Pregledni œlanki - Review Articles
Duøikov oksid III: zaviralci prekomernega nastajanja
Nitric oxide III: inhibitors of excessive formation
Janez Mravljak, Barbara B. Byrne Habiœ, Slavko Peœar
POVZETEK: Duøikov oksid lahko zaradi svoje radikalske narave pri poviøanih koncentracijah povzroœi øtevilna obolenja in poøkodbe tkiva na mestu prekomernega nastanka. NO sintaze – druæina encimov, ki katalizirajo pretvorbo arginina do NO in citrulina, so pomembne terapevtske tarœe, tako na nivoju vezave substrata in kofaktorjev, kakor tudi na nivoju genske ekspresije. Velik izziv za naœrtovanje in razvoj novih zdravil predstavljajo izoformno selektivni inhibitorji NO sintaz.
Kljuœne besede: duøikov oksid, zaviralci NO sintaze, analogi L-arginina.
ABSTRACT: Due to its radical nature nitric oxide can cause many illness and injuries of tissue by elevated concentrations at the site of its excessive formation. NO synthases – family of enzymes that catalyze conversion of arginine to NO and citrulline, are important therapeutic targets at the level of binding of substrate and cofactors as well as at the level of gene expression. Isophormically selective inhibitors of NO synthases represent considerable challenges for drug development.
Key words: nitric oxide, inhibitors of NO synthase, analogues of L-arginine.
1  Uvod
V prvem strokovnem œlanku o duøikovem oksidu (1) smo predstavili kemizem in radikalsko naravo duøikovega oksida (NO) v organizmu, v drugem strokovnem œlanku (2) pa smo podrobneje obravnavali njegove bioloøke uœinke in uœinkovine, ki sproøœajo NO v in vivo pogojih.
V tem prispevku pa bomo predstavili prijemaliøœa in razvoj nekaterih selektivnih inhibitorjev NO sintaz (NOS) kot potencialnih zdravilnih uœinkovin pri prepreœevanju in zdravljenju obolenj oziroma poøkodb povezanih s prekomernim nastajanjem NO.
Druæina NOS obsega pri sesalcih tri izoformne oblike, ki so jih poimenovali po lastnostih oziroma tipu celic v katerih so jih prviœ opisali: endotelijska NOS (eNOS), nevronska NOS (nNOS) in inducibilna NOS (iNOS) (3). Fizioloøka vloga NO je doloœena predvsem z izoformno obliko NOS, ki ga tvori; lahko nastopa kot medceliœni mediator ali kot citotoksiœni agens v imunskem sistemu. S prekomerno tvorbo NO v doloœenih okoliøœinah pa lahko NOS povzroœijo poøkodbe tkiva pri øtevilnih obolenjih. V teh primerih bi lahko dosegli terapevtsko ugodne uœinke s selektivno inhibicijo iNOS in nNOS, medtem ko je dolgotrajna inhibicija eNOS vsekakor økodljiva.
2  Zaviranje prekomernega nastajanja NO
Poveœana lokalna koncentracija NO ob hkratni prisotnosti drugih reaktivnih kisikovih in duøikovih zvrsti dokazano povzroœi okvare v vsakem tkivu (1, 3). Prekomerno izraæanje iNOS so opazili pri modelih sep-
tiœnega øoka, pri vseh vnetjih, astmi in v moæganih po ishemiji ali travmi. V øtevilnih nevrodegenerativnih obolenjih kot so Alzheimerjeva bolezen, multipla skleroza, Parkinsonova bolezen ter pri avtoimunih obolenjih (celiakija, artritis) ima iNOS pomembno vlogo (4). Æal iNOS ni edini vzrok za porast NO. Opisali so tudi prekomerno aktivnost nNOS. Dokazali so, da se z N-metil-D-aspartatom (NMDA) inducirana nevro-toksiœnost zmanjøa ob soœasni uporabi zaviralcev NOS in da so pri miøih z okvarjeno nNOS poøkodbe zaradi kapi blaæje (5). Znano je, da NO sintaze lahko v nekaterih okoliøœinah tvorijo tudi superoksidni radikal, neodvisno od tvorbe NO. Za nNOS ugotavljajo, da najlaæje tvori superoksidni radikal, ko sta koncentraciji tetrahidrobiopterina (kofaktor) ali arginina (substrat) nizki, pa tudi ob prisotnosti zaviralcev podobnim argininu (6). Z omejitvijo prekomernega nastajanja NO lahko priœakuje-mo doloœene terapevtske uœinke. Glavni problemi so specifiœnost zaviranja samo doloœenega tipa NOS v doloœenih tkivih, øe zlasti so terapevtsko zanimivi zaviralci iNOS in nNOS. Njihov razvoj je v srediøœu danaønjih raziskav. Po mehanizmu delovanja so zaviralci NOS:
-analogi arginina,
-zaviralci dimerizacije NOS,
-zaviralci kofaktorjev NOS in
-zaviralci, ki delujejo po drugih mehanizmih.
2. 1 Zaviralci podobni L-argininu
L-arginin (L-Arg) v visokih koncentracijah (nad 100 µM) zavira eNOS. Uœinek je posledica njegove vezave na alosteriœno mesto NOS in s tem ovirana vezave L-Arg na aktivno mesto encima. Prvi znani zavi-
Janez Mravljak, mag. farm., Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Aøkerœeva 7, SI-1000 Ljubljana
Barbara B. Byrne Habiœ, mag. farm., Zavod za farmacijo in preizkuøanje zdravil, Ptujska 21, 1000 Ljubljana
prof. dr. Slavko Peœar, mag. farm., Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Aøkerœeva 7 in Institut Joæef Stefan, Jamova 39, 1000 Ljubljana
120 farm vestn 2005; 56
Duøikov oksid III: zaviralci prekomernega nastajanja
ralci so bili preprosti analogi L-Arg, npr.: NG-monometil-L-arginin (L-NMMA), NG-nitro-L-arginin (L-NNA) in njegov metilni ester (L-NAME) (7, 8, 9) (slika 1). Œeprav so si spojine strukturno podobne, zavirajo NOS na razliœne naœine.
Ugotovili so da z majhnimi spremembami v argininskem delu poveœamo selektivnost bodisi v smeri iNOS ali nNOS. N-oksid L-NMMA (slika 3) je uœinkovit zaviralec iNOS, ki zavre tvorbo NO po stimulaciji z lipopolisaharidi. Zamenjava metilne skupine pri L-NMMA s propilno (N-propil-L-Arg) ali ciklopropilno (N-ciklopropil-L-Arg) pa da selektivnejøi nNOS zaviralec (6).
Øtevilni analogi arginina, citrulina, tiocitrulina in njihovih derivatov so preteæno kompetitivni zaviralci nNOS. Te spojine prepreœijo tudi tvorbo reaktivnih kisikovih spojin in bi bile lahko uporabne proti hipotenz-iji, æveplo vsebujoœi derivati pa pri terapiji artritisa, migrene in postop-erativnega ileusa (3, 6).
Slika 1: Prvi opisani zaviralci NOS: NG-monometil-L-arginin (L-NMMA), NG-nitro-L-arginin (L-NNA) in njegov metilni ester (L-NAME). Figure 1: First known inhibitors of NOS: NG-monomethyl-L-arginine (L-NMMA),   NG-nitro-L-arginine   (L-NNA)   and   its   methyl   ester (L-NAME).
L-NMMA, ki je izoformno nespecifiœen inhibitor, uporaben v raziskovalne namene, pretvori encim v N-hidroksi-N-metil-L-arginin. Pri tem nastane H2O2, ki ireverzibilno okvari encim. V majhnih odmerkih ima L-NMMA ugodne uœinke pri terapiji septiœnega øoka, glavobola ter astme. Zmanjøa tudi vnetje koæe, povzroœene z ultravijoliœno svetlobo (3, 6). L-NNA pa spremeni konformacijo aktivnega mesta NOS in prepreœi vezavo L-Arg. Tovrstni zaviralci se veæejo na NOS poœasi in poœasi tudi disociirajo (10). Po vzoru N-nitroarginina (L-NNA) so pripravili analoge, ki so selektivni inhibitorji nNOS (11, 12) (slika 2).
Slika 2: Peptidni in neamidni analogi L-NNA kot selektivni inhibitorji
nNOS.
Figure 2: Peptide and nonamide analogues of L-NNA as selective
inhibitors of nNOS.
Sol L-NMMA in acetilsalicilne kisline (slika 3) je kombinacija dveh neselektivnih inhibitorjev encimov: NOS in ciklooksigenaze. V kliniœnih testiranjih (6) jo preizkuøajo za zdravljenje revmatoidnega artritisa, kardiovaskularnih motenj in motenj v cerebralni cirkulaciji.
Slika 3: Sol L-NMMA in acetilsalicilne kisline in N-oksid L-NMMA. Figure 3: Salt of L-NMMA and acetylsalicilic acid and N-oxide of L-NMMA.
NH
H.N^   JK 2     N        NHR
H N-aminogvanidini
nitrogvanidini
arilgvanidini
Slika 4: Derivati gvanidina kot zaviralci NOS Figure 4: Guanidine derivatives as NOS inhibitors
Med arilaminogvanidini in arilgvanidini (slika 4) so naøli selektivne zaviralce iNOS, ki bi bili uporabni za zdravljenje septiœnega øoka, hipotenzije, revmatoidnega artritisa, ulceroznega kolitisa in od insulina odvisnega diabetesa (3, 6). Zanimiv je poskus zdruæitve antioksi-danta (derivat vitamina E) in zaviralca NOS (Slika 4, arilgvanidinski derivat) v eno molekulo, ki istoœasno zavira lipidno peroksidacijo in nastajanje NO s pribliæno enako uœinkovitostjo (13). Za derivate N-tetrametilen-N’-arilgvanidinov so ugotovili, da bi bili lahko kot selektivni zaviralci nNOS (14, 15) (Slika 4) uœinkoviti pri terapiji nevrode-generativnih bolezni, izboljøanju krœenja æelodca in pri vnetnih obolenjih. Prouœujejo tudi uporabnost nitrogvanidinov, ki so zaviralci nNOS in iNOS pri zdravljenju kardiovaskularnih bolezni, motnjah cerebralne cirkulacije, aterosklerozi, diabetesu in sepsi.
Za amidine (slika 5) so ugotovili, da so selektivni zaviralci nNOS. Med njimi iøœejo uœinkovine za zdravljenje nevrodegenerativnih bolezni (6).
Tudi med S-substituiranimi izotioseœninami so uœinkoviti inhibitorji NOS (3, 6, 16) (Slika 6). Podobno kot L-NMMA, te spojine poøkoduje-jo okolico hema NOS in tako prepreœijo interakcijo encima s sub-
farm vestn 2005; 56 121
Pregledni œlanki - Review Articles
Me              O
BN 80933                              N-feniltiofenamidini
Slika 5: Derivati amidina Figure 5: Amidine derivatives
stratom. S-alkil izotioseœnine so uœinkovitejøi zaviralci, kot derivati arginina. Zaradi æveplovega atoma, ki ima veliko afiniteto do hema je S-metilizotioseœnina 500 krat uœinkovitejøi zaviralec iNOS, kot N-metil-L-arginin. Med S-alkil izotioseœninami so tudi selektivni inhibitorji nNOS, ki imajo terapevtski potencial pri zmanjøevanju poøkodb nevronov ob moæganski kapi in drugih nevrodegenerativnih obolenjih. Bis-izotioseœnine (1,3-PBITU, 1,4-PBITU; slika 6) kot prvi selektivni zaviralci iNOS, so zaradi nizke bioloøke uporabnosti in toksiœnosti (vpliva na Na+/K+ ATPazo) neuporabni.
S øtudijem vezave ligandov na NOS so priøli do treh znaœilnosti, ki jih mora imeti izoformno selektivni zaviralec (3, 16):
-na ogrodju mora biti gvanidinska, amidinska ali (tio)seœninska skupina, ki lahko tvori vodikovo vez z glutamatno stransko verigo v aktivnem mestu NOS. Prisotnost manjøe hidrofobne skupine (alkilna ali tienilna) je ugodna, ker omogoœa dodatno hidrofobno interakcijo;
1,3-PBITU ,    1,4-PBITU
bisizotiosecnine
R3 - 1,3-tiazin-2-amini
-NH,
izotiosecninski derivati
X >¦
R'^N—N
1,3-tiazepin-2-amini
W-fenil-4,5-dihidro-1,3-tiazol-2-amini
Slika 6: Izotioseœninski derivati Figure 6: Isothiourea derivatives.
122 farm vestn 2005; 56
-zaviralec mora imeti funkcionalno skupino, ki zagotavlja izoformno selektivnost z moænostjo tvorbe primernega vzorca vodikovih vezi. S to skupino izkoriøœamo razlike v aminokislinah med posameznimi izo-formami v kanalu, po katerem pride substrat do aktivnega mesta;
-zaviralec mora imeti distanœnik med obema deloma, ki je primerno dolg in gibljiv, da doseæe izoformno specifiœna podroœja.
Kljub veliki podobnosti arginin vezavnih mest pri izoencimih NOS so razvili visoko selektivne inhibitorje. Naj omenimo 1400W (slika 7), ki je 10000 krat selektivnejøi pri zaviranju iNOS kot eNOS in 30 krat selek-tivnejøi glede na nNOS (3, 6, 17). Kljub ugodni uœinkovitosti in selektivnosti pa je 1400W preveœ toksiœna spojina, da bi jo uporabljali.
Me
HN^N H
K^
Slika 7: Kemiœna struktura 1400W Figure 7: Chemical structure of 1400W
2. 2 Zaviralci dimerizacije NOS
Vse izoformne oblike NOS postanejo katalitiœno aktivne øele, ko dimer-izirata dve podenoti encima (3). Na nastajanje NO vplivamo tudi tako, da oviramo nastanek aktivnega dimera NOS iz monomernih enot. Opisani so derivati imidazolov, ki ob vezavi na hem v monomeru iNOS motijo eno od vijaœnic monomera tako, da spremenijo strukturo veza-vnega mesta za arginin (18). Inhibitor-monomer kompleks tako ne more tvoriti niti arginin- niti tetrahidrobiopterin vezavnega mesta. Opisane lastnosti imajo tudi protigliviœne uœinkovine: klotrimazol, mikonazol, ketokonazol, ki poleg tega prepreœujejo vezavo kalmodulina na iNOS. Kot zanimivi so se izkazali pirimidinimidazoli, med 2-aminopiridini pa so æe naøli øtevilne relativno selektivne iNOS in nNOS inhibitorje (6).
2. 3 Zaviralci kofaktorjev NOS
Za encimsko aktivnost NOS so potrebni kofaktorji (6R)-5,6,7,8,-tetrahidrobiopterin (BH4), flavinadenindinukleotid (FAD), flavin-mononukleotid (FMN), æelezov protoporfirin IX (hem) in kalmodulin, ki se veæejo na svoja vezavna mesta na aktiviranem dimeru NOS (3). Zaviralci vezave flavina in kalmodulina so æe dolgo znani, toda zaradi nezmoænosti doseganja selektivnosti so neuporabni. Veœjo pozornost posveœajo snovem, ki zavirajo vezavo tetrahidrobiopterina. Kofaktor (6R)-5,6,7,8-tetrahidrobiopterin maksimalno aktivira vse tri NOS in stabilizira kvarterno strukturo encima. S pomoœjo 3D-modela postavljenega s poznavanjem kvantitativnega odnosa med strukturo in delovanjem (3D-QSAR) so doloœili strukturne zahteve za zaviranje nNOS: 4-okso- in 4-aminopteridini (slika 8) zavirajo nNOS desetkrat selek-tivneje kot ostale NOS (19).
2. 4 Drugi zaviralci
Naøli so tudi endogene peptide in proteine, ki se veæejo na izoforme NOS in zavirjo njihovo aktivnost (3). nNOS inhibira 89 aminokislin dolg protein, imenovan protein inhibitor NOS (PIN), ki se veæe na N-termi-
Duøikov oksid III: zaviralci prekomernega nastajanja
Slika 8: 4-okso- in 4-aminopteridinski inhibitor izpeljana iz strukture kofaktorja 5,6,7,8-tetrahidrobiopterina
Figure 8: 4-oxo- and 4-aminopteridine inhibitors derived from the structure of cofactor 5,6,7,8-tetrahydrobiopterine
nalni konec encima. Odkrili so tudi druge inhibitorne domene na eNOS in nNOS, ki bi lahko bile tarœna mesta za selektivno inhibicijo. Tako in vivo aplikacija ogrodne domene kaveolina-1 inhibira eNOS aktivnost, kar potrjuje, da utegne biti ta pristop uporaben.
V literaturi je opisanih veliko uœinkovin (tako endogenega kot ekso-genega izvora), ki vplivajo na ekspresijo inducibilne NO sintaze (iNOS) (20). Del uœinka uveljavljenih glukokorikoidov, je posledica zaviranja transkripcije gena za iNOS. Obetajoœa uœinkovina, ki je v fazi kliniœnega testiranja, je analog heptapeptida a-melanocite stim-ulirajoœega hormona (6, 21). Ta analog zavira izraæanje øtevilnih kljuœnih citokinov, kot so interlevkini -1b, -6 in -10 in TNF-a, kakor tudi iNOS. Poznani so tudi piridotienotriazinski derivati, ki nespecifiœno zavirajo izraæanje iNOS in ciklooksigenaz (COX-1 in COX-2), vendar øe ni povsem jasno, ali bo mogoœe doseœi selektivno zaviranje transkripcije gena za iNOS (6). Podobno ni jasno, ali bo moæno doseœi poveœanje ekspresije gena za eNOS. (Slika 9)
3 Sklep
Poleg znanih donorjev duøikovega oksida, ki jih æe vrsto let uspeøno uporabljamo v terapiji in katerih delovanje so pojasnili z odkritjem vloge NO v telesu, raziskovalci iøœejo in preizkuøajo nove zdravilne uœinkovine, z drugaœnimi mehanizmi sproøœanja NO, ki bi lahko delo-
m = ci,
R2:
COMe
Slika 9: Piridotienotriazinski derivati kot nespecifiœni zaviralci ekspresije iNOS in ciklooksigenaz.
Figure 9: Pyridothienotriazine derivatives as nonspecific inhibitors of iNOS and cyclooxygenases expression.
vale na æelena tarœna mesta in uœinkovine, ki bi uravnavale nastajanje NO. Dejstvo, da ima NO v mnogih patofizioloøkih procesih veœ-plastno vlogo, oteæuje odkritje zaviralcev iNOS in nNOS, ki bi uœinkovi-to posegli v uravnavanje nastajanja NO in s tem v doseganje æelene-ga uœinka brez neugodnih posledic. V prednosti bodo uœinkovine, ki bodo tkivno selektivne ter specifiœne za posamezno izoformno obliko NOS, pri œemer pa je æe sedaj znano, da je primernejøa delna inhibi-cija sintaze NO od popolne.
Glede na vpletenost NO v øtevilne procese v telesu, je pred raziskovalci velik izziv pri naœrtovanju takih uœinkovin, ki bodo uravnavale le doloœene procese, zato verjetno ne moremo priœakovati kmalu velikih preobratov na tem podroœju. Velik napredek bo, œe bo uspelo dostavljati izbran zaviralec doloœene izomorfne oblike NOS v doloœeno tkivo. V tem primeru pa lahko priœakujemo velike spremembe pri mnogih obolenjih, ki jih danes nemoœno opazujemo.
4 Literatura
10. 11.
12.
13.
14.
15. 16.
17.
18. 19.
20. 21.
Byrne Habiœ B, Mravljak J, Peœar S. Duøikov oksid I: lastnosti, kemiœna reaktivnost in nastajanje NO v organizmu. Farm Vestn 2004; 55: 283-291.
Mravljak J, Byrne Habiœ B, Peœar S. Duøikov oksid I: bioloøki uœinki in uœinkovine, ki sproøœajo NO. Farm Vestn 2005; 56: 11-16.
Vallance P, Leiper J. Blocking NO synthesis: how, where and why?. Drug Discov Today 2002; 1: 939-950.
Hobbs A J, Higgs A, Moncada S. Inhibition of Nitric Oxide Synthase as a Potential Therapeutic Target. Annu Rev Pharmacol Toxicol 1999; 39:191-220. Bird D C, Bujas-Bobanovic M, Robertson H A et al. Lack of phencyclidine-induced effects in mice with reduced neuronal nitric oxide synthase. Psychopharmacology 2001; 155: 299-309.
Granik V G, Grigor’ev N B. Nitric oxide synthase inhibitors: biology and chemistry. Russ Chem Bull 2002; 51: 1973-1995.
Peterlin-Masic L, Kikelj D. Arginine mimetics.Tetrahedron 2001; 57 (33): 7073-7105. Moore W M, Webber R K, Jerome G M et al. L-N6-(1-Iminoethyl)lysine: A Selective Inhibitor of Inducible Nitric Oxide Synthase. J Med Chem 1994; 37: 3886-3888. Babu B R, Griffith O W. N5-(1-Imino-3-butenyl)-L-ornithine. J Biol Chem 1998; 273 (15): 8882-8889.
Wolfe M M. Future Trends in the Development of Safer Nonsteroidal Anti-inflamatory Drugs. Am J Med 1998; 105 (5A): 44S-52S.
Huang H, Martásek P, Roman L J et al. Synthesis and Evaluation of Peptidomimetics as Selective Inhibitors and Active Site Probes of Nitric Oxide Synthases. J Med Chem 2000; 43: 2938-2945.
Hallinan E A, Tsymbalov S, Dorn C R et al. Synthesis and Biological Characterizationof L-N6-(1-Iminoethyl)lysine 5-Tetrazole-amide, a Prodrug of a Selective iNOS Inhibitor. J Med Chem 2002; 45: 1686-1689.
Chabrier P E, Auguet M, Spinnewyn B et al. BN 80933, a dual inhibitor of neuronal nitric oxide synthase and lipid peroxidation: A promising neuroprotective strategy. Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96: 10824-10829.
Beaton H, Hamley P, Nicholls D J at al. 3,4-Dihydro-1-isoquinolinamines: A Novel Class of Nitric Oxide Synthase Inhibitors with a Range of Isoform Selectivity and Potency. Bioorg Med Chem Lett 2001; 11: 1023-1026.
Beaton H, Boughton-Smith N, Hamley P at al. Tienopyridines: Nitric Oxide Synthase Inhibitors with Potent In Vivo Activity. Bioorg Med Chem Lett 2001; 11: 1027-1030. Raman C S, Li H, Martásek P et al. Implications for Isoform-selective Inhibitor Design Derived from the Binding Mode of Bulky Isothioureas to the Heme Domain of Endothelial Nitric-oxide Synthase. J Biol Chem 2001; 276: 26486-26491.
Garvey E P, Oplinger J A, Purfine E S et al. 1400W Is a Slow, Tight Binding, and Highly Selective Inhibitor of Inducible Nitric-oxide Synthase in Vitro and in Vivo. J Biol Chem 1997; 272: 4959-4963.
Wolff D J, Datto G A, Samatovicz R A. The Dual Mode of Inhibition of Calmodulin-dependent Nitric-oxide Synthase by Antifungal Imidazole Agents. J Biol Chem 1993; 268: 9430-9436. Matter H, Kotsonis P, Klingler O et al. Structural Requirements for Inhibition of the Neuronal Nitric Oxide Synthase (NOS-I): 3D-QSAR Analysis of 4-Oxo- and 4- Amino-Pteridine-Based Inhibitors. J Med Chem 2002; 45: 2923-2941.
Rao K M K. Molecular mechanisms regulating iNOS expression in various cell types. J Toxicol Env Heal B 2000; 3(1): 27-58.
Annual Drug Data Report series. Ed J R Prous, Prous Science, S A, Barcelona-Philadelphia 1998, 20: 45.
farm vestn 2005; 56 123
2.
3.
4.
5.
6.
9.