
bami, kot so sardine in losos, jajčnim rumenjakom, maslom,
rdečim mesom …), z obogatenimi živili in farmacevtskimi
pripravki, vključno s prehranskimi dopolnili. Ergokalciferol
(vitamin D2) se sintetizira iz ergosterola, ki nastaja v glivah.
V telo ga vnašamo izključno s hrano (npr. z gobami) oz.
prehranskimi dopolnili. Medtem ko v Evropi za dodajanje
vitamina D uporabljamo predvsem holekalciferol, so v ZDA
v preteklosti uporabljali izključno ergokalciferol (1).
Strukturno se ergokalciferol in holekalciferol razlikujeta po
dvojni vezi na mestih C22–C23 in po metilaciji na mestu
C24 (slika 1). Zaradi drugačne stranske verige se ergokal-
ciferol šibkeje veže na vezavno beljakovino za vitamin D
(DBP, vitamin D binding protein) in hitreje metabolizira, zato
njegova serumska koncentracija upada hitreje kot pri ho-
lekalciferolu (2). Večina raziskav je pokazala, da je ergokal-
ciferol nekoliko manj učinkovit za nadomeščanje vitamina
D in povišanje ravni 25-hidroksivitamina D (25(Oh)D) kot
holekalciferol (3), obstajajo pa tudi temu nasprotujoče štu-
dije (1).
Pri ljudeh vitamin D nastaja v koži pod vplivom sončne
svetlobe. 7-dehidroholesterol se z ultravijoličnimi B (UV-B)
žarki v koži pretvarja v provitamin D3, ki se nato preko ter-
mične izomerizacije pretvori v vitamin D3 (holekalciferol).
Ta se v krvi prenaša vezan na DBP in albumin. Vitamina D2
262
P
R
E
G
LE
D
 R
A
Z
V
O
JA
 M
E
TO
D
 Z
A
 D
O
LO
Č
A
N
JE
 V
IT
A
M
IN
A
 D
 V
 K
R
V
I
farm vestn 2022; 73
Slika 1: Strukturi ergokalciferola in holekalciferola.
Figure 1: Structures of ergocalciferol and cholecalciferol.
263 farm vestn 2022; 73
P
R
E
G
LE
D
N
I Z
N
A
N
S
TV
E
N
I Č
LA
N
K
I  
Za določanje zaloge vitamina D uporabljamo merjenje ce-
lokupnega 25(Oh)D (vključuje 25(Oh)D2 in 25(Oh)D3) v se-
rumu. 25(Oh)D ima dolg razpolovni čas v serumu (približno
tri tedne), pri čemer se praktično ves v koži sintetiziran ali
zaužit vitamin D3 pretvori v 25(Oh)D3, dokler količina sin-
tetiziranega oz. zaužitega vitamina D3 ne preseže 2000 IE
(50 µg) na dan (1 µg = 40 IE = 2,6 nmol vitamin D3).
25(Oh)D zato najboljše odraža tvorbo oz. vnos vitamina
D3 v telo (11). 
Serumska raven 25(Oh)D nam pove tudi, koliko substrata
je na razpolago za ledvično in izvenledvično 1α-hidroksi-
lazo. V nasprotju s 25-hidroksilacijo, je 1α-hidroksilacija
zelo natančno uravnavan proces. Kadar je raven 25(Oh)D
prenizka, poraste raven paratiroidnega hormona, ki poviša
izražanje gena za ledvično 1α-hidroksilazo (CYP27B1) (7).
Tako je lahko ob pomanjkanju vitamina D raven 1α,25-
(Oh)2D3 nizka, normalna ali celo visoka (12).
Merjenje 1α,25-(Oh)2D3 je zato klinično uporabno le pri
hudi ledvični bolezni, pri granulomatoznih boleznih in pri
nekaterih redkih boleznih, kot je na vitamin D odporen
rahitis (13). Drugi hidroksilirani metaboliti vitamina D, kot
so npr. 24,25-(Oh)2D3, 25,26-(Oh)2D3 in 23,25-(Oh)2D3,
so v krvi prisotni običajno v zelo nizkih koncentracijah.
Kadar so njihove koncentracije višje, kot npr. koncentracija
25,26-(Oh)2D3 pri dializnih bolnikih in pri bolnikih z idio-
patsko infantilno hiperkalcemijo, lahko pride do interfe-
rence pri določanju ravni 25(Oh)D z imunskimi metodami
(14). 
KRVNI
OBTOK
LEDVICA
MAŠČOBNO
TKIVO
KOŽA
UVB
PREHRANSKI
VIRI
Vitamin D3
Provitamin D3
(7-dehidroholesterol)
290-315 nm
Previtamin D3
Vitamin D3
(holekalciferol)
JETRA
25-hidroksilaza
25-hidroksiholekalciferol
oz. kalcidiol
25-(OH)D3
1α-hidroksilaza
1α,25-dihidroksiholekalciferol
oz. kalcitriol
CYP2R1
CYP27B1
−FGF23
PTH
−
+
DBP – vezavna beljakovina za vitamin D, PTh – paratiroidni hormon, FGF23 – fibroblastni rastni faktor 23, CYP2R1 – gen za 25-hidroksilazo,
CYP27B1 – gen za 1α-hidroksilazo
Slika 2: Nastanek in aktivacija vitamina D v človeškem organizmu; prirejeno po (6, 8).
Figure 2: Synthesis and activation of vitamin D in the human body; adopted from (6, 8).
264
N
O
V
E
 M
O
Ž
N
O
S
TI
 Z
D
R
A
V
LJ
E
N
JA
 S
P
IN
A
LN
E
 M
IŠ
IČ
N
E
 A
TR
O
FI
JE
farm vestn 2022; 73
Z vidika metodologij določanja vitamina D je pomemben
3-epimer 25(Oh)D3 (3-epi-25(Oh)D)3). Ta molekula se od
25(Oh)D3 razlikuje le v konfiguraciji hidroksilne skupine na
atomu C3. Zaradi enake molekulske mase ga tudi metode,
ki temeljijo na masni spektrometriji, lahko lažno zaznajo
kot 25(Oh)D3. V visokih koncentracijah je 3-epi-25(Oh)D3
prisoten pri dojenčkih, v nizkih koncentracijah pa so ga
zaznali tudi pri nekaterih odraslih (15, 16). 
Večina celic v telesu je izpostavljenih prostemu 25(Oh)D (ra-
zen celic v ledvicah in obščitnicah, v katere lahko vstopa ve-
zan na DBP preko mehanizma megalin/kubilin), ki pri zdravih
zelo dobro korelira s celokupnim 25(Oh)D. Pomembne razlike
se pojavljajo pri ljudeh z bistveno spremenjeno ravnjo DBP
(17). V bodoče bo potrebno meritve serumskega DBP in
neposredne meritve prostega 25(Oh)D standardizirati, da jih
bo mogoče uporabljati v klinični praksi (18).
3ZGODOVINSKI PREGLEDRAZVOJA METOD DOLOČANJAVITAMINA D V KRVI 
Že leta 1932 so Askew in sod. izolirali vitamin D2, vendar
so šele v času med 1965 in 1995 bolj podrobno raziskali
sintezo vitamina D (19). Povsem novo obdobje v razisko-
vanju se je začelo po letu 1967, ko so razjasnili metabolne
poti vitamina D3 in njegovo pretvorbo v hormonsko aktivno
obliko (20). Od takrat je bilo na temo vitamina D (npr. o
pogostosti pomanjkanja, o dodajanju vitamina D in o vplivu
pomanjkanja na bolezenske procese) objavljenih okrog
60.000 člankov, pri čemer so v raziskavah uporabljali zelo
različne načine merjenja ravni 25(Oh)D (21). 
haddad in sod. so prvi opisali ročno metodo s kompetitivno
vezavo na beljakovino (CBPA, competitive binding-protein
assays) za določanje 25(Oh)D (22). Leta 1977 so razvili
prvo metodo za določanje plazemske koncentracije vita-
mina D s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (hPLC,
high-performance liquid chromatography) (23). Leta 1981
so Parviainen in sod. razvili metodo, ki vključuje ločevanje
metabolitov vitamina D s hPLC in določevanje njihove kon-
centracije s CBPA (24). Ta metoda je bila dolgotrajna in
zato ni prešla v rutinsko uporabo. Zaradi razvoja poliklon-
skih protiteles proti 25(Oh)D, ki je vodil do razvoja radioi-
munskih metod (RIA, radioimmunoassay) in posodobitve
aparatur za hPLC so ročne metode CBPA do sredine 80-
ih let postale zastarele (25).
V začetku 80-ih so se tako pričele razvijati metode RIA.
Leta 1984 so Bouillon in sod. prvi opisali poenostavljeno
RIA, ki ni potrebovala predhodnega ločevanja s kromato-
grafijo (26). Osnovana je bila na zajčjih poliklonskih protite-
lesih. Uporabnost metode je bila omejena, saj z njo ni bilo
možno razlikovati med 25(Oh)D2 in 25(Oh)D3 (takrat so v
ZDA za nadomeščanje vitamina D večinoma uporabljali er-
gokalciferol). 
Konec 80-ih let je bilo tudi v slovenskem prostoru opra-
vljeno obsežnejše delo na področju analitike vitamina D
(27, 28). Leta 1993 so hollis in sodelavci opisali RIA za
določitev tako 25(Oh)D3 kot tudi 25(Oh)D2 na osnovi kozjih
poliklonskih protitelesih in 125I (29). Na podlagi te metode
so razvili prvo komercialno metodo RIA (tržil jo je DiaSorin)
za določitev tako 25(Oh)D2 kot tudi 25(Oh)D3 (25).
Slika 3: 3-epimer 25 hidroksivitamina D3 (3-epi-25(OH)D3).
Figure 3: 3-epimer 25 hydroxyvitamin D3 (3-epi-25(OH)D3).
265 farm vestn 2022; 73
P
R
E
G
LE
D
N
I Z
N
A
N
S
TV
E
N
I Č
LA
N
K
I  
V prvem desetletju 21. stoletja se je pričelo raziskovanje
vloge vitamina D v različnih bolezenskih procesih. Zaradi
velikega povpraševanja po določanju vitamina D, je morala
večina kliničnih laboratorijev opustiti ročne metode CBPA
in RIA, ki so jih uporabljali v 80-ih in zgodnjih 90-ih, in preiti
na avtomatizirane CBPA, klasične encimsko-imunske me-
tode (ELISA, enzyme-linked immunoassays) ali kemilumi-
niscenčne imunološke metode (CLIA, chemiluminescent
immunoassays) (25). 
Te avtomatizirane metode so relativno enostavne in hitre,
vendar imajo pomembne pomanjkljivosti. Glavno težavo
predstavlja zelo lipofilna narava 25(Oh)D in njegova močna
vezava na transportne beljakovine, kot so DBP in albumin,
ter na lipoproteine. Pri ročnih CBPA in RIA za sproščanje
25(Oh)D z vezavnih beljakovin uporabljamo organska topila,
ki pa z imunološkimi metodami in metodami avtomatizirane
CBPA niso kompatibilna (30). Za ekstrakcijo pri različnih
avtomatiziranih tehnikah uporabljamo različne pristope, kar
vpliva na končne rezultate (30). Razlike med rezultati ob
uporabi avtomatiziranih metod se še povečajo pri posa-
meznikih, ki imajo zaradi svojega fiziološkega stanja ali bo-
lezni bistveno spremenjeno raven DBP. Taki skupini sta
npr. nosečnice in bolniki s kronično ledvično boleznijo (30).
Prav tako se ravni DBP razlikujejo pri različnih rasnih sku-
pinah (31). Poleg tega tudi pri avtomatiziranih tehnikah,
kot pri vseh imunoloških testih, heterofilna protitelesa pov-
zročajo napake in predstavljajo interferenco (32). Avtoma-
tizirane metode morajo biti tudi zelo občutljive, saj je se-
rumska koncentracija 25(Oh)D zelo nizka; njihova meja
kvantifikacije mora biti vsaj 10 ng/ml oz. 25 nmol/L (33).
Leta 1994 so v Mednarodnem programu za zunanjo oceno
kakovosti določanja vitamina D (DEQAS, International vi-
tamin D External Quality Assessment Scheme) ugotovili,
da se rezultati ravni 25(Oh)D med različnimi laboratoriji
lahko razlikujejo celo do 32 % (25). Če torej uporabljamo
tradicionalne meje za opredeljevanje zaloge vitamina D
(30, 50 in 75 nmol/L) kot pomanjkljivo, zadostno in opti-
malno, lahko z nekaterimi metodami bolnikovo zalogo oce-
nimo narobe in se tudi napačno odločimo glede nado-
meščanja (1 nmol/L = 1 ng/mL × 2,5; v literaturi pogosto
zasledimo tudi sledeče meje 20 ng/mL, kar je ekvivalent
50 nmol/L, in 30 ng/mL, kar je ekvivalent 75 nmol/L) (25). 
Nadgradnja na področju določanja vitamina D so metode
tekočinske kromatografije sklopljene s tandemsko masno
spektrometrijo (LC-MS/MS, liquid chromatography with
tandem-mass spectrometry). Prednosti te metode so, da
omogoča merjenje vseh metabolitov, je relativno hitra ter
ima visoki občutljivost in specifičnost. Slabosti pa so pred-
vsem visoka cena inštrumentov in njihova kompleksnost,
ki zahteva visoko usposobljeno osebje za upravljanje in
vzdrževanje (25). Leta 1991 so Watson in sod. opisali me-
todo LC-MS/MS za določanje vitamina D3 in vitamina D2
ter njunih mono- in dihidroksiliranih metabolitov (34). Upo-
raba LC-MS/MS v klinične namene od takrat stalno na-
rašča. V poročilu DEQAS iz leta 2013 so ugotovili, da je
koeficient variacije med vsemi laboratoriji (n = 437) med
11 do 25 %, medtem ko je koeficient variacije med labo-
ratoriji, ki uporabljajo LC-MS/MS (n = 147), le med 9,7 in
11,3 % (35). Takrat je LC-MS/MS uporabljalo 25 % sode-
lujočih laboratorijev (35).
Trenutno so v kliničnih laboratorijih v uporabi različne avto-
matizirane metode (npr. Abbott Architect, DiaSorin Liaison,
IDS ISYS, Roche Elecsys in Cobas, Siemens Advia Cen-
taur) in tudi metode LC-MS/MS (npr. ClinMass) (36, 37).
Ob tem avtorji opozarjajo, da se kakovost avtomatiziranih
metod lahko bistveno razlikuje, pri čemer ne dosegajo vse
ciljnega koeficienta variacije, ki je do 10 % (38). Večina
proizvajalcev priporoča, da vsak laboratorij za posamezno
metodo sam določi referenčne vrednosti, kar pa je v praksi
pogosto težko izvedljivo (39). Za Slovenijo je bila postavitev
metode in pridobitev referenčnih vrednosti opravljena v
dveh diplomskih delih (40, 41). 
V bodoče pričakujemo večjo standardizacijo in analitično
zmogljivost avtomatiziranih metod in pogostejšo uporabo
LC-MS/MS, ob čemer pričakujemo boljšo kakovost in pri-
merljivost rezultatov. 
4STANDARDIZACIJADOLOČANJA VITAMINA D
Zaradi vseh težav pri določanju 25(Oh)D in za zmanjšanje
posledic, ki jih te težave povzročajo, so leta 2010 uvedli
program standardizacije meritev vitamina D (VDSP, The
Vitamin D Standardization Program), v katerega so vklju-
čeni: Ameriški Nacionalni inštitut za zdravje (oddelek za
prehranska dopolnila), Center za preprečevanje in obvla-
dovanje bolezni in Center za okolje in zdravje iz ZDA, Na-
cionalni inštitut za standardizacijo in tehnologijo iz ZDA in
Referenčni laboratorij za vitamin D univerze v Gentu (21,
42). Glavni cilj tega programa je zmanjšanje medlaborato-
rijske variabilnosti meritev koncentracije 25(Oh)D in spod-
bujanje primerjav meritev posameznih laboratorijev z refe-
renčno metodo.
Po uvedbi standardizacije so v Ameriki opravili retrospekti-
vne analize rezultatov meritev 25(Oh)D. Pred retrospektivno
standardizacijo so npr. podatki raziskav NhANES III (1988–
1994) in NhANES 2005–2006 kazali, da je v tem obdobju
prišlo do bistvenega upada ravni 25(Oh)D v populaciji. Po
standardizaciji rezultatov pa so dokazali, da se ravni
25(Oh)D v teh petnajstih letih niso bistveno spremenile
(43).
5SKLEP 
Vitamin D je dostopen širokemu krogu ljudi v farmacevtskih
pripravkih. Zaradi učinkov na kosti in potencialno ugodnih
drugih učinkov vitamina D poraba teh pripravkov v zadnjem
času narašča. S tem se veča tudi število določitev ravni
25(Oh)D in tudi število različnih laboratorijskih metod. Ob
tem raziskovalci opozarjajo, da vse metode niso enako
kakovostne in ne omogočajo vedno zanesljivega ločevanja
med pomanjkljivo, zadostno, optimalno in toksično ravnjo
vitamina D v telesu. Zato je pomembno dobro poznavanje
posamezne metode in upoštevanje njenih omejitev pri in-
terpretaciji rezultatov. Ob heterogenosti laboratorijskih me-
tod, ki se uporabljajo v raziskovalnem delu, je omejena
tudi primerljivost rezultatov posameznih raziskav. 
V Mednarodni shemi za zunanjo oceno kakovosti določitev
vitamina D (DEQAS) in v Programu za standardizacijo me-
ritev vitamina D (VDSP) spodbujajo uporabo kakovostnih
laboratorijskih metod, kar je ključno tako v kliničnem delu
kot tudi z vidika raziskovalnega dela, saj omogoča boljšo
primerljivost med različnimi raziskavami in zanesljivejše iz-
sledke metaanaliz. Vedno več laboratorijev je vključenih v
DEQAS, zato lahko v bodoče pričakujemo večjo primerlji-
vost laboratorijskih metod in boljše podatke iz raziskav, ki
proučujejo vpliv vitamina D na bolezenske procese pri lju-
deh. 
6LITERATURA
1. Holick MF, Biancuzzo RM, Chen TC, Klein EK, Young A, Bibuld
D, et. al. Vitamin D2 is as effective as vitamin D3 in maintaining
circulating concentrations of 25-hydroxyvitamin D. J Clin
Endocrinol Metab. 2008;93(3):677–81. 
2. Gallagher JC, Bikle DD. Vitamin D: Mechanisms of Action and
Clinical Applications. Endocrinology and Metabolism Clinics of
North America. 2017;46(4):xvii–xviii. 
3. Trang HM, Cole DE, Rubin LA, Pierratos A, Siu S, Vieth R.
Evidence that vitamin D3 increases serum 25-hydroxyvitamin D
more efficiently than does vitamin D2. Am J Clin Nutr.
1998;68(4):854–8. 
4. Trifiletti RR. Vitamin D. V: Aminoff MJ, Daroff RB, uredniki.
Encyclopedia of the Neurological Sciences (Second Edition)
[Internet]. Oxford: Academic Press; 2014 [cited 2021 Sep 4].
719–20. Available from:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B978012385
1574001184
5. Clemens TL, Zhou XY, Myles M, Endres D, Lindsay R. Serum
vitamin D2 and vitamin D3 metabolite concentrations and
absorption of vitamin D2 in elderly subjects. J Clin Endocrinol
Metab. 1986;63(3):656–60. 
6. Henry HL. Regulation of vitamin D metabolism. Best Practice &
Research Clinical Endocrinology & Metabolism.
2011;25(4):531–41. 
7. Brenza HL, DeLuca HF. Regulation of 25-hydroxyvitamin D3
1alpha-hydroxylase gene expression by parathyroid hormone
and 1,25-dihydroxyvitamin D3. Arch Biochem Biophys.
2000;381(1):143–52. 
8. Jäpelt RB, Silvestro D, Smedsgaard J, Jensen PE, Jakobsen J.
Quantification of vitamin D3 and its hydroxylated metabolites in
waxy leaf nightshade (Solanum glaucophyllum Desf.), tomato
(Solanum lycopersicum L.) and bell pepper (Capsicum annuum
L.). Food Chem. 2013;138(2–3):1206–11. 
9. Bjelakovic G, Gluud LL, Nikolova D, Whitfield K, Wetterslev J,
Simonetti RG, idr. Vitamin D supplementation for prevention of
mortality in adults. Cochrane Database of Systematic Reviews
[Internet]. 2014 [cited 2022 Apr 4];(1). Available from:
https://www.cochranelibrary.com/cdsr/doi/10.1002/14651858.
CD007470.pub3/full
10. Yu CL, Falk RT, Kimlin MG, Rajaraman P, Sigurdson AJ, Horst
RL, idr. The impact of delayed blood centrifuging, choice of
collection tube, and type of assay on 25-hydroxyvitamin D
concentrations. Cancer Causes Control. 2010;21(4):643–8. 
11. Heaney RP, Armas LAG, Shary JR, Bell NH, Binkley N, Hollis
BW. 25-Hydroxylation of vitamin D3: relation to circulating
vitamin D3 under various input conditions. Am J Clin Nutr.
2008;87(6):1738–42. 
12. Cannell JJ, Hollis BW. Use of vitamin D in clinical practice.
Altern Med Rev. 2008;13(1):6–20. 
13. Lips P. The relative value of 25(OH)D and 1,25(OH)2D
measurements. Endocrine Abstracts [Internet]. 2009 [cited
2021 Avg 1];20. Available from: https://www.endocrine-
abstracts.org/ea/0020/ea0020me11
14. Carter GD, Jones JC, Shannon J, Williams EL, Jones G,
Kaufmann M, idr. 25-Hydroxyvitamin D assays: Potential
interference from other circulating vitamin D metabolites. J
Steroid Biochem Mol Biol. 2016;164:134–8. 
15. Lensmeyer G, Poquette M, Wiebe D, Binkley N. The C-3 epimer
of 25-hydroxyvitamin D(3) is present in adult serum. J Clin
Endocrinol Metab. 2012;97(1):163–8. 
16. Singh RJ, Taylor RL, Reddy GS, Grebe SKG. C-3 epimers can
account for a significant proportion of total circulating 25-
hydroxyvitamin D in infants, complicating accurate
measurement and interpretation of vitamin D status. J Clin
Endocrinol Metab. 2006;91(8):3055–61. 
17. Fraser WD, Tang JCY, Dutton JJ, Schoenmakers I. Vitamin D
Measurement, the Debates Continue, New Analytes Have
Emerged, Developments Have Variable Outcomes. Calcif
Tissue Int. 2020;106(1):3–13. 
18. Bikle D, Bouillon R, Thadhani R, Schoenmakers I. Vitamin D
metabolites in captivity? Should we measure free or total
266
Z
D
R
A
V
LJ
E
N
JE
 K
O
R
O
N
A
V
IR
U
S
N
E
 B
O
LE
Z
N
I 1
9 
Z
 Z
D
R
A
V
IL
I
farm vestn 2022; 73
267 farm vestn 2022; 73
P
R
E
G
LE
D
N
I Z
N
A
N
S
TV
E
N
I Č
LA
N
K
I  
25(OH)D to assess vitamin D status? J Steroid Biochem Mol
Biol. 2017;173:105–16. 
19. Askew FA, Bourdillon RB, Bruce HM, Jenkins RGC, Webster
TA, Dale HH. The distillation of vitamin D. Proceedings of the
Royal Society of London Series B, Containing Papers of a
Biological Character. 1930;107(748):76–90. 
20. Norman AW, Henry HL. Hormones. Academic Press; 2014. p.
430. 
21. Binkley N, Dawson-Hughes B, Durazo-Arvizu R, Thamm M,
Tian L, Merkel JM, idr. Vitamin D measurement standardization:
The way out of the chaos. J Steroid Biochem Mol Biol.
2017;173:117–21. 
22. Haddad JG, Chyu KJ. Competitive protein-binding radioassay
for 25-hydroxycholecalciferol. J Clin Endocrinol Metab.
1971;33(6):992–5. 
23. Eisman JA, Shepard RM, DeLuca HF. Determination of 25-
hydroxyvitamin D2 and 25-hydroxyvitamin D3 in human plasma
using high-pressure liquid chromatography. Anal Biochem.
1977;80(1):298–305. 
24. Parviainen MT, Savolainen KE, Korhonen PH, Alhava EM,
Visakorpi JK. An improved method for routine determination of
vitamin D and its hydroxylated metabolites in serum from
children and adults. Clin Chim Acta. 1981;114(2–3):233–47. 
25. Le Goff C, Cavalier E, Souberbielle JC, González-Antuña A,
Delvin E. Measurement of circulating 25-hydroxyvitamin D: A
historical review. Pract Lab Med. 2015;2:1–14. 
26. Bouillon R, Van Herck E, Jans I, Tan BK, Van Baelen H, De
Moor P. Two direct (nonchromatographic) assays for 25-
hydroxyvitamin D. Clin Chem. 1984;30(11):1731–6. 
27. Osredkar J, Vrhovec I. A method for determination of 25-
hydroxyvitamin D3 and 1,25-dihydroxyvitamin D3 in human
serum by using high-performance liquid chromatography with
gradient elution and radioimmunologic detection. Journal of
Liquid Chromatography and Related Technologies.
1989;12(10):1897–907. 
28. Osredkar J, Vrhovec I. Vitamin D in presnovki : fiziologija,
patofiziologija in metode določanja = Vitamin D and its
metabolists : physiology, pathophysiology and determination
methods. Farmacevtski vestnik. 1989;40(1):5–26. 
29. Hollis BW, Kamerud JQ, Selvaag SR, Lorenz JD, Napoli JL.
Determination of vitamin D status by radioimmunoassay with an
125I-labeled tracer. Clin Chem. 1993;39(3):529–33. 
30. Depreter B, Heijboer AC, Langlois MR. Accuracy of three
automated 25-hydroxyvitamin D assays in hemodialysis
patients. Clin Chim Acta. 2013;415:255–60. 
31. Powe CE, Evans MK, Wenger J, Zonderman AB, Berg AH,
Nalls M, idr. Vitamin D-binding protein and vitamin D status of
black Americans and white Americans. N Engl J Med.
2013;369(21):1991–2000. 
32. Cavalier E, Carlisi A, Bekaert AC, Rousselle O, Chapelle JP.
Human anti-animal interference in DiaSorin Liaison total 25(OH)-
vitamin D assay: towards the end of a strange story? Clin Chim
Acta. 2012;413(3–4):527–8. 
33. Ofenloch-Haehnle B. Approaches to measurement of vitamin D
concentrations - immunoassays. Scand J Clin Lab Invest
Suppl. 2012;243:50–3. 
34. Watson D, Setchell KD, Ross R. Analysis of vitamin D and its
metabolites using thermospray liquid chromatography/mass
spectrometry. Biomed Chromatogr. 1991;5(4):153–60. 
35. Carter GD, Berry J, Durazo-Arvizu R, Gunter E, Jones G, Jones
J, idr. Hydroxyvitamin D assays: An historical perspective from
DEQAS. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular
Biology. 2018;177:30–5. 
36. Arneson WL, Arneson DL. Current Methods for Routine Clinical
Laboratory Testing of Vitamin D Levels. Lab Med.
2013;44(1):e38–42. 
37. Enko D, Kriegshäuser G, Stolba R, Worf E, Halwachs-Baumann
G. Method evaluation study of a new generation of vitamin D
assays. Biochem Med (Zagreb). 2015;25(2):203–12. 
38. Stöckl D, Sluss PM, Thienpont LM. Specifications for trueness
and precision of a reference measurement system for
serum/plasma 25-hydroxyvitamin D analysis. Clinica Chimica
Acta. 2009;408(1):8–13. 
39. Osredkar J, Marc J. Vitamin D in presnovki: fiziologija,
patofiziologija in referenčne vrednosti. Medicinski razgledi.
1996;35:543–65. 
40. Kokalj T. Določanje orientacijskih referenčnih vrednosti vitamina
D in njegovih presnovkov v človeškem krvnem serumu =
Determination of reference values of vitamin D and its
metabolites in human blood serum : diplomsko delo. Ljubljana;
1995. 
41. Gros K. . Določitev orientacijskih referenčnih vrednosti vitamina
D (25-OH) v serumu = Determination of reference values of
vitamin D in human blood serum : diplomska naloga,. Ljubljana;
2008
42. Hormone and Vitamin D Standardization Programs
(HoSt/VDSCP) | CDC [Internet]. 2019 [cited 2021 Aug 1].
Available from: https://www.cdc.gov/labstandards/hs.html
43. Schleicher RL, Sternberg MR, Lacher DA, Sempos CT, Looker
AC, Durazo-Arvizu RA, idr. The vitamin D status of the US
population from 1988 to 2010 using standardized serum
concentrations of 25-hydroxyvitamin D shows recent modest
increases. Am J Clin Nutr. 2016;104(2):454–61.