UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA Žiga PANDUR MEHANIZEM DELOVANJA KAVITACIJSKIH MEHURČKOV NA BAKTERIJSKO CELICO DOKTORSKA DISERTACIJA Ljubljana, 2022 UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA Žiga PANDUR MEHANIZEM DELOVANJA KAVITACIJSKIH MEHURČKOV NA BAKTERIJSKO CELICO DOKTORSKA DISERTACIJA MECHANISM OF ACTION OF THE CAVITATION BUBBLES ON BACTERIAL CELL DOCTORAL DISSERTATION Ljubljana, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Na podlagi Statuta Univerze v Ljubljani ter po sklepu Senata Biotehniške fakultete in Senata Univerze v Ljubljani z dne 15. 9. 2020 je bilo potrjeno, da Žiga Pandur izpolnjuje pogoje za opravljanje doktorata znanosti na doktorskem študiju Agroživilska mikrobiologija, znanstveno področje: agroživilska mikrobiologija. Doktorsko delo je bilo opravljeno v laboratorijih Oddelka za mikrobiologijo na Biotehniški fakulteti Univerze v Ljubljani. Delo je bilo financirano s strani Evropskega raziskovalnega sveta in Ministrstva za izobraževanje, znanost in šport Republike Slovenije v skladu z Uredbo o sofinanciranju doktorskega študija. Za mentorja je bil imenovan prof. dr. David Stopar in za somentorja prof. dr. Matevž Dular. Mentor: prof. dr. David STOPAR Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za mikrobiologijo Somentor: prof. dr. Matevž DULAR Univerza v Ljubljani, Fakulteta za strojništvo, Katedra za energetsko strojništvo Komisija za oceno in zagovor: Predsednik: izr. prof. dr. Blaž STRES Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za mikrobiologijo Član: doc. dr. Martin PETKOVŠEK Univerza v Ljubljani, Fakulteta za strojništvo, Katedra za energetsko strojništvo Član:: doc. dr. Ignacijo BILUŠ Univerza v Mariboru, Fakulteta za strojništvo, Katedra za energetsko, procesno in okoljsko inženirstvo Datum zagovora: 15.12.2022 Doktorand: Žiga Pandur II Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA (KDI) ŠD Dd DK UDK 532.528:579.2:577.352(043)=163.6 KG kavitacija, kavitacijski mehurčki, bakterijska celična stena, liposomi, sferoplasti, mikroorganizmi, Escherichia coli, mehanizem inaktivacije, čiščenje voda AV PANDUR, Žiga, mag. mikrobiol. SA STOPAR, David (mentor), DULAR, Matevž (somentor) KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101 ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Interdisciplinarni doktorski študij Bioznanosti, znanstveno področje agroživilska mikrobiologija LI 2022 IN MEHANIZEM DELOVANJA KAVITACIJSKIH MEHURČKOV NA BAKTERIJSKO CELICO TD Doktorska Disertacija OP XI, 137, [75] str., 1 pregl., 9 sl., 4 pril., 200 vir. IJ sl JI sl/en AI Razpoložljivost neoporečne pitne vode postaja vse večja skrb v globaliziranem svetu. Kavitacija, kot nova obetajoča alternativna metoda pri procesu čiščenja vod, je pojav parnih mehurčkov v tekočinah ob hitrem lokalnem padcu tlaka, ki agresivno in hitro implodirajo, kar povzroča ekstremne fizikalno-kemijske razmere, ki imajo lahko uničujoč učinek na bakterije. Točen mehanizem inaktivacije bakterijskih celic s kavitacijo ni poznan. V doktorski disertaciji smo vpliv hidrodinamske in akustične kavitacije na lipidne vezikle, sferoplaste in bakterijske celice primerjali z vplivi fizikalno-kemijskih in mehanskih stresorjev. S selektivnim spreminjanjem izbranih komponent celične stene smo določili vpliv posameznih plasti na stabilnost celic pri kavitaciji in pokazali da je za stabilnost bakterij pri kavitaciji odločilen peptidoglikanski sloj. Za podrobnejše razumevanje interakcije med kavitacijskim mehurčkom in bakterijsko celico smo razvili novo metodo generiranja posameznega kavitacijskega mehurčka na mikrometrski časovni in prostorski skali, kar nam je omogočilo generiranje posameznega mikromehurčka v neposredni bližini bakterijske celice. Rezultati kažejo, da ima mikromehurček vpliv na bakterijske celice znotraj maksimalnega radija mikromehurčka. S pomočjo numeričnih analiz smo natančneje opisali razvoj kavitacijskega mehurčka in določili mejne sile, ki so potrebne za poškodovanje ali odtrganje celic iz površine. Rezultati te naloge prispevajo k bistveno bolj podrobnemu razumevanju kavitacije na nivoju posameznega mehurčka in njegovemu vplivu na bakterije, kar bo omogočalo nadaljnji razvoj metod kavitacije za namene čiščenja vode. III Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 KEY WORDS DOCUMENTATION (KWD) DN Dd DC UDK 532.528:579.2:577.352(043)=163.6 CX cavitation, cavitation bubbles, bacterial cell wall, liposomes, spheroplasts, microrganisms, Escherichia coli, inactivation mechanism, water treatment AU PANDUR, Žiga AA STOPAR, David (supervisor), DULAR, Matevž (co-advisor) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101 PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Interdisciplinary Doctoral Programme in Biosciences, field agrifood microbiology PY 2022 TI MECHANISM OF ACTION OF THE CAVITATION BUBBLES ON BACTERIAL CELL DT Doctoral Dissertation NO XI, 137, [75] p., 1 tab., 9 fig., 4 ann., 200 ref. LA sl AL sl/en AB Due to escalating pollution, the world's clean water supplies are becoming seriously endangered. One of the novel promising methods in water cleaning is cavitation, where a sudden decrease in pressure triggers the formation of vapor and gas bubbles in a liquid medium. Fast and aggressive bubble implosions cause extreme physical-chemical conditions which inactivate bacteria and other contaminants. Despite an extensive research of cavitation, the exact mode of action on bacteria is not known. In doctoral dissertation we compare the effect of hydrodynamic and acoustic cavitation on lipid vesicles, spheroplasts and bacterial cells to the effect of various physio-chemical and mechanical stressors. Further, we evaluate the contribution of the individual cell wall layers on the resistance to cavitation. We show that peptidoglycan layer has the most important effect on cavitation resistance. For fundamental understanding of cavitation, we downscaled the cavitation phenomena to a single micrometer sized cavitation bubble and individual bacterial cell by developing a new method that delivers nanoscale spatial and temporal energy quantum to mechanically remove and destroy individual bacterial cells. The cavitation microbubble had an effect on bacterial cell when it was in proximity of the bubble. Numerical simulations enabled calculation of microbubble evolution and mechanical loads on bacterial cells and allow estimation of threshold values for wall shear stress and hydrodynamic force required for bacterial detachment and destruction. The new results will enable progress and development of cavitation technology towards more efficient and chemical free processes of water treatment. IV Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 KAZALO VSEBINE KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA (KDI) III KEY WORDS DOCUMENTATION (KWD) IV KAZALO VSEBINE V KAZALO ZNANSTVENIH DEL VII KAZALO PREGLEDNIC VIII KAZALO SLIK IX KAZALO PRILOG X OKRAJŠAVE IN SIMBOLI XI 1 UVOD 1 1.1 KAVITACIJA 1 1.2 KOLAPS POSAMEZNEGA MEHURČKA 5 1.3 BAKTERIJSKA CELICA 6 1.3.1 Citoplazemska membrana 7 1.3.2 Peptidoglikan 8 1.3.3 Zunanja membrana 8 1.3.4 Kapsula 9 1.4 VPLIV KAVITACIJE NA MIKROORGANIZME 9 1.5 NAMEN IN CILJI DOKTORSKE DISERTACIJE 10 1.6 RAZISKOVALNE HIPOTEZE 12 2 ZNANSTVENA DELA 13 2.1 OBJAVLJENA ZNANSTVENA DELA 13 2.1.1 Učinkovitost uničenja liposomov s hidrodinamsko kavitacijo v primerjavi z ostalimi kemijskimi, fizikalnimi in mehanskimi postopki 13 2.1.2 Študija morfologije gigantskih veziklov v neravnovesnih okoljih z Monte Carlo metodo 47 V Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 2.1.3 Materialne lastnosti celične stene bakterije E. coli določajo odpornost celic na sonolizo 62 2.2 OSTALO POVEZOVALNO ZNANSTVENO DELO 77 2.2.1 Vpliv posameznega kavitacijskega mehurčka na bakterijsko celico 77 2.2.1.1 Uvod 77 2.2.1.2 Materiali in metode 79 2.2.1.3 Rezultati 92 3 RAZPRAVA IN SKLEPI 102 3.1 RAZPRAVA 102 3.1.1 Lipidni dvosloj 102 3.1.2 Bakterija E. coli in celice z oslabljenimi komponentami celične stene 106 3.1.3 Vpliv individualnega kavitacijskega mehurčka na individualno bakterijsko celico 109 3.1.4 Pregled doprinosa kandidata in ostalih sodelavcev v okviru doktorske disertacije 113 3.2 SKLEPI 113 3.2.1 Potrditev hipotez 114 4 POVZETEK (SUMMARY) 115 4.1 POVZETEK 115 4.2 SUMMARY 117 5 VIRI 120 ZAHVALA PRILOGE VI Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 KAZALO ZNANSTVENIH DEL Pandur Ž., Dogsa I., Dular M., Stopar D. 2020. Liposome destruction by hydrodynamic cavitation in comparison to chemical, physical and mechanical treatments. Ultrasonics Sonochemistry, 61: 104826, doi: 10.1016/j.ultsonch.2019.104826: 11 str. ……………………………………….. 13 Drab M., Pandur Ž., Penič S., Iglič A., Kralj-Iglič V., Stopar D. 2021. A Monte Carlo study of giant vesicle morphologies in nonequilibrium environments. Biophysical Journal, 120, 20: 4418-4428……………………………………….. 47 Pandur Ž., Dular M., Kostanjšek R., Stopar D. 2022. Bacterial cell wall material properties determine E. coli resistance to sonolysis. Ultrasonics Sonochemistry, 83: 105919, doi: 10.1016/j.ultsonch.2022.105919: 10 str. …………………… 62 VII Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 KAZALO PREGLEDNIC Preglednica 1: Upoštevani materialni parametri obeh tekočin. .................................... 89 VIII Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 KAZALO SLIK Slika 1: Različni tipi nastanka akustične in hidrodinamske kavitacije (povzeto po Filipić in sod., 2022; Mo in sod., 2012; Šarc in sod., 2018; Kolbl Repinc in sod., 2022; Podbevšek in sod., 2021). ............................................................................................... 4 Slika 2: Shematski prikaz Gram negativne bakterijske celične stene ( E. coli). ........... 11 Slika 3: Shematski prikaz eksperimentalne postavitve.. .............................................. 80 Slika 4: Shematski prikaz interakcije mikromehurčka in bakterijske celice iz različnih perspektiv....................................................................................................... 84 Slika 5: Učinek hidrodinamske in akustične kavitacije na E. coli................................ 77 Slika 6: Potek visokonapetostne razelektritve v tekočini in vpliv zarodnega mikromehurčka ali tlačnih valov na opazovane bakterijske celice. ............................. 94 Slika 7: Kavitacijski mehurček in njegov vpliv na bakterijske celice. ......................... 95 Slika 8: Računski model kavitacije mikromehurčka in določanje strižne napetosti ter hidrodinamske sile ob kavitaciji mikromehurčka. ........................................................ 99 Slika 9: Mehanske obremenitve bakterijske celice pri kolapsu mikromehurčka ....... 101 IX Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 KAZALO PRILOG Priloga A: Objavljen pregledni članek vpliva hidrodinamske kavitacije na mikroorganizme. Priloga B: Objavljen pregledni članek vpliva mehanskih lastnosti posameznih slojev bakterijske celične stene. Priloga C: Dovoljenje založnika Elsevier za vključitev objavljenega raziskovalnega dela v doktorsko disertacijo z naslovom: A Monte Carlo study of giant vesicle morphologies in nonequilibrium environments (Biophysical Journal) . Priloga D: Dovoljenje založnika Elsevier za vključitev objavljenega raziskovalnega dela v doktorsko disertacijo z naslovom: Evolution of mechanical stability from lipid layers to complex bacterial envelope structures (Academic Press). X Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 OKRAJŠAVE IN SIMBOLI CFU kolonijsko število (ang. colony forming units) DMPC 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoholin DOPC 1,2-dioleoil-sn-glicerol-3-fosfoholin DOPG 1,2-dioleoil-sn-glicerol-3-fosfat DNK deoksiribonukleinska kislina EDTA etilendiamintetraocetna kislina (ang. ethylenediaminetetraacetic acid) EPS ekstracelularni polisaharidi (ang. extracellular polymeric substance) Fps slike na sekundo (ang. frames per second) Gfp zeleni fluorescentni protein (ang. green fluorescent protein) IPTG izopropil-β-D-1-tiogalaktopiranozid (ang. Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside) Kn kanamicin LB lizogeno gojišče (ang. lysogeny broth) LPS lipopolisaharid OD650 optična gostota pri 650 nm (ang . optical density at 650 nm) PGA poli-ß-1,6-N-acetil-D-glukozamin (ang. poly-ß-1,6-N-acetyl-D-glucosamine) PI propidijev jodid (ang. propidium iodide) PLL poli-L-lizin ROS reaktivne kisikove zvrsti (ang. reactive oxygen species) rpm obrati na minuto (ang. revolutions per minute) XI Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 1 UVOD Voda je ena izmed najpomembnejših molekul za obstoj življenja na Zemlji (Maher in Stevenson, 1988). Poleg tega igra voda zelo pomembno vlogo pri svetovni ekonomiji kot dobrina, ki omogoča obstoj in razvoj družbe. Okoljski vodni viri predstavljajo primerno okolje za obstoj in medij za prenos potencialno patogenih mikroorganizmov za človeka, živali in rastline (Gibson, 2014). Odpadne vode lahko vsebujejo patogene mikroorganizme, kot so bakterije (na primer iz rodov Vibrio, Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, Pseudomonas) (Spiteri in sod., 2017) in enterične viruse (npr. norovirusi in kalicivirusi) (Chrysikopoulos in sod., 2013), ki lahko povzročijo resne okužbe ob stiku ali z zaužitjem onesnažene vode. Porajajoči se patogeni mikroorganizmi, virusi in druge nevarne snovi, kot so toksini v vodnih sistemih, postajajo vse večji problem (Chrysikopoulos in sod., 2013; Joyce in sod., 2010; Spiteri in sod., 2017). Razpoložljivost neoporečne pitne vode je vse večja skrb v globaliziranem svetu, tako v razvitih državah kot v državah v razvoju. Zaradi vse večjega onesnaževanja postajajo svetovne zaloge čiste vode resno ogrožene in za številne države je čista ter neoporečna voda postala luksuzna dobrina, ki ni več samoumevna. Zato postaja recikliranje odpadne vode in zagotavljanje neoporečnih virov pitne vode vse bolj pomembna panoga. Da bi zagotovili varno uporabo pitne vode, je dezinfekcija nujen korak v shemi čiščenja vode. Trenutne uporabljene metode za čiščenje odpadnih voda temeljijo na kemijskih ali fizikalnih postopkih. Dezinfekcija vode vključuje postopke, kot so kloriranje, ozoniranje in UV obsevanje. Te metode so do določene mere učinkovite, vendar imajo tudi pomanjkljivosti. UV-obsevanje povzroči reverzibilno poškodbo bakterijske DNK (Drakopoulou in sod., 2009) in ni zelo učinkovito, če so mikroorganizmi združeni v skupke - flokule (Ohrdes in sod., 2018). Ozonacija je učinkovit, a finančno drag proces, kjer lahko nastanejo strupeni in škodljivi stranski produkti (Gao in sod., 2016; Gogoi in sod., 2018; Schlütter-Vorberg in sod., 2015). Kemične metode dezinfekcije, kot je kloriranje, lahko povzročijo nastanek škodljivih stranskih produktov (Zou in Wang, 2017) in lahko povzročijo sekundarno onesnaženje (Rajasekhar in sod., 2012). Termični šok je najpogosteje uporabljena metoda, ki pa je energetsko zelo potratna. Zato se je v zadnjem desetletju povečalo raziskovanje alternativnih metod in postopkov čiščenja odpadne vode, ki bi lahko izboljšale in zamenjale obstoječe postopke obdelave vode. Ena izmed obetavnih novih metod je hidrodinamska kavitacija, ki je v primerjavi s termičnimi šoki do 30-krat bolj energijsko učinkovita pri čiščenju vode (Šarc in sod., 2014). 1.1 KAVITACIJA Kavitacija je pojav parnih mehurčkov v tekočini. Je hiter pojav, ki nastane zaradi lokalnega znižanja tlaka v tekočini, kar privede do nastanka majhnih mehurčkov (Franc in Michel, 2004). Po dvigu tlaka v tekočini na začetno stanje, se parni mehurček 1 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 agresivno sesede (implodira) (Young, 1989). Pri kavitaciji lahko pride do pojava lokalnih ekstremnih razmer, kot je visoka temperatura (več kot 1000 K), nastanka mikrocurkov s hitrostmi preko 100 m/s, nastanka tlačnih valov (več kot 100 MPa) in nastanka reaktivnih radikalskih zvrsti (Brennen, 1995; Chahine in Hsiao, 2015; Koda in sod., 2003; Suslick in sod., 2011). Glede na način nastanka kavitacijskih mehurčkov lahko kavitacijo razdelimo na: akustično kavitacijo, hidrodinamsko kavitacijo, optično kavitacijo ter kavitacijo delcev. Najpogostejša tipa kavitacije sta akustična in hidrodinamska kavitacija. Razlika med omenjenima tipoma je kako pridemo do znižanja tlaka v tekočini: pri akustični kavitaciji (sonikacija) nastajajo zgoščenine in razredčine kapljevine zaradi prenašanja zvočnih valov skozi kapljevino, medtem ko pri hidrodinamski kavitaciji pride do lokalnega znižanja tlaka zaradi pospešitve toka tekočine (Širok in sod., 2006). Pri optični kavitaciji pride do optičnega preboja v vodi s kratkim, fokusiranim in visoko energijskim laserskim žarkom, kjer nastane plazma, uparjanje tekočine in posledično kavitacijski mehurček. Pri kavitaciji delcev pride do absorpcije energije elementarnih delcev, npr. absorpcija protonskega žarka v živem srebru kar povzroči nastanek kavitacijskega mehurčka (Young, 1989). Akustično valovanje vzbujamo s piezoelektričnim pretvornikom, ki pretvori visoko frekvenčno električno energijo v mehansko vibracijo, kar povzroči nastanek zgoščenin in redčin v kapljevini. Tako generirani akustični valovi imajo lahko frekvenco nihanja v razponu od kHz do MHz. Najbolj pogosta tipa ultrazvočnih naprav za generiranje akustične kavitacije sta ultrazvočna sonda in ultrazvočna kad (Slika 1). Pri ultrazvočni sondi je vir akustičnih valov radialna sonda, ki ima v večini primerov premer konice do nekaj centimetrov. Pri sondi se kavitacijski oblak ustvari pod konico sonde, kjer konica niha z določeno frekvenco in amplitudo. Akustična energija se prenaša preko majhne površine konice sonde, zato sonde proizvajajo visoko intenziteto kavitacije. Zaradi fokusirane kavitacije v bližini sonde je potrebno pri večjih volumnih pri tem tipu naprave zagotoviti učinkovito mešanje po celotnem volumnu tekočine. Drugi najpogostejši tip je ultrazvočna kad kjer so piezoelektrični pretvorniki postavljeni na dno kadi. Akustični valovi se prenašajo po celotnem volumnu tekočine, ki je v kadi. Zaradi večje površine piezoelektričnega pretvornika je takšen tip kavitacije nizko intenziven. V večini primerov prihaja do oscilacije mehurčkov zaradi akustičnega valovanja in ne do agresivnih kolapsov mehurčkov. Oscilirajoči mehurčki lahko ob površinah ustvarijo visok strig. Takšen tip kavitacije imenujemo stabilna kavitacija, medtem ko agresivno implozijo mehurčka imenujemo nestabilna kavitacija. Pri soniciranju se lahko uporablja kontinuirni način delovanja ali pa uporaba delovnih ciklov, kjer je soniciranje v krajših časovnih intervalih prekinjeno. S tem zmanjšamo vpliv segrevanja vzorca med samim soniciranjem. Pri uporabi akustične kavitacije se največkrat uporablja šaržni način tretiranja, kjer istočasno obdelujemo celoten volumen. Zato je akustična kavitacija primerna za obdelavo relativno majhnega volumna tekočine – na primer v mililitrskem volumskem območju. Zaradi tega je nadgradnja sistema, ki 2 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 bi lahko bila primerna za velike volumne v industrijskih merilih otežena. Naprave za akustično kavitacijo se pojavljajo skoraj v vsakem raziskovalnem laboratoriju za namene čiščenja površin, mešanja tekočin, priprave emulzij, razplinjenja tekočin, procesiranja živil, uporabe v medicinske namene, obdelave mineralov, uničenja celic in ekstrakcije celičnih komponent ter produkcije majhnih unilamelarnih veziklov (Annegowda in sod., 2012; Canselier in sod., 2002; Eskin in sod., 2015; Peshkovsky in sod., 2013; Saranya in sod., 2014; Zupanc in sod., 2019). Hidrodinamska kavitacija nastane zaradi sprememb v geometriji toka, običajno ob prehodu tekočine skozi zožitev ali zaradi ovire v toku. S tem se toku poveča hitrost in posledično zmanjša tlak. Ob zadostnem padcu tlaka se pojavi kavitacija. Dinamika hidrodinamske kavitacije je odvisna od karakteristike toka tekočine in geometrije obtekanega objekta oziroma zožitve (Širok in sod., 2006). Ob nastanku mehurčka je večina energije shranjena v okoliški tekočini katera se sprosti ob povratku tlaka v začetno stanje. Na intenzivnost kolapsa vpliva tlačni gradient, ki vpliva na dinamiko poteka dogodka. Hidrodinamsko kavitacijo lahko razdelimo na tri tipe: 1. pritrjena kavitacija, 2. nestabilna (ang. »cloud shedding«) kavitacija in 3. superkavitacija. Pri pritrjeni kavitaciji so mehurčki skupaj in so pritrjeni na vodilno stran zožitve, kar lahko vidimo kot stabilen pritrjen kavitacijski oblak. V primeru, da se tok tekočine poveča oziroma se tlak pred zožitvijo poviša, postane kavitacijski oblak nestabilen in se prične deloma ali v celoti trgati (nestabilna kavitacija). Če se pretok ali tlak še dodatno povečata, se pričnejo posamezni mehurčki združevati v stabilen velik parni oblak. Tak pojav imenujemo superkavitacija. Najbolj pogosti tipi hidrodinamsko kavitacijskih naprav so: potisne postaje z zožitvami (ang. »blow through«), črpalke z zožitvami ter naprave z rotor-statorjem (prilagojene lopatice na črpalki) (Zupanc in sod., 2019). Največkrat uporabljen sistem je kombinacija črpalke in zožitve, kjer pa lahko pride do pojava kavitacije tudi v sami črpalki. Zato sistemi s črpalko niso najbolj primerni za karakterizacijo vpliva kavitacije na biološke delce. Pri napravah kjer uporabljamo stisnjen zrak za potisk tekočine skozi zožitev (potisne naprave) se izognemo omenjenemu problemu vendar zahteva večje obdelovane volumne. Pri sistemih z zožitvami je največkrat uporabljena Venturijeva zožitev ali majhna okrogla zaslonka (ang. »orifice«). Pri rotor-stator tipu je geometrija izboklin razporejena po obodni površini rotorja ali v kombinaciji na rotorju in statorju, kjer je postavitev lahko simetrična ali asimetrična (Kolbl Repinc in sod., 2022). Shematski prikaz obeh tipov kavitacij skupaj z napravami je prikazano v sliki 1. Prednost hidrodinamske kavitacije je enostavno večanje velikostne skale naprave na industrijski nivo, medtem ko zmanjšanje delovnega volumna naprav na laboratorijski nivo (delovni volumen naprave v mililitrskem rangu) predstavlja precejšen izziv (Zupanc in sod., 2019). 3 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Slika 1: Različni tipi nastanka akustične in hidrodinamske kavitacije. Akustična kavitacija (a in b) ter hidrodinamska kavitacija (c). Ultrazvočna sonda (a) pretvarja električno energijo v mehanske vibracije na konici sonde, kjer se pojavi kavitacijski oblak. Pri ultrazvočni banjici (b) so piezoelektrični pretvorniki postavljeni na dno banjice in ultrazvočni valovi potujejo po celotnem volumnu kapljevine. Pri tem primeru velikokrat pride do stabilne kavitacije kjer mehurčki samo oscilirajo zaradi ultrazvočnega valovanja. Pri hidrodinamski kavitaciji (c) so največkrat uporabljene črpalke in zožitve (levo zgoraj), za potisk tekočine se lahko uporablja tudi stisnjen zrak (blow through), lahko pa se prilagodi obliko lopatice črpalke (rotor-stator črpalka). Pri hidrodinamski kavitaciji lahko opazimo tri tipe kavitacije (levo spodaj): pritrjena, nestabilna kavitacija in superkavitacija. (slike povzete po Filipić in sod., 2022; Mo in sod., 2012; Šarc in sod., 2018; Kolbl Repinc in sod., 2022; Podbevšek in sod., 2021). 4 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 1.2 KOLAPS POSAMEZNEGA MEHURČKA Kolaps posameznega mehurčka na milimetrski velikostni skali je dobro opisan pojav. Za nastanek posameznega milimetrskega kavitacijskega mehurčka se velikokrat uporablja optično kavitacijo, kjer z laserjem vnesemo v kapljevino v zelo kratkem času veliko količino energije (nanosekundni laserski pulz), pri čemer pride do nastanka nestabilnega parnega mehurčka, kar posledično privede do kavitacijskega kolapsa mehurčka. Z lasersko generiranim mehurčkom je možno generirati kavitacijske mehurčke z maksimalnim radijem od nekaj deset µm in vse do milimetrskega velikostnega ranga. Sama dinamika mehurčka je odvisna od okolice kjer se mehurček nahaja - v primeru kjer je v okolici mehurčka kapljevina pride do sferičnega kolapsa mehurčka. Kolaps kavitacijskega mehurčka v bližini trdne površine privede do nastanka curka ob imploziji mehurčka. V primeru trdne površine nastane osno simetričen curek, ki je usmerjen proti trdni površini. Oblika kolapsa mehurčka je pogojena z razmerjem oddaljenosti centra mehurčka od stene (𝑑b) in maksimalnega radija mehurčka 𝑅r,max) ( 𝑑 𝛾 = b ), kjer je kritično razmerje za nastanek curka ob trdi steni γ = 2 (Dular in sod., 𝑅r,max 2019). Na splošno je dinamika kolapsa mehurčka odvisna od različnih faktorjev kot so geometrija mejne plasti, materialne in strukturne lastnosti mejne plasti, prisotnosti striga, tlačnih valov, gravitacijskega polja ali prisotnosti in vpliva drugih mehurčkov (Reuter in Ohl, 2021). Mikrometrski kavitacijski mehurčki so posebej pomembni za delovanje na bakterijske celice, saj so istega velikostnega reda kot bakterijske celice. Delovanje mikrometrskih kavitacijskih mehurčkov na bakterijske celice je slabo proučeno in je predmet raziskovanja v tej doktorski disertaciji. Interakcija posameznega mehurčka z mikrometrsko velikim delcem se lahko dogaja na treh velikostnih skalah: ko je mehurček znatno večji od delca (mm velikost), mehurček primerljiv velikosti delca (µm velikost) in mehurček manjši od delca (nm velikost). Pri znatno večjem mehurčku od delca sam delec naj ne bi direktno vplival na potek kolapsa mehurčka, kar nakazujejo raziskave kolapsa milimetrskega mehurčka s sedimentom (Teran in sod., 2018). Po drugi strani se pri manjših (nanometrskih) mehurčkih pričakuje, da niso relevantni za tak primer saj so izredno stabilni pri tlačnih oscilacijah (Franc in Michel, 2004). Interakcije posameznega mehurčka na milimetrski velikostni skali je opisal Borkent in sod. (2008), kjer so pokazali, da kolaps mehurčka v bližini nepritrjenega delca le tega potisne stran od mehurčka. Pri milimetrskem kolapsu mehurčka površinska napetost in viskoznost ne vplivata znatno na dinamiko kolapsa. Raziskav mikrometrskih mehurčkov do nedavnega ni bilo. Preliminarne raziskave na manjših mehurčkih (v mikrometrskem velikostnem rangu) pa kažejo, da površinska napetost in viskoznost lahko vplivajo na dinamiko kolapsa mehurčka, kar bi lahko vplivalo na izid poteka kavitacije mikrometrskega mehurčka (mikromehurčka) (Zevnik in Dular, 2022). 5 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 1.3 BAKTERIJSKA CELICA Notranjost bakterijske celice predstavlja visoko regulirano okolje za razliko od okolice kjer so prisotna znatna nihanja. Za preživetje celic v takšnem nepredvidljivem okolju so bakterijske celice razvile vrsto različnih plasti v celični steni, katere jim skupaj omogočijo preživetje stresnih razmer (npr. mehanski stres, povišana temperatura, kislo okolje, odpornost na izsuševanje). Posamezna struktura v celični steni ima specifično funkcionalnost, ki pripomore h končni odpornosti celice na različne okoljske dejavnike (Madigan in sod., 2008). Ena izmed pogostih definicij celične smrti je porušitev integritete celične stene, kar povzroči izpust celične vsebine v okolico – pride do t.i. lize celic (Gregori in sod., 2001). Zato veliko metod bakterijske inaktivacije (npr. mehanske metode, določeni antibiotiki) temeljijo na porušitvi integritete celične stene kar privede do ireverzibilne lize celic. Po sestavi celične stene lahko ločimo bakterije v dve skupini: Gram negativne in Gram pozitivne. Barvanje po Gramu je klasificiranje bakterij na podlagi diferencialnega barvanja glede na različno sestavo celične skupine. Gram negativne celice imajo citoplazemsko membrano, ki je povezana preko tankega peptidoglikanskega sloja z asimetrično zunanjo lipopolisaharidno membrano. Lipopolisharidna membrana ima na notranji strani fosfolipidni sloj, medtem ko so na zunanjem sloju lipopolisaharidne molekule. Gram pozitivne bakterije imajo citoplazemsko membrano in debel peptidoglikanski sloj, ki služi kot mehanska in kemijska opora citoplazemski membrani (Madigan in sod., 2008). Poleg osnovnih plasti celične stene imajo lahko bakterijske celice še dodatne plasti kot so S-sloji, kapsularni sloj, eksopolisaharidni sloj (EPS), in plašč (Beveridge, 1981; Beveridge in Graham, 1991; Madigan in sod., 2008; Sleytr in Messner, 2009). Escherichia coli, ki smo jo uporabljali v tej doktorski disertaciji je Gram negativna paličasta bakterija, ki je del mikrobiote prebavnega trakta živali in človeka. Nekateri sevi so patogeni za človeka (Madigan in sod., 2008). E. coli je modelni predstavnik Gram negativnih bakterij in je dobro preučen organizem. Zaradi hitre rasti, enostavnosti rokovanja se bakterija uporablja pri genskem inženiringu, produkciji farmacevtskih učinkovin ter drugih biotehnoloških panogah (Blount, 2015). Bakterija lahko raste v pH območju med 4,5 in 9, med 8 in 45 °C ter tlakom 1 - 400 atm (Ivančič in sod., 2013; Kumar in Libchaber, 2013; Wilks in Slonczewski, 2007). V nadaljevanju so predstavljene štiri ključne plasti Gram negativne bakterijske celične stene in njihove fizikalno-kemijske lastnosti, ki so lahko potencialna tarčna mesta za delovanje kavitacijskih mehurčkov. 6 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 1.3.1 Citoplazemska membrana Citoplazemska membrana je sestavljena iz lipidnega dvosloja. Lipidni dvosloji so izgrajeni iz amfifilnih molekul v vodnem okolju, kjer so polarne glave orientirane v vodno okolje, medtem ko so nepolarni repi maščobnih kislin orientirani v notranjosti strukture (Bangham in Horne, 1964). Glavna naloga lipidnega dvosloja v bioloških sistemih je selektivno ločevanje notranjosti celice od okolice. S tem lahko celica ohrani svojo entiteto, omogočen je selektivni transport hranil v celico ter odvečnih presnovkov iz celice (Tien in Ottova, 2003). Molekule so v lipidnem dvosloju šibko nekovalentno povezane med seboj. Struktura lipidnega dvosloja je poznana kot tekoči kristal, kjer ves čas prihaja do reorganizacije molekul kot so rotacijske in konformacijske spremembe, lateralna difuzija in spremembe oblike dvosloja (Nickels in sod., 2015; Pucadyil in sod., 2007; Singer in Nicholson, 1972). Bakterija E. coli ima več kot sto različnih posfolipidnih molekul v svoji membrani (Jeucken in sod., 2019). Različne fosfolipidne molekule pripomorejo k asimetriji slojev kar pripomore k stabilnosti citoplazemske membrane v primerjavi s simetričnim dvoslojem (Lu in sod., 2016). Najenostavnejši model citoplazemske membrane so fosfolipidni vezikli, sferične strukture, obdane s fosfolipidnim dvoslojem, ki razmejuje notranjost vezikla od tekočine v okolici (Locascio in sod., 2004). V povprečju je debelina lipidnega dvosloja 4 nm (Pandit in Klauda, 2012). Lipidni vezikli so široko uporabni v raziskovalne in industrijske namene. Na primer v medicini se uporabljajo za tarčno dostavljanje zdravilnih učinkovin ali kot kontrastni agens pri ultrazvoku (Shashi in sod., 2012). Priprava lipidnih veziklov lahko poteka na različne načine kar omogoča pripravo veziklov v nanometrskem ali mikrometrskem velikostnem rangu. Vezikli v mikrometrskem velikostnem rangu predstavljajo dober modelni nadomestek bakterijski celici. Zaradi samo-orientiranja lipidnih molekul v polarnem topilu je dvosloj fluidna dinamična struktura kjer prihaja do neprestane reorganizacije lipidov v dvosloju kjer se lahko lipidi premeščajo znotraj posameznega sloja ali pa pride do premeščanja med zunanjim in notranjim slojem v dvosloju (Almeida in Vaz, 1995; Heerklotz in Epand, 2001). Privlak med molekulami v dvosloju je posledica elektrostatskih interakcij med polarnimi glavami in van der Waals povezavami med sosednimi nepolarnimi repi, zato je lipidni dvosloj krhka in izredno podajna struktura (Auer in Weibel, 2017) in posledično občutljiv na različne spremembe v osmolarnosti, dodatku amfifilnih molekul, pH, temperature, ionske jakosti, itd. (Böckmann in sod., 2003; Böckmann in Grubmüller, 2004; Claessens in sod., 2004; Goertz in sod., 2011; Kato in sod., 2015; Kodama in sod., 2018; Koerner in sod., 2011; Sułkowski in sod., 2005). Vstavljanje amfifilnih molekul v dvosloj povzroči znatne oscilacije in motnje v dvosloju, ki lahko privede do razpada dvosloja. Mehanističen vpogled v dinamiko oscilacij dvosloja omogoča lažje razumevanje vloge in stabilnosti lipidnega dvosloja pri izpostavitvi le-tega zunanjim stresorjem. Zaradi fluidne narave lipidnega dvosloja pričakujemo, ob 7 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 zadostnem vložku energije, nastanek por v membrani ali uvihanja membrane, kar lahko povzroči ireverzibilne poškodbe v dvosloju in vezikel lahko posledično razpade (Bavi in sod., 2014). 1.3.2 Peptidoglikan Pri bakterijah večinsko ne najdemo samo lipidnega dvosloja, ampak je zaradi turgorskega tlaka potrebna dodatna struktura, ki izboljša mehansko trdnost in pripomore k obliki bakterije – peptidoglikan (Jauffred in sod. 2007). Peptidoglikan je polimerna struktura, sestavljena iz N-acetilglukozamina in N-acetilmuraminske kisline, ki sta med seboj povezana z ß-1,4 glikozidno vezjo v glikanske verige, ki se medsebojno povezujejo preko peptidnih enot (Vollmer, 2007). Delež navzkrižnih povezav v peptidoglikanu lahko variira od 20 % pri E. coli pa preko 90 % na primer pri Staphylococcus aureus (Rogers in sod., 1980). Skozi evolucijo so se bakterije ločile na dve skupini glede debeline celične stene, ki jih lahko ločimo z barvanjem po Gramu (Hiremath in Banigidad, 2011). Pri po Gramu negativnih bakterijah je peptidoglikanski sloj tanek, vsebuje 1-3 plasti in je debeline 1,5-15 nm (Vollmer in sod., 2008; Yao in sod., 1999), npr. pri E. coli v debelini med 2,5 in 6,4 nm (Gumbart in sod. 2014). Pri po Gramu pozitivnih bakterijah pa je prisoten večplastni peptidoglikanski sloj, ki lahko meri v debelino 30-100 nm (Silhavy in sod., 2010). Zaradi večje debeline peptidoglikanskega ovoja lahko Gram pozitivne bakterije prenesejo višji turgorski tlak (Gumbart in sod. 2014; Vollmer, 2008). Za voljo mehanske vloge je peptidoglikan velikokrat tarčno mesto encimov in antibiotikov za lizo bakterijskih celic (Uehara in Bernhardt, 2011; Sarhar in sod., 2017). Peptidoglikan je viskoelastičen material, ki omogoča reverzibilno raztezanje pod vplivom turgorskega tlaka, kar daje celici obliko. V normalnem stanju celice je peptidoglikan natezno obremenjen zaradi turgorskega tlaka. Npr. pri E. coli se v primeru razgradnje citoplazemske membrane površina bakterije zmanjša za 45 % zaradi relaksacije peptidoglikana. V primeru sferičnih celic je turgorski tlak izotropen, medtem ko je pri paličastih celicah različen v vzdolžni in prečni osi bakterijske celice (Koch in sod., 1987). Peptidoglikan je bolj podajen v vzdolžni (daljši) osi (elastičen modul 2,5 x 107 Nm-2) kakor v prečni smeri celice (elastičen modul 4,5 x 107 Nm-2) (Yao in sod., 1999). Skladno s tem se pri osmotskem šoku dolžina celice E. coli znatno spremeni, medtem ko se premer celice ne spremeni bistveno (van den Bogaart in sod., 2007). 1.3.3 Zunanja membrana Zunanja membrana je prisotna pri po Gramu negativnih bakterijah. Funkcija zunanje membrane je dodatna transportna bariera za molekule. Gre za izrazito nesimetrično membrano, kjer je notranja plast membrane sestavljena iz fosfolipidov, medtem ko je zunanja plast sestavljena iz lipopolisaharidov (LPS). LPS molekule so sestavljene iz 8 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 treh delov: Lipid A, negativno nabitega polisaharidnega jedra in O-antigena. Za viabilnost celice sta potrebna intakten lipid A in polisaharidno jedro (Erridge in sod., 2002). Zunanja membrana je povezana s peptidoglikanskim slojem preko Braunovega lipoporoteina (LPP) in Pal lipoporoteina (Braun in Rehn, 1969; Braun in Sieglin, 1970; Godlewska in sod. 2009). Negativni naboj LPS je nevtraliziran s Ca2+ ali Mg2+, ki preko divalentnih mostičkov stabilizirajo zunanjo membrano (Auer in Weibel, 2017). Uporaba kelatorja (npr. EDTA) lahko privede do delne odstranitve (približno 40-50 %) LPS molekul iz membrane, kar destabilizira zunanjo membrano in s tem zelo oslabi kemijsko in mehansko strukturo bakterije (Amro in sod., 2000). 1.3.4 Kapsula Dodatna struktura, ki lahko okrepi bakterijsko steno je kapsula (Araújo in sod., 2019). Debelina kapsule lahko meri v debelino do nekaj µm in služi za lažjo vezavo na površino ali medsebojno povezavo med celicami. Obenem služi kot dodatna fizična pregrada za prehod snovi do celice – na primer otežen dostop antibiotikov do celic (Bayer in Thurow, 1977; Costerton in sod., 1981; Roberts, 1996). Kapsula je sestavljena iz verige polisaharidov z visoko molekulsko maso, ki so kovalentno in nekovalentno povezani z zunanjo membrano (Beveridge in Graham, 1991). Pri celicah E. coli so štiri glavne kapsularne komponente: poli-ß-1,6-N-acetil-D-glukozamin (PGA), kodrasti proteini, kolanska kislina in bakterijska celuloza ali celulozni derivati (Wang in sod. 2004; Itoh in sod., 2005; Itoh in sod., 2008; Smith in sod., 2017; Danese in sod., 2000; Thongsomboon in sod. 2018). Horvat in sod. (2019) so okarakterizirali vpliv kapsularnih komponent na mehanske lastnosti biofilma E. coli in pokazali na spremenjene mehanske lastnosti mutant, ki imajo okvarjene gene za produkcijo zunajceličnih komponent. 1.4 VPLIV KAVITACIJE NA MIKROORGANIZME Do nedavnega je bila kavitacija poznana zgolj kot negativen pojav, ki zmanjšuje življenjsko dobo vodnih turbin zaradi erozije materiala, povzroča hrup ter zmanjšanje učinkovitosti naprav (Franc in Michel, 2004). Zaradi ekstremnih lokalnih razmer v okolici kolapsa kavitacijskega mehurčka in destruktivnega učinka na npr. trden material, bi lahko imeli kavitacijski mehurčki vpliv tudi na biološke delce, na primer mikroorganizme. Pretekle raziskave kažejo na obetavne rezultate inaktivacije različnih mikroorganizmov, na primer Azuma in sod. (2007) so dosegli popolno uničenje bakterije Escherichia coli s kavitacijskim curkom, primerljiv rezultat so dobili tudi Cerecedo in sod. (2018) pri uporabi kavitacijske črpalke. Hunter in sod. (2008) so z akustično kavitacijo dosegli 99 % inaktivacijo bakterije E. coli. Vseeno se rezultati raziskav lahko znatno razlikujejo glede na izbrani mikroorganizem, testirane pogoje, tip kavitacije in uporabljene naprave. Kljub splošni uporabi kavitacije v mikrobiologiji se 9 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 še vedno smatra kavitacija kot »fenomen črne škatle« kjer ni popolnoma jasno kaj se dogaja v procesu kavitacije z mikroorganizmi. Večina raziskovalcev pripisuje inaktivacijo bakterij mehanskemu vzroku – propad celic zaradi mehanskih poškodb celične stene. Nekateri pripisujejo inaktivacijo kemijskim vzrokom, kot so reaktivne kisikove zvrsti (ROS), vendar pa podroben mehanizem delovanja ni poznan (Zupanc in sod., 2019), kar predstavlja glavno težavo pri širši uporabi kavitacije za uničenje bakterijskih celic. Bakterijske celice so izjemno odporne na različne okoljske dejavnike (Griffiths in Philippot, 2013). Razlog je v tem, da je bakterijska celica multikompozitni material, sestavljen iz večjega števila slojev z različnimi kemijskimi, biokemijskimi in biofizikalnimi lastnostmi. Trenutno ne poznamo kako kavitacija deluje na posamezne plasti bakterijske površine (npr. na lipidni dvosloj, peptidoglikan, zunanjo membrano) in kako ruši njihovo integriteto. Podobno slabo poznamo zaradi katerega fizikalno - kemijskega vpliva (npr. strižna sila, tlačne spremembe, temperatura, prosti radikali) je kavitacija pri bakterijah učinkovita in kako učinkovita je v primerjavi z ostalimi stresnimi dejavniki, ki vplivajo na stabilnost bakterijske celice. 1.5 NAMEN IN CILJI DOKTORSKE DISERTACIJE V doktorski disertaciji smo s selektivnim pristopom preverili kako posamezne strukture oziroma kombinacije plasti bakterijske celične stene vplivajo na stabilnost celic pri kavitaciji. Kot najosnovnejši model celične membrane smo uporabili fosfolipidni vezikel, ki je imel fluorescentno označen lumen kar nam je omogočilo zajem konfokalnih fluorescentnih mikroskopskih slik in njihovo karakterizacijo pred in po tretiranju s kavitacijo in ostalimi fizikalno-kemijskimi stresorji. Natančen mehanizem razpada lipidnega dvosloja pri kavitaciji še ni bil dokazan. Predvidevamo, da pri kolapsu mehurčkov prihaja do tlačnih valov in ostalih mehanskih obremenitev, ki povzročijo nastanek por v dvosloju, kar povzroči puščanje iz notranjega lumna v okolico. Pore so prisotne v času tlačnih valov, vendar takoj, ko se zaključi valovanje se pore zaradi samocelilnih lastnosti fosfolipidnih dvoslojev zacelijo (Lin in Thomas, 2004; Marmottant in sod., 2008; Pong in sod., 2006; Schroeder in sod., 2007). Če pore zrastejo preko kritične velikosti pride do razpada dvosloja (Marmottant in sod., 2008, Small in sod., 2012). Soniciranje se že dolgo uporablja kot metoda pri pripravi majhnih unilamelarnih veziklov (Saunders in sod., 1962; Schroeder in sod., 2009). Vpliv hidrodinamske kavitacije na lipidni dvosloj še ni bil raziskan. Modelni bakterijski sistem je bila bakterija Escherichia coli MG1655 DE3. Bakterija je mutanta divjega tipa E. coli K12, ki ima vstavljen gen za zeleni fluorescenčni protein (gfp), ki je pod regulacijo inducibilnega promotorja izopropil β-D-1-tiogalaktopiranozid (IPTG) in kanamicinskim selekcijskim markerjem. Bakteriji E. coli smo ošibili površinske strukture celične stene z uporabo reagentov (npr. cefaleksin, EDTA, lizocim). Balasundaram in Harrison (2006) sta predlagala, da kavitacija najprej 10 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 poškoduje zunanjo plast celice in nato postoma skozi več ciklov pride do poškodb notranje membrane in celične lize. S spreminjanjem lastnosti zunanje membrane preko EDTA kelatorja smo preverili vpliv zunanje membrane, saj je zunanja membrana v kombinaciji s peptidoglikanom znana kot glavni element za prenašanje turgorskega tlaka (Rojas in sod., 2018). Najbolj znan element, ki daje mehansko odpornost bakteriji je peptidoglikanski sloj. Peptidoglikanski sloj smo spremenili na dva načina – z encimom lizocim, ki hidrolizira glikozidne vezi (Ellison in Giehl, 1991) ali z antibiotikom cefaleksin, ki onemogoči navzkrižno povezovanje peptidnih verig kar povzroči nastanek filamentoznih celic (Sun in sod., 2014). V primeru sočasne uporabe EDTA, lizocima in cefaleksina dobimo gigantske sferoplaste, ki imajo intaktno samo citoplazemsko membrano, medtem ko sta peptidoglikan in zunanja membrana večinsko odstranjena. Zaradi izgube peptidoglikanskega sloja takšne celice postanejo sferične oblike (Kikuchi in sod., 2015). Shematski prikaz spreminjanja komponent celične stene je prikazan na Slika 2. Primerjali smo tudi vpliv zunajceličnih komponent z uporabo mutante, ki ima okvarjene gene za sintezo kodrov (ang. curli), kolanske kisline in polisaharida zunanje ovojnice (poli-β-1,6-GlcNAc – PGA). Slika 2: Shematski prikaz Gram negativne bakterijske celične stene ( E. coli). Leva slika predstavlja poenostavljeno shemo plasti celične stene, kjer je na notranji strani celice citoplazemska membrana, kateri sledi tanek peptidoglikanski sloj. Na zunanji strani sta zunanja membrana in EPS sloj. Desna slika prikazuje poenostavljeno molekularno shemo omenjenih slojev v celični steni. Prikazana so tudi mesta, kjer je prišlo do sprememb celične stene v doktorski disertaciji – genetska mutanta Δeps ne izraža treh glavnih komponent EPS sloja (kolanske kisline, kodrov in PGA); dodatek kelatorja EDTA povzroči odstranjevanje LPS molekul in posledično reorganizacijo zunanje membrane; modifikacija peptidoglikanskega sloja je bila opravljena z encimom lizocim ter ß-laktamskim antibiotikom cefaleksin. Za natančnejše razumevanje vpliva kavitacije na biološke celice je potrebno raziskati interakcijo pojava na mikroskopskem nivoju – torej na nivoju posameznega mehurčka in posamezne mikrobne celice. Nekaj raziskav je bilo narejenih z evkariontskimi celicami, kjer so pokazali, da pride do prepuščanja in lize celic, kjer predlagajo kot možen vzrok poškodb nastanek mikrocurkov (Gac in sod., 2007; Li in sod., 2013; Rau in sod., 2006; Zhou in sod., 2012). Interakcija posameznega mehurčka z bakterijskimi 11 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 celicami tudi še ni bila opisana. Najbližje so bili Tandiono in sod. (2012) kjer so v mikrofluidnem sistemu akustično vzbudili naključne kavitacijske mehurčke v bližini bakterijske kulture kjer so opazili učinkovito lizo bakterijskih celic E. coli pri izpostavljenosti akustični kavitaciji v času 0,4 s. Za raziskovanje vpliva posameznega kavitacijskega mehurčka je ključen razvoj metode za ustvarjanje posameznega mikrometrskega kavitacijskega mehurčka v bližini bakterijske celice, kar smo razvili v tej doktorski nalogi. 1.6 RAZISKOVALNE HIPOTEZE Raziskovalni hipotezi v doktorski disertaciji sta: 1: Gruča hidrodinamsko generiranih kavitacijskih mehurčkov v primerjavi z običajnimi fizikalno-kemijskimi stresorji učinkovito lizira fosfolipidne vezikle, sferoplaste in bakterijske celice. 2: Z implozijo posameznega kavitacijskega mehurčka v bližini bakterijske celice pride do porušenja membranske integritete, kar omogoča lizo bakterijske celice. 12 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 2 ZNANSTVENA DELA 2.1 OBJAVLJENA ZNANSTVENA DELA 2.1.1 Učinkovitost uničenja liposomov s hidrodinamsko kavitacijo v primerjavi z ostalimi kemijskimi, fizikalnimi in mehanskimi postopki Pandur Ž., Dogsa I., Dular M., Stopar D. 2020. Liposome destruction by hydrodynamic cavitation in comparison to chemical, physical and mechanical treatments. Ultrasonics Sonochemistry, 61: 104826, doi: 10.1016/j.ultsonch.2019.104826: 11 str. Izvleček: Liposomi so uporabni v številnih raziskovalnih in industrijskih panogah, v medicini in diagnostiki. V članku je prvič prikazan vpliv hidrodinamske kavitacije na stabilnost liposomov v primerjavi z učinkovitostjo drugih kemijskih, fizikalnih in mehanskih postopkov. Hidrodinamsko kavitacijo smo primerjali z vplivom ionske jakosti, osmolarnosti (glukoza, Na+, Ca2+ in Fe3+), prostih radikalov, striga (pipetiranje, mešanje na mešalu, rotacijski strig), visokega tlaka, elektroporacija, centrifugiranja, površinsko aktivnih snovi (Triton X-100, etanol), mikrovalov, segrevanja, zamrzovanja – odtajevanja, ter ultrazvoka (ultrazvočna banjica in ultrazvočna sonda). Notranjost veziklov je bila fluorescentno označena s fluorescentnim barvilom (natrijev-fluoresceinat). S konfokalnim fluorescentnim vrstičnim mikroskopom smo izmerili intenziteto fluorescence posameznega liposoma in določili distribucije velikosti, intenzitete in števila liposomov pred in po izbranem tretmaju. Izmed vseh testiranih postopkov so imeli največji vpliv na liposome hidrodinamska kavitacija, mešanje na mešalu s steklenimi kroglicami in ultrazvok. Pokazali smo, da je lahko hidrodinamska kavitacija zelo učinkovita metoda za uničenje liposomov. V tem delu je prikazan obširen eksperimentalen pregled vpliva različnih kemijskih, fizikalnih in mehanskih postopkov, ki predstavlja osnovo za pripravo in nadaljnje rokovanje z liposomi. To delo je ponujeno pod Creative Commons Priznanje avtorstva-Deljenje pod enakimi pogoji 4.0 Mednarodno licenco. 13 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 14 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 15 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 16 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 17 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 18 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 19 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 20 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 21 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 22 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 23 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 24 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 25 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 26 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 27 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 28 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 29 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 30 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 31 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 32 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 33 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 34 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 35 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 36 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 37 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 38 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 39 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 40 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 41 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 42 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 43 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 44 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 45 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 46 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 2.1.2 Študija morfologije gigantskih veziklov v neravnovesnih okoljih z Monte Carlo metodo Drab M., Pandur Ž., Penič S., Iglič A., Kralj-Iglič V., Stopar D. 2021. A Monte Carlo study of giant vesicle morphologies in nonequilibrium environments. Biophysical Journal, 120, 20: 4418-4428. Izvleček: Lipidni vezikli so mehke dinamične strukture. Predstavljajo najbolj enostavni model za študij stresnih vplivov okolja na biološke celice, vendar je njihovo morfološko proučevanje zaradi izrazito hitre dinamike med delovanjem stresnega dejavnika zelo oteženo. V tem delu smo razvili model za proučevanje morfoloških sprememb med delovanjem okoljskega stresorja. Lipidne vezikle smo in situ po izpostavljenosti kemijskemu stresorju morfološko okarakterizirali v realnem času z uporabo konfokalne laserske vrstične mikroskopije. Pokazali smo, da se je lipidni vezikel iz sferične oblike preobrazil v nesferične oblike, ki so spominjale na hruškaste oblik veziklov, uvihavanje veziklov, pojav večjega števila izrastkov (nanotub). Med posameznimi morfološkimi oblikami je prihajalo do hitre interkonverzije. Eksperimentalne rezultate dinamike oblik veziklov smo nato razložili z matematično analizo. S simulacijami po metodi Monte Carlo smo konstruirali 3D mrežo dvosloja, ki je upoštevala postopno vgrajevanje molekul detergenta v lipidni dvosloj. Predpostavili smo, da je glavni vzrok za morfološke spremembe vezikla sprememba spontane ukrivljenosti membrane zaradi invertno konično oblikovanih molekul detergenta. Numerični rezultati se skladajo z eksperimentalnimi rezultati kar potrjuje primernost modela, ki nam omogoča vpogled v silovito dinamiko veziklov. Zaradi hitre dinamike in neravnovesnih sprememb je takšne spremembe težko proučevati, zato je v veliko pomoč matematičen model, ki omenjen pojav natančno popiše. Rezultati kažejo, da je z zunanjimi vplivi (kemijskimi ali mehanskimi) možno pognati membrano v visoko amplitudne oscilacije, ki imajo katastrofalne posledice za lipidni dvosloj. 47 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 48 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 49 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 50 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 51 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 52 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 53 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 54 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 55 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 56 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 57 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 58 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 59 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 60 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 61 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 2.1.3 Materialne lastnosti celične stene bakterije E. coli določajo odpornost celic na sonolizo Pandur Ž., Dular M., Kostanjšek R., Stopar D. 2022. Bacterial cell wall material properties determine E. coli resistance to sonolysis. Ultrasonics Sonochemistry, 83: 105919, doi: 10.1016/j.ultsonch.2022.105919: 10 str. Izvleček: Iz rezultatov dinamike lipidnih dvosoljev v prejšnjem poglavju izhaja, da je mogoče z zunanjimi kemijskimi dejavniki povzročiti katastrofalne oscilacije v membrani. V tem delu smo z uporabo ultrazvoka preverili, kako se lahko različne strukture bakterijske celične stene upirajo mehansko povzročenim oscilacijam V raziskavi smo sistematično spremenili lastnosti celične stene bakterije E. coli, katere smo sonicirali z ultrazvočno sondo (20 kHz frekvenca, kalorimetrična moč 6,73 W). Določili smo stopnjo uničenja bakterijskih celic z okvarjenimi kapsularnimi komponentami, spremenjeno zunanjo membrano, spremenjenim peptidoglikanskim ovojem, sferičnih celic (sferoplasti) in gigantskih sferoplastov. Prav tako smo preverili odziv celic v različnem fiziološkem stanju – eksponentna in stacionarna faza rasti. Stacionarne celice so bile do 5-krat bolj odporne na soniciranje kakor celice v fazi rasti. Najbolj dovzetne na inaktivacijo z vsiljenimi zunanjimi oscilacijami so bile celice z oslabljenim peptidoglikanskim slojem. Celice, ki so imele popolnoma odstranjen peptidoglikan (sferoplasti) so bile izjemno občutljive na soniciranje. Občutljivost sferoplastov je bila primerljiva z lipidnim dvoslojem (liposomi). Rezultati kažejo, da ima na učinkovitost soniciranja veliko vlogo struktura peptidoglikanskega sloja, obenem pa tudi fiziološko stanje bakterijskih celic. To delo je ponujeno pod Priznanje avtorstva-Nekomercialno-Brez predelav 4.0 Mednarodno licenco. 62 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 63 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 64 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 65 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 66 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 67 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 68 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 69 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 70 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 71 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 72 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 73 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 74 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 75 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 76 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 2.2 OSTALO POVEZOVALNO ZNANSTVENO DELO Eksperimentalno delo in analiza eksperimentalnih rezultatov predstavljenega dela je plod lastnega dela z nasveti mentorja in somentorja, numerična analiza kavitacijskega mikromehurčka in odziva na bakterijske celice je plod dela sodelavca v raziskovalni skupini dr. Jure Zevnik, ki je omogočila natančnejši vpogled in opis pojava kavitacije mikromehurčka in odziva na bakterijske celice. 2.2.1 Vpliv posameznega kavitacijskega mehurčka na bakterijsko celico 2.2.1.1 Uvod V predhodnih poglavjih smo pokazali, da ima kavitacija velik vpliv na populacije lipidnih veziklov, bakterijskih sferoplastov, mehansko ošibljenih bakterijskih celic, kot tudi intaktnih bakterijskih celic. Na Slika 3 je prikazano, da je lahko populacija hidrodinamsko ali akustično generiranih mehurčkov učinkovito znižala število bakterijskih celic. Slika 3: Učinek hidrodinamske in akustične kavitacije na E. coli. Učinek hidrodinamske (levo, modra krivulja) in akustične (desno, oranžna krivulja) kavitacije na bakterijsko kulturo E. coli v eksponentni fazi rasti. Uporabljena mikrokavitacijska naprava za hidrodinamsko kavitacijo je imela Venturijevo zožitev z dimenzijami 225x150 µm, pretok 1,6 ml/s, tlak na vstopni strani zožitve je bil 10 bar. Točke na krivulji predstavljajo povprečje dveh eksperimentalnih ponovitev, napaka je prikazana kot standardni odklon ponovitev. Akustična kavitacija je bila generirana z ultrazvočno sondo (150 W), premer konice 3mm, 15 µm amplituda. Točke na krivulji predstavljajo povprečje petih eksperimentalnih ponovitev, napaka je prikazana kot standardni odklon ponovitev. V teh eksperimentih smo generirali gručo kavitacijskih mehurčkov, ki je delovala na gručo lipidnih veziklov oziroma populacijo bakterijskih celic. Zaradi kompleksnosti kavitacijskega fenomena in za boljše razumevanje pojava je nujno potrebno kavitacijo skalirati na nivo posameznega mehurčka in posamezne celice. V tem poglavju predstavljamo še neobjavljene rezultate razvoja nove metode, ki omogoča proučevanje interakcije med posameznim kavitacijskim mikromehurčkom in bakterijsko celico. 77 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Kavitacija je široko uporabljena metoda v raziskovalnem svetu in industriji, in se uporablja za namene čiščenja, dezinfekcije, za ustvarjanje disperzij, uničevanja celic in izolacijo celičnih komponent (Zupanc in sod., 2019). Makroskopski učinek kavitacije na bakterijske celice je rezultat številnih dogodkov implozije kavitacijskih mehurčkov na različnih časovnih skalah (Gogate in Pandit, 2005; Paliwal in Mitragotri, 2006; Zupanc in sod., 2019). Kljub številnim raziskavam, še vedno ni jasen natančen mehanizem (mehanski, fizikalni ali kemijski stresorji) kot vzrok za inaktivacijo bakterij. Kot omenja Prosperetti (2004), veliko raziskav je že bilo narejenih na temo mehurčkov, vendar še vedno ne poznamo točen mehanizem interakcije mehurčka z bakterijsko celico. Da bi lahko ocenili učinek izbranega kavitacijskega mehurčka na posamezno celico se je potrebno približati velikostni skali, ki je podobna velikosti bakterijskih celic, torej mikrometrski velikostni skali. Na tako majhni velikostni skali pa je izziv kako nadzorovati vzbujanje in pojav kavitacije. Kavitacija na mikrometrski skali namreč steče na mikrosekundni časovni skali. Odziv bakterijske celice na mehanski stres pri različnih časovnih frekvencah je različen in nakazuje na gumijast odziv pri nizkih frekvencah, viskoelastični odziv pri srednjih frekvencah in drobljiv (steklast) odziv pri visokih frekvencah (Vadillo-Rodríguez in Dutcher, 2011). Srednje frekvence korelirajo karakterističnemu bakterijskem podvojevalnemu času, kjer so bakterije optimalno prilagojene na okolico in jih je v tem časovnem okvirju najtežje uničiti. Iz vidika materialnih lastnosti bakterijske celice bi morala biti bakterija najbolj dovzetna na propad pri visokofrekvenčnih mehanskih obremenitvah saj se lastnosti materiala spremenijo iz podajne strukture v krhko, kar bi v primeru bakterijske celice pomenilo nastanek ireverzibilnih celičnih poškodb in posledično lizo celic. Mehanski odziv bakterijskih celic pri nizkih in srednjih frekvencah je dokaj dobro opisan z metodami mikroskopije na atomsko silo, študij v laminarnih tokovih ter rast bakterij v gelih (Amir in sod., 2014; Tuson in sod., 2012; Vezenov in Barrett, 2013), medtem ko odziv bakterij na visokofrekvenčne mehanske obremenitve ni dobro raziskan. Interakcija kavitacijskega mehurčka v velikosti nekaj deset mikrometrov ali več z evkrationtskimi celicami je že bila opisana (Jasikova in sod., 2019; O'Connor in sod., 2021; Ohl in sod., 2006; Rau in sod., 2006). V večini teh primerov so uporabili za generacijo kavitacije laserski preboj, ki omogoča natančen časoven in prostorski nadzor nastanka kavitacijskega mehurčka. Vendar pri laserskem preboju nastane plazma, ki povzroči nastanek visoko reaktivnih kisikovih radikalov, kateri lahko zamaskirajo mehanski efekt kavitacijskega mehurčka na biološko strukturo (Patinglag in sod., 2021; Sinibaldi in sod., 2019). Podobne raziskave pri bakterijah še ni bilo. Pri bakterijah se poleg otežene metodologije za generiranja majhnega mikromehurčka pojavi še dodaten izziv zaznavanja sprememb zaradi majhne velikosti bakterije, ki meji na difrakcijsko mejo svetlobnega mikroskopa. 78 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 V raziskavi smo opazovali interakcijo med kavitacijskim mikromehurčkom in posameznimi pritrjenimi bakterijskimi celicami E. coli v realnem času. Optična pinceta je omogočila natančno in hitro pozicioniranje mikromehurčka v bližini bakterijskih celic, kavitacijo mehurčka smo vzbudili s tlačnimi valovi, ki so nastali ob visokonapetostni razelektritvi. Kolaps mikromehurčka smo zajeli s hitro kamero, kjer smo z 0,7 µs časovnim intervalom zajemali potek kolapsa mikromehručka, ki je trajal nekaj mikrosekund. Vpliv kavitacijskega mikromehurčka na bakterijo je bil spremljan s svetlobno in fluorescenčno mikroskopijo. Z dobljenimi eksperimentalnimi rezultati smo potrdili računsko analizo kolapsa mikromehurčka in njegovo interakcijo z bakterijo, ki nam je omogočil bolj natančen vpogled v dinamiko raziskovanega fenomena. S pomočjo računske analize smo ocenili mejne vrednosti za strižno napetost in hidrodinamsko silo, ki povzroči poškodovanje ali odtrganje bakterijske celice iz površine. 2.2.1.2 Materiali in metode Generiranje kavitacijskega mikromehurčka Za nastanek mikrometrskega kavitacijskega mehurčka smo uporabili kombinacijo optične pincete in visokonapetostne razelektritve. Z laserskim pulzom smo ustvarili stabilni mikrometrski mehurček, ki je služil kot zarodno jedro za kavitacijski mikromehurček. Nato smo ustvarili visokonapetostno razelektritev kjer so nastali tlačni valovi. Ti so povzročili razteg in kolaps zarodnega mehurčka. Obe metodi sta bili združeni v eksperimentalni komori, ki je bila nameščena na inverten mikroskop. Oblika eksperimentalne komore Komora je bila eliptične oblike in je bila narejena s 3D tiskalnikom. Tehnična skica komore je predstavljena na Slika 4. Večja ovalna odprtina je bila zaprta z objektnim stekelcem (76 x 26 mm, Menzel Gläser, Nemčija) in zatesnjena z epoksi lepilom. Manjša ovalna odprtina je bila zaprta z #1.5 krovnim stekelcem (60 x 24 mm, Menzel Gläser, Nemčija) in zatesnjena z VALAP tesnilno mešanico (Valap Sealant, 2015). Za pozicioniranje visokonapetostne razelektritve v komori smo uporabili volframove igle, ki so bile postavljene na sredini komore, 0,5 mm nad krovnim stekelcem. Komora je bila napolnjena s svežo destilirano vodo (približno 15 ml), kateri smo dodali magnetne kroglice (končna koncentracija je bila približno 3,7 x 106 kroglic/ml, Bangs Laboratories, ZDA). Pripravljena in zatesnjena komora je bila nameščena na inverten mikroskop Nikon Ti-U (Nikon Instruments Inc., ZDA). 79 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Slika 4: Shematski prikaz eksperimentalne postavitve. Optična pinceta je bila nameščena na inverten mikroskop skupaj s hitro in fluorescenčno kamero. S hitro kamero smo zajeli potek kolapsa mikromehurčka, s fluorescenčno kamero smo zajeli odziv bakterijskih celic na kolaps mikromehurčka. Eksperimentalna komora je bila nameščena na mikroskop z manjšo ovalno odprtino navzdol proti objektivom. V eksperimentalni komori smo z optično pinceto naredili mikromehurček, nato smo z visokonapetostno razelektritvijo ustvarili tlačne valove, ki so povzročili kavitiranje zarodnega mikromehurčka. Generiranje visokonapetostne razelektritve Med visokonapetostno razelektritvijo je na mestu razelektritve nastal milimetrski kavitacijski mehurček, ki je generiral udarne tlačne valove (slika 6). Za generiranje razelektritve v deionizirani vodi smo uporabili piezoelektrični aktuator s 16 kV pulzom. Oblika naprave z vzmetnim mehanizmom omogoča ponovljive udarce na keramičen piezoelektrični aktuator. Kapacitivnost piezoaktuatorja je bila ocenjena na približno 30 pF. Za natančno pozicioniranje razelektritve smo uporabili mikrometrske volframove kirurške igle (Roboz surgical instrument, ZDA, RS-6065, 0,5 mm premer, zožane v mikrometrsko konico), katere smo postavili na željeno medsebojno razdaljo. Mehansko proženje aktuatorja je bilo računalniško krmiljeno preko LabView programske opreme. S spreminjanjem razdalje med iglama smo lahko regulirali maksimalen radij razelektritvenega mehurčka. V nadaljnjih eksperimentih smo imeli nastavljeno medsebojno razdaljo med iglama na 75 µm. 80 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Generiranje zarodnega mikromehurčka Zarodni mehurček smo generirali s pomočjo laserskega sistema optične pincete (Aresis Tweez 300, Slovenija). Optična pinceta je opremljena s 1064 nm valovno dolžino laserja (nominalna moč 5 W). Akusto-optični zrcalni sistem omogoča natančno pozicioniranje mikrometrskih delcev. Delce z visoko absorpcijskim indeksom v infrardečem spektru valovanja (na primer zlati ali magnetni delci) lahko z obsevanjem laserja segrejemo, zaradi česar pride na površini delca do nastanka pare v okoliški kapljevini (Bhuyan in sod., 2018; Quinto-Su, 2014). S kratkim laserskim pulzom (17 µs) visoke intenzitete (moč obsevanja približno 2 x 108 W/cm2), smo povzročili lokalni nastanek parnega mehurčka na površini magnetne kroglice (Bangs Laboratories, ZDA, ProMag 3 Series - 3 µm premer). Pozicioniranje magnetne kroglice je potekalo pri veliko nižjih intenzitetah laserja (moč obsevanja okrog 2 x 105 W/cm2). Življenjska doba zarodnega mikromehurčka je bila v rangu milisekunde do sekunde. Ko smo združili generiranje zarodnega mikromehurčka z visokonapetostno razelektritvijo in nastankom tlačnih valov je prišlo do hitre ekspanzije zarodnega mehurčka in nato implozije mikromehurčka na mikrosekundni časovni skali (Slika 7). Zajem slik s hitro kamero Za zajem hitrih dogodkov kot je kolaps mikrometrskega zarodnega mehurčka smo uporabili hitro kamero Photron SA-Z type 2100K-M-64GB (Photron, Japonska). Pri zajemu slik razelektritvenega mehurčka smo uporabili objektiv z 10x povečavo, Nikon CFI E Plan Achromat 10X (Nikon Instruments Inc., ZDA) z nastavitvami kamere: 210000 sličic na sekundo (fps), hitrost zaslonke 1 µs, resolucija 384x160 pikslov. Za zajem slik kolapsa mikromehurčka smo uporabili 60x objektiv z vodno imerzijo, Nikon CFI Apo NIR 60X W (Nikon Instruments Inc., ZDA) z nastavitvami kamere: 1440000 fps, 0,38 µs hitrost zaslonke in resolucija slik 128x16 pikslov. Za zajem tlačnih valov pri razelektritvi smo uporabili kamero Kirana 7M s hitrostjo zajema 5000000 fps in femtosekundnim laserjem kot vir svetlobe. Zajem slik je bil sinhroniziran s proženjem kolapsa mikromehurčka. Karakterizacija tokovnega polja med kolapsom mikromehurčka Eksperimentalna komora je bila napolnjena z deionizirano vodo in magnetnimi kroglicami kot je opisano zgoraj, dodali pa smo še steklene kroglice (4,2 µm diameter, Bang Laboratories, ZDA). Končna koncentracija kroglic v raztopini je bila približno 104 kroglic/ml. Steklene kroglice so bile postavljene z optično pinceto na določeno razdaljo od mesta kavitacijskega mehurčka. Zajem slik je potekal s hitro kamero kot je opisano zgoraj. Ob kolapsu mehurčka smo spremljali premik steklene kroglice. Položaj kroglice smo računalniško določili s programom ImageJ (1.53 f51) in vtičnikom TrackMate 81 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 (Tinevez in sod. 2017). Z vtičnikom smo najprej avtomatsko detektirali kroglico z Laplacian of Gaussian filtrom z nastavljenim premerom objekta 4,2 µm. Dodatno smo zaznane objekte ročno preverili in jih po potrebi popravili. Za sledenje premika kroglice smo nadaljnje uporabili sledilnik »linear assignment problem« (LAP). S pridobitvijo položaja kroglice med kolapsom mikromehurčka smo lahko izračunali tok tekočine v bližini kavitirajočega mehurčka. Bakterijske celice Priprava bakterijske kulture Uporabili smo bakterijsko kulturo Escherichia coli MG1655 z vstavljenim genom za sintezo zelenega fluorescentnega proteina (ang. green fluorescent potein - gfp) pod inducibilnim izopropil-ß-D-tiogalaktopiranozid (IPTG) promotorjem in selekcijskim markerjem z odpornostjo na antibiotik kanamicin (Kn). Zamrznjeno kulturo na -80 °C smo nacepili na trdno lizogeno agarsko (LB) gojišče z dodanim antibiotikom kanamicin (50 µg/ml) z razmazom do posameznih kolonij. Nato smo posamezno bakterijsko kolonijo prenesli v tekoče LB gojišče s kanamicinom in IPTG (400 µg/ml). Tako pripravljeno kulturo smo stresali preko noči na stresalniku s frekvenco stresanja 200 obratov /min v topli sobi na 37 °C. Inkubacijski čas prekonočne kulture je bil približno 16 ur. Vezava bakterijskih celic Za vezavo celic na steklo smo uporabili #1.5 mikroskopsko krovno steklo v dimenzijah 60x24 mm (Menzel-Gläser, Nemčija). Najprej smo krovna stekelca očistili s soniciranjem v ultrazvočni banjici (PRO MED 50, at 120 W, 40 kHz, ASonic; Slovenija) in 96 % etanolu s časom soniciranja 20 min in pri normalni amplitudi. Nato smo očiščena stekelca sprali v deionizirani vodi ter jih osušili s komprimiranim zrakom. Suha krovna stekelca smo nato prenesli v napravo za čiščenje s plazmo (Harrick Plasma Inc, ZDA) kjer smo še dodatno očistili stekelca s plazmo pri visokem radiofrekvenčnem načinu in zrakom. Čas obdelovanja s plazmo je bil 60 s. Po tretiranju s plazmo smo na sredino stekelca dodali 50 µl 0,1% (w/v) vodne raztopine poli-L-lizin (PLL) (Sigma-Aldrich, ZDA) in inkubirali kapljico 10 min pri sobni temperaturi. Po inkubaciji smo odvečno PLL raztopino sprali s čisto deionizirano vodo in osušili stekelca na zraku. Tako pripravljena stekelca smo shranili na suhem in v temi do uporabe pri eksperimentih. Nato smo vzeli 10 ml prekonočne kulture bakterije E. coli, katero smo centrifugirali 4 minute pri 5000 relativnih centrifugalnih enotah (rcf) pri sobni temperaturi. Supernatant smo odlili in resupendirali pelet celic v sveži deionizirani vodi. Postopek smo ponovili 3-krat. Po tretjem centrifugiranju smo celice skoncentrirali v 100 µl deionizirane vode. 50 µl skoncentrirane kulture smo nanesli na sredino krovnega 82 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 stekelca s PLL in pustili stati kulturo na stekelcu 5 min pri sobni temperaturi. Po koncu inkubacije smo nevezane celice nežno sprali z deionizirano vodo, stekelce z vezanimi bakterijami na steklo pa smo položili čez manjšo ovalno odprtino komore in zatesnili z VALAP tesnilom. Pred tem smo eksperimentalno komoro pripravili kot je opisano zgoraj, le da smo v tekočino dodatno dodali 15 µl membransko nepropustnega fluorescentnega barvila propidijev jodid (PI). Fluorescenčna mikroskopija Za vizualizacijo bakterijskih celic smo uporabili visoko občutljivo EMCCD kamero (Andor Ixon 888 Ultra, Oxford Instruments, Združeno kraljestvo). Za simultan zajem več flurescenčnih kanalov smo dodatno uporabili še optični sistem Cairn Optosplit III (Cairn Research, Združeno kraljestvo). Za vzbujanje fluorokromov smo uporabili CoolLed pE-4000 sistem. Za zaznavanje vseh celic smo uporabili zajem v spektru gfp proteina (eksitacija s 460 nm pri 30 % intenziteti, emisijski filter 525/40 nm). Celice, ki so bile poškodovane so se obarvale z barvilom PI, za katerega smo obsvetili vzorec s 550 nm valovno dolžino in 30 % intenziteto, emisijski filter je bil 640/40 nm. Čas izpostavljenosti senzorja signalu je bil pri obeh kanalih 100 ms. Interval zajema slik na obeh kanalih je bil nastavljen na 5 s časovni interval. Skupen čas zajemanja slik je bil 5 min. Zaradi hitrega bledenja gfp fluorokroma smo dodatno zajeli mikroskopske slike še s svetlobno presevno tehniko pred začetkom in po koncu zajemanja fluorescenčnih slik. Resolucija zajetih slik je bila 1024x512 pikslov (vidno polje: 223,5 x 111,7 µm). Analiza slik Mikroskopske slike smo analizirali z računalniškim programom ImageJ (1.53 f51). najprej smo mikroskopske slike iz različnih kanalov (svetlobna, gfp in PI) poravnali med kanali. Nato smo preko macro ukaza izvedli serijo analiz, da smo dobili lokacijo posameznih bakterij na vsakem kanalu. Najprej smo iz posnetkov hitre kamere določili center in maksimalni radij kavitacijskega mehurčka. Na podlagi pozicije in maksimalnega radija kavitacijskega mehurčka smo centrirali mikroskopske slike na center kavitacijskega mehurčka in obrezali sliko na 2x maksimalni radij mikromehurčka. Z obrezanimi slikami in pragovnim segmentiranjem slik smo dobili bakterijske celice pred in po kolapsu mikromehučka (svetlobna mikroskopija). Slike so bile še dodatno ročno pregledane, kjer smo celice, ki so se prekrivale ročno ločili na dva objekta. Na binarnih slikah posameznih celic smo uporabili vtičnik »Analyze Particles« kjer smo dobili koordinate o centru posameznega objekta, torej bakterije. Odtrgane celice smo določili z matematičnim odštevanjem binarnih slik pred in po kolapsu. Dodatno smo analizirali fluorescenčne slike kjer so se celice obarvale s propidijevim jodidom, katere celice smo označili kot poškodovane. Poškodovane celice smo določili prav tako z odštevanjem binarnih slik po in pred kolapsom mikromehurčka. 83 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Analiza rezultatov Shematski prikaz na Slika 5 prikazuje interakcijo med bakterijsko celico in kavitacijskim mehurčkom pri različnih perspektivah s prikazanimi parametri, ki smo jih uporabili pri nadaljnji analizi. Slika 5: Shematski prikaz interakcije mikromehurčka in bakterijske celice iz različnih perspektiv. Levi sliki predstavljata začetno stanje pred kolapsom mikromehurčka, desni sliki predstavljata mikromehurček z maksimalnim radijem. Pri zgornjem pogledu je določena razdalja med centrom mikromehurčka in centrom celice ( d 0), ter maksimalni radij mikromehurčka ( R r,max). Na podlagi teh dveh parametrov smo določili brez-dimenzijsko razdaljo δ, ki opisuje razmerje med razdaljo celice in maksimalnim radijem mikromehurčka. Pri stranskem pogleda začetnega stanja mikromehurčka d b predstavlja začetno razdaljo med mikromehurčkom in trdno steno z začetnim radijem R 0 pri normalnem okoliškem tlaku in temperaturi. Pozicijo celic iz analize mikroskopskih slik smo pretvorili v brez-dimenzijsko razdaljo δ po enačbi: √ 2 2 (𝑥 +(𝑦 𝛿 = 𝑐𝑒𝑙𝑖𝑐𝑎−𝑥𝑐𝑒𝑛𝑡𝑒𝑟 𝑚𝑖𝑘𝑟𝑜𝑚𝑒ℎ𝑢𝑟č𝑘𝑎) 𝑐𝑒𝑙𝑖𝑐𝑎−𝑦𝑐𝑒𝑛𝑡𝑒𝑟 𝑚𝑖𝑘𝑟𝑜𝑚𝑒ℎ𝑢𝑟č𝑘𝑎) . …(1) 𝑅𝑟,𝑚𝑎𝑥 84 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 kjer x celica in y celica predstavljata koordinate položaja celice, x center mikromehurčka in y center mikromehurčka predstavljata koordinate centra mikromehurčka, R r,max pa predstavlja maksimalen projiciran horizontalen radij mikromehurčka. Brez-dimenzijska razdalja δ ima razpon med vrednostma 0 in 2, kjer 0 vrednost pomeni da je celica v centru mehurčka, medtem ko vrednost 2 predstavlja lokacijo bakterije na 2x oddaljenosti od projiciranega maksimalnega radija mikromehurčka. Brezidmenzijske razdalje celic iz različnih mikroskopskih slik (začetno stanje, odtrgane ali poškodovane celice) smo potem kategorizirali v gruče s širino Δδ = 0,1 (skupaj 20 gruč). Kategoriziranim podatkom za vsak eksperiment smo potem določili verjetnosti za pričakovane izide odtrganja ali poškodovanja celice. Verjetnost odtrganja ali poškodovanja celice za j-to gručo in i-to eksperimentalno ponovitev je bila določena z enačbami: i,j 𝑁 i,j i,j 𝑁 −𝑁 𝑝i,j = max [ odtrgana , celica,pred celica,po], …(2) odtrgana i,j 𝑖,𝑗 𝑁 𝑁 celica,pred celica,pred 𝑁𝑖,𝑗 𝑝𝑖,𝑗 = 𝑝𝑜š𝑘𝑜𝑑𝑜𝑣𝑎𝑛𝑎, …(3) 𝑝𝑜š𝑘𝑜𝑑𝑜𝑣𝑎𝑛𝑎 𝑁𝑖,𝑗 𝑐𝑒𝑙𝑖𝑐𝑎,𝑝𝑟𝑒𝑑 𝑁𝑖,𝑗 𝑝𝑖,𝑗 = 𝑝𝑜š𝑘𝑜𝑑𝑜𝑣𝑎𝑛𝑎. …(4) 𝑝𝑜š𝑘𝑜𝑑𝑜𝑣𝑎𝑛𝑎,𝑛𝑒𝑜𝑑𝑡𝑟𝑔𝑎𝑛𝑎 𝑁𝑖,𝑗 𝑐𝑒𝑙𝑖𝑐𝑎,𝑝𝑜 Vrednosti 𝑁i,j , 𝑁i,j , 𝑁i,j , in 𝑁i,j predstavljajo število celic v celica,pred celica,po odtrgana poškodovana j-ti gruči i-te eksperimentalne ponovitve v začetnem stanju (pred) ali končnem stanju (po). Verjetnost za poškodovanje celic smo primerjali za začetno stanje (𝑝i,j ) poškodovana in tudi na kočno stanje (𝑝i,j ), kjer primerjamo verjetnost za 𝑝𝑜š𝑘𝑜𝑑𝑜𝑣𝑎𝑛𝑎,neodtrgana poškodovanje ostalih celic, ker za odtrgane celice ne moremo sklepati o živosti. Numerične metode Numerična analiza kavitacijskega mikromehurčka in odziva na bakterijske celice je plod dela sodelavcev v raziskovalni skupini, ki je omogočila natančnejši vpogled v potek kavitacije mikromehurčka in odziva na bakterijske celice. Izvedene so bile numerične simulacije dinamike mehurčka v bližini toge stene, kar nam je omogočilo podrobnejši mehanistični uvid v interakcijo med mikromehurčkom in bakterijskimi celicami. Simulacije vključujejo razrešitev tokovnega polja v bližini mehurčka, dinamike bližnjih suspendiranih kroglic in izračun obtežbe na steno pritrjene bakterijske celice. Teoretično ozadje Model dinamike mehurčka 85 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Uporabljeni model dinamike tekočin Fluent (Ansys, ZDA) temelji na metodi končnih volumnov skupaj z metodo volumna tekočine za razrešitev stisljivega večfaznega toka. V splošnem je mogoče dinamiko mehurčkov matematično opisati z enačbami ohranitve mase, gibalne količine in energije. V tem primeru sta obravnavani dve fluidni fazi - plinasti mehurček in okoliška tekočina, njuna fazna meja pa je zajeta z reševanjem kontinuitetne enačbe za polje volumskega deleža 𝛼l tekoče faze. V naslednjem razdelku so količine in lastnosti, značilne za vsako fazo, označene z ustreznim indeksom 𝑖 = g, l, ki označujeta plinasto oziroma tekočo fazo. Enačbo ohranitve mase za kapljevinsko fazo lahko zapišemo kot 𝜕𝛼l𝜌l + 𝛁 ⋅ (𝛼 𝜕t l𝜌l𝑼l) = 0. …(5) Tukaj 𝜌l in 𝑼l označujeta gostoto ter hitrostno vektorsko polje tekoče faze. Polje volumskega deleža plinske faze 𝛼g lahko izračunamo kot 𝛼g = 1 − 𝛼l. Ko sta znani obe polji volumskega deleža, lahko določimo prostorninsko povprečne lastnosti tekočine 𝜙 v celotni računski domeni kot 𝜙 = ∑𝑖 𝛼𝑖𝜙𝑖. V danem primeru to velja za gostoto 𝜌, dinamično viskoznost 𝜇 in toplotno prevodnost 𝑘. Na podlagi določenih materialnih lastnosti lahko razrešimo enačbo ohranitve gibalne količine (enačba 6) in energije (enačba 7), kar rezultira v znanem skupnem hitrostnem 𝑼 in temperaturnem 𝑇 polju. 𝜕 (𝜌𝑼) + 𝛁 ⋅ (𝜌𝑼 ⊗ 𝑼) = −𝛁𝑝 + ∇ ⋅ 𝝉 + 𝒃 …(6) 𝜕𝑡 𝜕 (𝜌𝑒) + 𝛁 ⋅ (𝑼(𝜌𝑒 + 𝑝)) = 𝛁 ⋅ (𝑘𝛁𝑇) …(7) 𝜕𝑡 Tukaj, 𝑝 označuje tlak, 𝒃 masne sile, 𝝉 tenzor viskoznih napetosti in 𝑒 skupno specifično energijo. Tenzor viskoznih napetosti lahko za Newtonske tekočine zapišemo kot 2 𝝉 = 𝜇 [(𝛁𝑼 + (𝛁𝑼)𝑇) − (𝛁 ⋅ 𝑼)𝑰], …(8) 3 medtem ko je skupna specifična energija upoštevana kot masno povprečena spremenljivka ∑ 𝛼 𝑒 = 𝑖 𝑖𝜌𝑖𝑒𝑖. …(9) ∑ 𝛼 𝑖 𝑖𝜌𝑖 86 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Skupno specifično energijo posamezne faze 𝑝 |𝑼|2 𝑒𝑖 lahko izrazimo kot 𝑒𝑖 = ℎ𝑖 − + , 𝜌𝑖 2 kjer ℎ𝑖 označuje specifično entalpijo i-te faze, izračunane iz specifične toplote dane faze in znanega temperaturnega polja. Vpliv površinske napetosti obravnavamo na fazni meji med plinasto in kapljevinsko fazo. Skok tlaka na fazni meji kapljevina-plin je modeliran s silo telesa v gibalni enačbi v skladu z modelom kontinuirne površinske sile (Brackbill in sod., 1992) in se lahko izrazi kot 𝒏 𝜌(𝜵⋅ )𝛻𝛼𝑔 𝒃 = 𝜎 |𝒏| 1 . …(10) (𝜌 2 𝑔+𝜌𝑙) Tukaj 𝜎 označuje površinsko napetost med obema fazama, medtem ko je 𝒏 normala površine mehurčka, definirana kot 𝒏 = −𝛁𝛼g. Tekoča faza je modelirana kot stisljiva v skladu s Taitovo enačbo stanja: 𝜌 𝑛 𝑛(𝑝−𝑝 ( ) = 1 + ref). …(11) 𝜌ref 𝐾ref Člen 𝑛 ustreza eksponentu gostote, 𝐾ref pa referenčnemu modulu stisljivosti pri referenčnem tlaku 𝑝ref (tabela 1). Plinska faza je modelirana z zakonom idealnega plina 𝑝 𝜌 = , …(12) 𝑅∗g𝑇 kjer 𝑅∗g označuje specifično plinsko konstanto. Z upoštevanjem vsebine mehurčka kot idealnega plina zanemarjamo dejstvo, da kavitacijski mehurčki na splošno vsebujejo mešanico vodne pare in nekondenzirajočih plinov. S tem zanemarimo vsebnost vodne pare v mehurčku in mehanizme prenosa mase med mehurčkom in okoliško kapljevino. Čeprav lahko količina nekondenzirajočih plinov v mehurčku bistveno vpliva na magnitudo odboja mehurčkov in najvišje temperature v mehurčku, to bistveno ne vpliva na dinamiko mehurčkov do prvega kolapsa (Akhatov in sod., 2001). Iz tega razloga vidimo upoštevanje zakona idealnega plina kot pošten približek za trenutno obravnavani pojav. Model dinamike kroglice Rast in kolaps kavitacijskega mikromehurčka lokalno inducirata časovno in prostorsko spremenljivo tokovno polje v okoliški tekočini, kar povzroči gibanje bližnjega krogelnega delca. Gibanje delcev lahko opišemo z gibalnim zakonom: 87 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 𝑭 𝒙̈ d p = . …(13) 𝑚p Tukaj 𝑭d označuje hidrodinamsko silo upora na delec z maso 𝑚p in pozicijo 𝒙p. Nadpisane pike označujejo odvode količin po času. Za sferični delec z radijem 𝑅p lahko silo upora zapišemo kot 1 𝑭 2 d = 𝜌 𝐶 2 l𝜋𝑅p d(𝒖 − 𝒙̇p)|𝒖 − 𝒙̇p| …(14) kjer 𝜌l, 𝒖 = 𝒖(𝑡, 𝒙p(𝑡)) in 𝐶d predstavljajo gostoto tekočine, lokalno hitrost toka in koeficient hidrodinamskega upora. Slednjega lahko za krogelne delce zapišemo v obliki Kaskasove enačbe (Yow in sod., 2005): 24 4 𝐶d = + + 0,4 …(15) 𝑅𝑒 √𝑅𝑒 in velja za Reynoldsova števila 𝑅𝑒 < 2 ⋅ 105. Reynoldsovo število za kroglico je definirano kot 2𝑅 𝑅𝑒 = p𝜌l|𝒖−𝒙̇p|. …(16) 𝜇l Model pritrjene celice Podoben pristop lahko uporabimo v primeru, ko je celica pritrjena na steno. Ob predpostavki sferične oblike celice lahko ocenimo hidrodinamsko silo, ki jo na posamezno bakterijsko celico povzroči bližnji kavitacijski mikromehurček. Za pritrjeno sferično celico s polmerom 𝑅c lahko silo upora zapišemo kot 1 𝑭 2 d = 𝜌 𝐶 2 l𝜋𝑅c d𝒖|𝒖|. …(18) Tukaj 𝒖 = 𝒖(𝑡, 𝒙c,0) je lokalna hitrost toka na lokaciji celice 𝒙c,0. Koeficient upora lahko določimo v skladu z enačbo 15, kjer Reynoldsovo število izračunamo kot 2𝑅 𝑅𝑒 = c𝜌l|𝒖|. …(19) 𝜇l Nastavitev modela Model dinamike mehurčka Upoštevani sta dve fazi - plinasti mehurček in okoliška kapljevina tekočina (Slika 5). Rast prvotno stabilnega mikromehurčka (začetni radij R 0=1,1 µm) dosežemo z 88 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 nadtlakom v notranjosti mehurčka (začetni tlak mehurčka 1,96×108 Pa) v primerjavi s tlakom okolice (p∞=101325 Pa). Temperatura okoljske tekočine je 293,15 K. Mehurček je lociran med d b=1,5 µm in 15 µm (korak 1,5 µm) stran od stene, kar v danem primeru rezultira v brez-dimenzijski razdalji mehurček-stena γ= d b/ R r,max med 0,087 in 1,02 (korak ≈ 0,1). Plinasto fazo obravnavamo kot zrak, okoliško tekočino pa kot vodo. Upoštevani materialni parametri so zbrani v tabeli 1. Simulacije so izvedene z upoštevanjem osne simetrije. Uporabljena je ortogonalna numerična mreža z enakomerno resolucijo v bližini mehurčka ( Δx=44 nm, R0/Δx=25, R r,max /Δx≈370). Slednja je bila izbrana na podlagi konvergenčnih študij v prejšnjih raziskavah (Zevnik in Dular, 2020, 2021, 2022). Velikost računskih celic se postopoma povečuje ( Δx max /Δx min≈850) proti robu računske domene, ki je postavljen približno 50x R max stran od centra mehurčka. Skupno število računskih celic znaša približno pol milijona. Računski časovni korak je kontroliran v skladu s Courant–Friedrichs–Lewyjevim pogojem z največjim Courantovim številom 0,2. Robni pogoji na koncu računske domene so upoštevani za tlačni izpust s prevajanjem valov ( p∞=101325 Pa, T∞=273,15 K). Na steni je upoštevan pogoj brez zdrsa. Za vse izračune je bil uporabljen algoritem sklopitve tlaka in hitrosti PISO (Issa, 1986) skupaj z implicitno časovno diskretizacijo prvega reda. Kar zadeva prostorsko diskretizacijo, smo uporabili shemo PRESTO! (Bender, 1981) za interpolacijo tlaka in protitočno shemo drugega reda za interpolacijo gostote, gibalne količine in energije. Fazna meja med mehurčkom in okoliško kapljevino je zajeta z geometrijsko shemo odsekovno linearne geometrične rekonstrukcije fazne meje (PLIC) (Issa, 1986), ki predpostavlja, da ima fazna meja med dvema tekočinama linearni naklon znotraj računske celice. Preglednica 1: Upoštevani materialni parametri obeh tekočin. Lastnost [Enota] Kapljevina - voda Plin - zrak Dinamična viskoznost µ [Pa s] 1,003×10-3 1,8×10-5 Toplotna prevodnost k [W/(m K)] 0,6 0,0242 Površinska napetost σ [N/m] - 0,0728 Referenčna gostota ρ ref [kg/m3] 998,2 - Referenčni tlak p ref [Pa] 101325 - Referenčni modul stisljivosti K ref [Pa] 2,2×109 - Eksponent gostote n [-] 7,15 - Specifična plinska konstanta R * g [J/(kg K)] - 287,05 Model dinamike kroglice Delce silicijevega dioksida obravnavamo kot kroglice z gostoto 2000 kg/m3 in polmerom 𝑅p=2 µm (Silica Microspheres, 2019). Izračunano tokovno polje 𝒖(𝑡, 𝒙) iz 89 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 modela dinamike mehurčka na lokaciji kroglice 𝒙p lahko označimo kot 𝒖 = 𝒖(𝑡, 𝒙p(𝑡)). Ker je med eksperimenti upoštevano samo radialno gibanje kroglic, je hitrost radialnega toka 𝑢̅r, ki poganja gibanje kroglic, upoštevana kot 1 𝑧=2𝑅 𝑢̅ p r(𝑡, 𝑟p) = ∫ 𝑢 , …(20) 2𝑅 r(𝑡, 𝑟p, 𝑧) 𝑑𝑧 p 𝑧=0 ki služi kot robni pogoj v modelu dinamike kroglice, ki ga razrešimo z numerično integracijo. Modeli pritrjene bakterije Podoben pristop kot pri modelu dinamike kroglice uporabimo tudi pri modelu pritrjene 1 celice. Celice obravnavamo kot kroglice z radijem 3 3 𝑅 3 2 c = (1 𝑑 + 𝑑 (𝑙 = 8 c 16 c c − 𝑑c)) 0,45 ± 0,06 µm. Tukaj 𝑙c = 1,44 ± (0,25) µm in 𝑑c = 0,63 ± (0,06) µm (N=30) predstavljata dejansko dolžino in premer bakterijskih celic. Izraz za ekvivalenten celični radij R c dobimo preko preračuna ekvivalentnega radija iz dejanskega volumna bakterijske celice ob predpostavki sfero-cilindrične oblike celice. Hitrost toka 𝒖 ̅, ki predstavlja obtežbo na celice, je prevzeta iz modela dinamike mehurčka kot 1 𝑧=2𝑅 𝒖 ̅(𝑡, 𝑟 c c) = ∫ 𝒖(𝑡, 𝑟 , …(21) 2𝑅 c, 𝑧) 𝑑𝑧 c 𝑧=0 na podlagi katere lahko skladno z Enačbo (18) določimo pripadajočo silo upora na posamezno bakterijsko celico. Validacija numeričnega modela Časovni potek radija mikromehurčka Numerični model dinamike mehurčka je validiran preko eksperimentalnih rezultatov razvoja oblike in velikosti mikromehurčkov. Analiza dinamike mehurčkov je bila izvedena za eksperimentalno pridobljene mehurčke z največjim polmerom nad 10 µm, zaradi omejitev hitre fotografije (časovna ločljivost 0,7 µs in prostorska ločljivost 0,33 µm/px). Pomembno je omeniti, da polmer mehurčka 𝑅r označuje polmer zunanjega obrisa oblike mehurčka iz eksperimentalnih opazovanj (Slika 7a), ki ga lahko razumemo kot navpično projekcijo oblike mehurčka na vodoravno ravnino. Največji polmer 90 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 mehurčkov R r,max iz eksperimentov se je gibal med 11,0 in 20,5 µm (povprečno 14,5 µm, N=24). Brez-dimenzijska razdalja mehurček-stena γ je bila v območju med 0,20 in 0,46 (povprečje 0,30, N=24). Za neposredno primerjavo različnih eksperimentalnih in numeričnih rezultatov so bili polmeri mehurčkov in ustrezni časi pretvorjeni v brez-dimenzijsko obliko kot 𝑅 𝑡−𝑡 𝑅∗ r max r = in 𝑡∗ = . Tukaj R r,max in t max označujeta Rr,max 𝑡c maksimalni radij mehurčka in pripadajoči čas, t c pa čas kolapsa mehurčka. Hitrostno polje v bližini mikromehurčka Inducirano tokovno polje je bilo eksperimentalno okarakterizirano z merjenjem pomikov mikrokroglic silicijevega dioksida med posameznimi dogodki rasti in kolapsa mikromehurčkov. Mikrokroglice so bile z optično pinceto postavljene na različne brez-dimenzijske razdalje δ, stran od mehurčkov. Isti parameter se uporablja tudi za opis razdalje mehurček-celica (Slika 5). Premiki so bili pridobljeni s sledenjem položaja mikrokroglic. Na podlagi dobljenih premikov smo ovrednotili največje in časovno povprečne hitrosti kroglic med vsakim dogodkom mikromehurčka. Za validacijo numeričnega modela za napovedovanje razvoja hitrostnega polja v bližini stene smo izmerjene hitrosti krogle primerjali z ustreznimi vrednostmi, kot jih je predvidel numerični model. Primerjava v splošnem nakazuje na to, da numerični model precenjuje magnitudo hitrosti kroglice, vendar je to mogoče pripisati dejstvu, da so eksperimentalno dobljeni rezultati nagnjeni k podcenjevanju zaradi omejitev s hitro fotografijo (hitra kamera z 1,44 × 106 sličic na sekundo rezultira v časovni ločljivosti Δt= 0,7 µs). Medtem ko numerične simulacije omogočajo veliko boljšo časovno ločljivost z Δt≪0,1 μs. Model verjetnosti celičnega dogodka Razmerje med vršnimi obtežbami (hidrodinamska sila, strižna napetost na steni) in verjetnostjo pojava posameznega celičnega dogodka (odtrganje, celična smrt) je bilo kvantificirano s prileganjem pridobljenih podatkov na model verjetnosti celičnega dogodka. Slednji je definiran z odsekovno funkcijo s tremi koeficienti. Povezava med izbrano metriko obtežbe in verjetnostjo dogodka celice je določena s potenčno funkcijo, kjer so koeficienti nastavljeni tako, da predstavljajo spodnjo mejno obtežbo, zgornjo mejno obtežbo in pripadajoči eksponent obtežbe. Verjetnost celičnega dogodka pri vršni hidrodinamski sili 𝐹max je določena v skladu z naslednjo odsekovno funkcijo: 0, |𝐹max| < 𝐹lth, 𝛽 |𝐹 𝐹 𝑃 max|𝛽𝐹−𝐹lth event(𝐹max) = , 𝐹 …(22) 𝛽 𝛽 lth ≤ |𝐹max| ≤ 𝐹uth, 𝐹 𝐹 −𝐹 𝐹 uth lth { 1, 𝐹uth ≤ |𝐹max|. 91 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Tukaj 𝐹lth in 𝐹uth označujeta spodnjo in zgornjo mejno silo. Prvo lahko razumemo kot mejo, da se dogodek za veliko večino celic sploh lahko zgodi (𝑃event(𝐹max) ≈ 0), medtem ko drugi predstavlja zgornjo mejno silo, pri kateri lahko pričakujemo, da se bo dogodek zgodil za veliko večino celic (𝑃event(𝐹max) ≈ 1). 𝛽F je tretji modelni koeficient, ki prestavlja eksponent sile. Podoben model je uporabljen tudi za okarakterizacijo verjetnosti celičnega dogodka v povezavi z vršno strižno napetostjo na steni 𝜏max: 0, |𝜏 max| < 𝜏lth, | 𝛽 𝜏 𝜏 𝑃 max|𝛽𝜏−𝜏lth event(𝜏max) = , 𝜏 …(23) 𝛽 𝛽 lth ≤ |𝜏max| ≤ 𝜏uth, 𝜏 𝜏 −𝜏 𝜏 uth lth { 1, 𝜏uth ≤ |𝜏max|. Tudi tukaj 𝜏lth in 𝜏uth označujeta spodnjo in zgornjo mejo vršnih strižnih napetosti na steni, medtem ko 𝛽𝜏 predstavlja eksponent strižne napetosti. Prileganje modela je bilo izvedeno v programskem okolju Matlab z uporabo nelinearne metode najmanjših kvadratov skupaj z algoritmom območja zaupanja. Globalno prileganje je bilo izvedeno za vsak par metrika obtežbe – celični dogodek (skupaj 4 pari). Statistična analiza Verjetnost dogodkov bakterijskih celic v odvisnosti od brez-dimenzijske razdalje δ smo matematično popisali s krivuljo modela eksponentne enačbe. Parametri prileganja modela z mediana vrednostmi eksperimentalnih podatkov za verjetnost odtrganja celic z enačbo P∝ e-2δ je napaka srednjega kvadrata (RMSE) in je znašala 0,039, koeficient determinacije (R2) pa je bil 0,98. Za mediana vrednosti pri verjetnosti za poškodovanje celic pa smo pri enačbi P∝ e-4δ določili parametre RMSE=0,044, R2=0,98. Za ugotavljanje vpliva tipov curka na odtrganje ali poškodovanje celic smo uporabili Kolmogorov-Smirnov test. p-vrednosti za verjetnosti odtrganja ali poškodovanja celic v odvisnosti od δ pri γ=0.30 so bile 0,77 in 0,71. 2.2.1.3 Rezultati Metoda generiranja kavitacijskega mikromehurčka temelji na kombinaciji nastanka zarodnega mehurčka z laserjem in visokonapetostne razelektritve. Pri visokonapetostni razelektritvi pride do nastanka mehurčka v eksperimentalni komori v velikosti med 600 in 900 µm, odvisno od razdalje med pozicionirnima iglama (Slika 6a,c). Ob kolapsu nastanejo tlačni valovi (Slika 6b), ki potujejo skozi eksperimentalno komoro. Čas rasti in kolapsa razelektritvenega mehurčka je bil okrog 130 ms, rast in kolaps mehurčka sta 92 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 bila simetrična. Razelektritveni mehurček ni imel vpliva na opazovane celice in ni povzročil odtrganja ali poškodovanja celic (Slika 6e). 93 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Slika 6: Potek visokonapetostne razelektritve v tekočini in vpliv zarodnega mikromehurčka ali tlačnih valov na opazovane bakterijske celice. (a) Zaporedje slik rasti in kolapsa mehurčka pri visokonapetostni razelektritvi pri 75 µm medsebojni razdalji med iglama. Merilo: 100 µm. (b) Nastanek tlačnih valov pri nastanku razelektritve pred pojavom kavitacijskega mehurčka. Merilo: 100 µm. (c) Levi graf prikazuje odvisnost maksimalnega radija mehurčka (Rmax) od medsebojnega razmika med konicama igel. Ročke prikazujejo povprečje štirih ponovitev, napaka je prikazana kot standardna deviacija. Z večanjem razdalje med iglama narašča tudi maksimalen radij mehurčka. Srednji graf prikazuje časovni potek spreminjanja radija mehurčka za eno ponovitev. Desni graf prikazuje spreminjanje brez-dimenzijskega radija – R* (radiji normaliziran na maksimalni radij) in brez-dimenzijski čas – t* (čas je normaliziran na časovno točko maksimalnega radija mehurčka). Negativne vrednosti predstavljajo čas pred maksimalnim radijem – rast mehurčka, pozitivne vrednosti pa so časovne točke po dosegu maksimalnega radija in je faza kolapsa mehurčka. Graf prikazuje vse štiri posamezne eksperimente. (d) Leva mikroskopska slika prikazuje stanje pred nastankom zarodnega mikromehurčka kjer je v centru vidna magnetna kroglica. Desna slika prikazuje stanje celic po nastanku zarodnega mikromehurčka. Mikroskopske slike so kompozitne slike svetlobne presevne mikroskopije (sivinska slika) in fluorescenčne mikroskopije s PI (rdeči objekti). Primerjava leve in desne slike kaže, da zarodni mehurček ni imel signifikantnega vpliva na okoliške celice – ni prišlo do odtrganja ali poškodb celic. Merilo: 10 µm. (e) Sliki prikazujeta vpliv visokonapetostnega razelektritvenega mehurčka oziroma tlačnih valov na opazovane celice. Položaj celic je bil približno 4 mm stran od izvora nastanka razelektritve. Leva slika kaže stanje pred razelektritvijo medtem ko desna slika kaže stanje po razelektritvi. Primerjava slik pred in po dogodku ne kažeta na signifikantne spremembe pri opazovanih celicah. Merilo: 10 µm. Na oddaljenosti 4-5 mm od vira visokonapetostne razelektritve smo z laserskim pulzom lokalno segreli površino magnetne kroglice, kar je omogočalo rast zarodnega mikromehurčka z mediano radija 1,1 µm (N=15). Življenjska doba takšnega mehurčka je bila v času med nekaj sto milisekund in nekaj sekundami. Zarodni mehurček ni implodiral. Nastanek zarodnega mikromehurčka ni imel vpliva na odtrganje ali poškodovanje okoliških celic (Slika 6d). Za nastanek nestabilnega kavitacijskega mehurčka (Slika 7a) so bili potrebni tlačni valovi, ki so nastali pri razelektritvi ob nastanku razelektritvenega kavitacijskega mehurčka (Slika 6b). Stabilen zarodni mehurček se je ob prehodu tlačnega vala skrčil, takoj zatem pa eksplozivno razširil (Slika 7a). Mediana maksimalnega radija kavitacijskega mehurčka pri eksperimentih je bila 15,4 µm. Ob kolapsu mehurčka se je ustvaril mikrocurek proti trdni stekelcu, ki je na sliki opazen znotraj mehurčka kot dodaten siv obroč (slika 7a pri 3,5 µs in 4,2 µs). Za statistično analizo rezultatov smo upoštevali samo eksperimente, kjer je kavitacijski mehurček dosegel ali presegel maksimalni radij 10 µm. Z metodo sicer lahko ponovljivo generiramo kavitacijske mehurčke do treh mikrometrov, vendar zaradi prostorske in časovne resolucijske omejitve (časovna resolucija slik je bila 0,7 µs in prostorska resolucija 3 piksle/µm) smo pri analizi uporabili samo večje mehurčke. 94 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Slika 7: Kavitacijski mehurček in njegov vpliv na bakterijske celice. (a) Tipičen razvoj kavitacijskega mikromehurčka (ptičja perspektiva). Posnetki s hitro kamero prikazujejo zarodni mikromehurček, ki se po prehodu tlačnih najprej skrči in nato eksplozivno raste (1,4-2,8 µs), temu 95 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 sledi faza kolapsa mikromehurčka (3,5-4,2 µs). V fazi kolapsa lahko iz spodnje perspektive opazimo nastanek curka proti steklu, ki je viden kot dodatna obročasta struktura znotraj mehurčka. Sekvenca je dolga 7 µs, merilo je 5 µm. (b) Mikroskopske slike pred (levo) in po (desno) kolapsu mikromehurčka. Sliki sta kompozitni sliki presevne svetlobne mikroskopije (sivinska slika) ter fluorescenčne mikroskopije barvila PI (rdeči objekti). Rdeče obarvane celice so se obarvale z barvilom PI, ki kaže na poškodovanje celic. Po kolapsu mikromehurčka opazimo območje v centru mehurčka kjer so bile vse celice odtrgane, potem sledi območje kjer je prišlo do poškodovanja celic (celice so obarvane s PI). Bel črtkan krog na desni sliki prikazuje horizontalno projekcijo maksimalnega radija mehurčka. Merilo je 20 µm. (c) Binarizirane mikroskopske slike pred in po kolpasu mikromehurčka ter binarne slike odtrganih in poškodovanih celic. Moder črtkan krog predstavlja horizontalno projekcijo maksimalnega radija kavitacijskega mehurčka. Merilo je 20 µm. (d) Verjetnost odtrganja (modri stolpci ) in poškodovanja (oranžni stolpci) v odvisnosti od brez-dimenzijske razdalje mikromehurček – celica δ. (e) Verjetnost poškodovanja za ne-odtrgane celice (oranžni stolpci) v odvisnosti od brez-dimenzijske razdalje mikromehurček – celica δ. Rezultati predstavljajo 15 eksperimentalnih ponovitev z maksimalnimi radiji (Rr,max) mehurčkov med 11,1 in 24,4 µm, mediana Rr,max=15,4 µm, brez-dimenzijska razdalja mikromehurček – stena (γ) je bila med 0,15 in 0,58, mediana γ=0,25. Skupni število celic je bilo 8646, od tega je bilo 294 primerov odtrganja celic in 257 primerov poškodovanja celic. Stolpci prikazujejo mediana vrednosti, napake so prikazane kot 1. in 3. kvartil verjetnosti za dogodek. Pri obeh grafih (d in e) verjetnost za poškodovanje celic pod δ<0.2 niso prikazane ker so bile vse celice v tem območju odtrgane . Vpliv kavitacijskega mikromehurčka na okoliške pritrjene bakterijske celice E. coli je prikazan na Slika 7b. Bakterije so bile enakomerno razporejene po opazovanem vidnem polju s celično gostoto 0,15±0,03 celic/µm2. Magnetne kroglice so bile pozicionirane v bližino pritrjenih celic kjer smo izbrani magnetni kroglici z laserskim pulzom ustvarili zarodni mikromehurček. Stabilen mikromehurček je bil izpostavljen tlačnim valovom, ki so nastali ob visokonapetostni razelektritvi. Kavitacijski mikromehurček je agresivno zrastel in implodiral, kar je povzročilo v središču mehurčka popolno odtrganje celic, kateremu je sledilo območje pritrjenih a poškodovanih celic, ki so se obarvale z membransko nepropustnim fluorescentnim barvilom propidijev jodid. Črtkan krog predstavlja horizontalno projekcijo maksimalnega radija mehurčka, ki smo ga pridobili iz zajema slik na hitri kameri. Območje poškodb celic korelira s projiciranim horizontalnim maksimalnim radijem R r,max. Po kolapsu mikromehurčka so bili trije možni izidi: celico odtrga, celica ostane pritrjena a poškodovana (obarvajo se s PI) ter mehurček ni imel vpliva na celico – celica je so ostala pritrjena in se ni obarvala s PI. Z računalniško analizo mikroskopskih slik smo lahko identificirali posamezne celice, ki smo jim v binarni obliki določili položaj na mikroskopski sliki. Združeni rezultati petnajstih eksperimentalnih ponovitev kolapsa mikromehurčka v bližini bakterijskih celic so prikazani na Slika 7d-e. Za primerjavo rezultatov med različnimi ponovitvami smo uporabili brez-dimenzijsko razdaljo med mikromehurčkom in celico δ. Ko je vrednosti δ=1, to pomeni da je bakterijska celica bila na robu maksimalnega radija mikromehurčka. V primeru vrednosti 0≤ δ≤1 se je celica nahajala znotraj R r,max, v primeru vrednosti δ nad 1 pa je to pomenilo, da se je celica nahajala zunaj R r,max mehurčka. Rezultati kažejo da je verjetnost za odtrganje celic pri δ ≤0,2 zelo 96 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 velika, saj je bila večina celic odtrganih, neodvisno od R r,max. Pri vrednostih δ>0,2 se je verjetnost odtrganja celic zmanjševala eksponentno, verjetnost za odtrganje je bila približno 25 % pri δ=1 in približno 10 % pri δ=1,5. Verjetnost za poškodovanje bakterijske celice je prikazano samo za razdalje δ nad 0,2 saj so pri nižjih vrednostih bile vse celice odtrgane. Verjetnost poškodovanja pri δ=0,2 je bila 100 %, potem pa je sledil hiter eksponentni upad verjetnosti za poškodovanje celice, pri vrednostih δ>1 je bila verjetnost že blizu nič. Rezultati kažejo, da se celice lažje odtrgajo od površine kakor pa poškodujejo – minimalna verjetnost za odtrganje celic gre proti vrednosti δ>2, medtem ko je minimalna verjetno za poškodovanje že pi δ > 0,8. Z računskim modelom smo dobili dodaten vpogled na mehanski vpliv kavitacijskega mikromehurčka na bakterijske celice (Slika 8). Rezultati računskih simulacij za kolaps mikromehurčka ob trdni steni je pokazal na dva možna načina nastanka curka, ki sta odvisna od brez-dimenzijskega parametra razdalje Rr,max in oddaljenosti mikromehurčka od stene. Za mikromehurčke zelo blizu stene γ⪅0,3 rezultati nakazujejo na nastanek hitrega in tankega curka proti steni (Slika 8a, c, f). Tak curek lahko doseže maksimalne hitrosti 1305±76 m/s in brez-dimenzijski radij curka R jet/ R r,max=0,021±0,001. Pri mikromehurčkih ki so bolj oddaljeni od površine ( γ⪆0,4) pa nastane klasičen curek (Slika 8b, d, f), kjer pride do maksimalne hitrosti 64±8 m/s in razmerja R jet/ R r,max=0,30±0,02. Eksperimentalno smo opazili le nastanek klasičnega curka, medtem ko hitrega in tankega curka najverjetneje zaradi tehničnih omejitev hitre kamere nismo zaznali. Primerjava eksperimentalnega in računskega časovnega poteka spreminjanja radija je prikazano na Slika 8e. Eksperimentalni rezultati brez-dimenzijske projekcije radija R * r se skladajo z rezultati numerične simulacije. Manjše odstopanje je vidno pri začetni fazi rasti mikromehurčka ( t*<-0,9). Opažena razlika je lahko zaradi nihanja v okoliškem začetnem tlaku, ki bi lahko bil drugačen kakor smo predpostavili v simulacijah. Ker se maksimalne mehanske sile zgodijo v fazi kolapsa mikromehurčka (Zeng in sod. 2018), smo nastale razlike v začetnih fazah kavitacijskega mehurčka za naš primer zanemarili. Rezultate za računsko pridobljeno tokovno polje smo potrdili z eksperimentalnimi rezultati določanja tokovnega polja s stekleno kroglico pri rasti in kolapsu posameznega kavitacijskega mikromehurčka. Eksperimentalni rezultati tokovnega polja so prikazani na Slika 8g kjer so prikazane tudi maksimalne in povprečne hitrosti v odvisnosti od δ. Z večanjem razdalje od centra mehurčka vidimo nelinearen padec hitrosti toka. Primerjava eksperimentalnih in računskih rezultatov je predstavljena na Slika 8h kjer so eksperimentalne vrednosti nižje od računskih kar je pričakovano zaradi omejitev časovne ločljivosti zajema slik s hitro kamero. 97 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Z validiranim računskim modelom smo izračunali vršne vrednosti strižne napetosti in hidrodinamske sile, ki jih kavitacijski mikromehurček vrši na bakterijsko celico v odvisnosti od δ. Slika 8i prikazuje izračunane rezultate za strižno napetost in hidrodinamsko silo v odvisnosti od δ, kjer lahko vidimo pri δ<0,2 velik raztros rezultatov, ki nakazuje na veliko variabilnost mehanske sile v območju nastanka curka. Veliko variabilnost sil lahko razložimo zaradi pojava dveh tipov curka, ki imata različne hitrosti curkov. Maksimalne mehanske obremenitve v neposrednem središču curka ( δ<0.1) lahko dosežejo vrednosti do desetine µN in nekaj MPa. Pojavnost maksimalnih mehanskih obremenitev se časovno sklada z nastankom curka in posledično nastankom radialnega toka stran od centra. Omenjene sile pa so zelo kratkožive (nanosekundna časovna skala), saj so v grobem en do dva velikostna razreda krajše kakor sam proces kavitacije mikromehurčka, ki traja nekaj µs. Vršne mehanske obremenitve znatno upadejo z oddaljevanjem od centra mehurčka, tako da pri razdalji δ=1 pričakujemo 20 kPa strižne napetosti in 70 nN hidrodinamske sile. Rezultati se skladajo z eksperimentalnimi rezultati kjer v neposredni bližini centra mehurčka opazimo popolno odtrganje celic, ki nato hitro prične upadati z oddaljevanjem od centra mikromehurčka. 98 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Slika 8: Računski model kavitacije mikromehurčka in določanje strižne napetosti ter hidrodinamske sile ob kavitaciji mikromehurčka. (a,b) Numerični rezultati oblike nastanka dveh tipov curka v času udarca curka v steno ( z=0). (a) prikazuje obliko hitrega in tankega curka (𝛾=0,27), slika (b) prikazuje nastanek klasičnega curka (𝛾=0,59). (c) 99 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Časovni potek spreminjanja oblike pri kavitaciji mikromehurčka pri 𝛾=0,27 kjer nastane hiter in tanek curek. Rdeč križec predstavlja center začetnega stanja mehurčka. Konture oblik mehurčka ustrezajo časovnim točkam pri maksimalnem radiju mikromehurčka (𝑡∗=0), pri polovici maksimalne velikosti 1 (𝑡∗=0,895), pri nastanku hitrega in tankega curka ob udarcu ob steno ( ∗=0,964) in ob kolapsu preostalega 2 𝑡3 toroidnega mehurčka (𝑡∗4=1,004). (d) Časovni potek spreminjanja oblike pri kavitaciji mikromehurčka pri 𝛾=0,59 kjer nastane klasičen curek. Rdeč križec predstavlja center začetnega stanja mehurčka. Konture oblik mehurčka ustrezajo časovnim točkam pri maksimalnem radiju mikromehurčka (𝑡∗=0), polovici 1 maksimalne velikosti (𝑡∗=0,831), ob nastanek hitrega in tankega curka ob udarcu ob steno ( ∗=0,961) in 2 𝑡3 ob kolapsu preostalega toroidnega mehurčka (𝑡∗4=1,008). (e) Časovni potek spreminjanja radija mikromehurčka R * r. Rezultati so predstavljeni v brezdimenzijski obliki, kjer je radij mehurčka R r skaliran na maksimalni radij mikromehurčka Rr,max, čas pa je centriran na točko, ko doseže mikromehurček maksimalen radij ob času t max in skaliran na čas kolapsa mehurčka t c. Eksperimentalni rezultati (0,20≤ γ≤0,46, povprečen γ=0,30, N=24) so prikazani s črnimi točkami s predvideno mersko napako (±0,67 µm). Rezultati numeričnih simulacij predstavlja moder pas (0,18≤ γ≤0,48, povečanje Δγ≈0,1, N=4), ki se dobro sklada z eksperimentalnimi rezultati. Preostali numerični rezultati numerične analize pri kolapsu mikromehurčka ob steni: R r,max=16,3±0,5 µm, t max=1,58±0,05 µs, in t c=1,73±0,07 µs. (f) Numerični rezultati maksimalne hitrosti curka v odvisnosti od parametra oddaljenosti mikromehurček-stena γ. Obarvana območja predstavljajo nastanek karakteristične oblike curka: rumeno območje predstavlja nastanek klasičnega curka ( γ>0,4), rdeče predstavlja območje nastanka hitrega in tankega curka ( γ<0,3). (g) Modre točke predstavljajo eksperimentalne vrednosti hitrosti premikanja kroglice, oranžne točke predstavljajo vrednosti v časovnem povprečju. Število eksperimentalnih ponovitev, N=37. (h) Primerjava eksperimentalnih in numeričnih rezultatov za maksimalne in povprečne hitrosti. Rezultati kažejo na dobro skladnost rezultatov za maksimalne hitrosti 𝑣𝑚𝑎𝑥 (modre točke, RMSE=0,79, R2=0,73, N=37) in za povprečne hitrosti 𝑣𝑎𝑣𝑔 (oranžne, RMSE=0,75, R2=0,77, N=37). (i) Izračunane maksimalne vrednosti hidrodinamske sile (modra) in strižne napetosti (oranžna) na pritrjeno bakterijo v odvisnosti od brez-dimenzijske razdalje med mikromehurčkom in celico δ. Rezultati predstavljajo rezultate simulacij za prameter γ med 0,15 in 0,58. Rezultati so predstavljeni na logaritemski x in y osi. Korelacijo med nastalimi vršnimi mehanskimi silami (hidrodinamska sila in strižna napetost) in verjetnostjo za odtrganje ali poškodovanje celic smo dobili s prileganjem potenčnemu modelu (enačba 22 in 23). Parametri modela predstavljajo mejne mehanske obremenitve za verjetnost celičnega odtrganja ali celične poškodbe (Slika 9). Mejne vrednosti za odtrganje bakterije so bile pri 15,9 nN za hidrodinamsko silo in 5 kPa za strižno napetost. Pri poškodovanju celice je bila mejna vrednost hidrodinamske sile 59,5 nN pri strižni napetosti 17,5 kPa. Pri obremenitvah nad 1 µN in 145 kPa lahko pričakujemo, da bo večina celic odtrganih, medtem ko je visoka verjetnost za poškodovanje celic pri obremenitvah, ki presegajo 1,5 µN in 217 kPa. Te vrednosti lahko pri kolapsu mikromehurčka prevedemo v brez-dimenzijsko razdaljo mikromehurčka in celice δ kjer lahko pričakujemo visoko verjetnost odtrganja ali poškodovanja do razdalje δ 0,41 in 0,38. Oblika curka (hiter in tanek ali klasičen) ni imela signifikantnega vpliva na verjetnost dogodka. 100 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Slika 9: Mehanske obremenitve bakterijske celice pri kolapsu mikromehurčka Verjetnost za odtrganje bakterije (a) in poškodbo bakterije (b) v odvisnosti od hidrodinamske sile. Rdeča črta predstavlja najboljšo napoved modela skupaj s 95 % intervalom zaupanja (rdeče območje okrog črte). Parametri modela za odtrganje R2=0.89 in RMSE=0.11, ter za poškodovanje: R2=0.66 in RMSE=0.16. Verjetnost za odtrganja bakterije (c) in poškodbo bakterije (d) v odvisnosti od strižne napetosti. Rdeča črta predstavlja najboljšo napoved modela skupaj s 95 % intervalom zaupanja (rdeče območje okrog črte). Parametri modela za odtrganje R2=0.88 in RMSE=0.12, ter za poškodovanje: R2=0.66 in RMSE=0.16. (e) izračunane mejne vrednosti za odtrganje in poškodovanje celice za primer hidrodinamske sile in strižne napetosti. Spodnja meja predstavlja vrednosti, pod katero je zelo majhna verjetnost za dogodek ( Pdog~0), zgornja meja pa predstavlja vrednosti, okrog katere je zelo velika verjetnost za dogodek ( Pdog~1). 101 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 3 RAZPRAVA IN SKLEPI 3.1 RAZPRAVA Ob kolapsu kavitacijskega mehurčka lahko pride do pojava ekstremnih fizikalno-kemijskih razmer kot so: visoke temperature, nastanek mikrocurkov, tlačnih valov ter nastanek prostih radikalov (Brennen, 1995; Chahine in Hsiao, 2015; Koda in sod., 2003; Suslick in sod., 2011). Omenjene ekstremne razmere bi lahko imele vpliv na obstoj bioloških kontaminantov kot so bakterije ali virusi. Rezultati uporabe kavitacije v literaturi nakazujejo na značilno zmanjšanje živosti bakterijskih celic. Vendar se objavljeni rezultati o učinkovitosti kavitacije znatno razlikujejo, od nekdaj deset odstotkov zmanjšanja števila živih celic pa vse do nekaj logaritmov (Zupanc in sod., 2019). Ker točen mehanizem kavitacije na bakterijske celice ni poznan in ni znano katera komponenta celične stene najbolj pripomore k odpornosti na kavitacijo smo v nalogi proučili vlogo posameznih struktur celične stene pri odpornosti na kavitacijo. 3.1.1 Lipidni dvosloj Primarno tarčno mesto celičnih poškodb predstavlja citoplazemska membrana, ki je v osnovi fosfolipidni dvosloj. Kot najenostavnejši modelni sistem za bakterijsko celico smo izbrali fosfolipidne vezikle, ki so sferične strukture, obdane z lipidnim dvoslojem. Obenem smo kot bakterijski model uporabili tudi sferoplaste bakterijske celice E. coli, z intaktno citoplazemsko membrano, kjer je bila odstranjena zunanja membrana in peptidoglikanski sloj. Lipidni vezikli, v mikrometrskem velikostnem rangu, s fluorescentno označeno notranjostjo vezikla so vsebovali 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoholin (DOPC) lipide. Eksperimentalni rezultati z DOPC vezikli kažejo, da so vezikli v puferski raztopini stabilne strukture. Za raztopino, ki je shranjena pri sobni temperaturi in v temi je stabilnost več kot 40 dni. Stabilnost vezikla je odvisna od temperature. Segrevanje raztopine z vezikli do 60 °C ni dalo značilnih sprememb v številu veziklov, medtem, ko je z višanjem temperature prišlo do zmanjšanja števila veziklov. S spremembo temperature se spremeni gibanje molekul v dvosloju, kar vpliva na drugačno pakiranje acilnih verig in polarnih glav, tako z dvigom temperature povzročimo tanjšanje dvosloja in povečanje fluidnosti membrane ter nastanek različnih lipidnih faz (Coderch in sod., 2000; Leonenko in sod., 2004; Simons in Sampaio, 2011). Pri znižanju temperature na -18 °C in -80 °C je bil ravno tako viden upad v številu, obenem pa se je zmanjšal tudi povprečni volumen vezikla. Z nižanjem temperature lahko pride do faznega prehoda med gelsko in tekočo kristalinsko fazo (Balleza, 2012). Znano je, da pri prehodni temperaturi pride do znatnega znižanja upogibne trdnosti, dvosloj se stanjša in permeabilnost za vodo se poveča (Nagle in Wilkinson, 1978; Needham in Evans, 1988). DOPC ima tranzicijsko temperaturo pri -16,5 °C, zato je pri sobni temperaturi v tekoči kristalinski obliki (Ulrich in sod., 1994). Prehod iz dvosloja 102 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 iz tekoče v gelsko fazo je v našem primeru povzročilo razpad veziklov. Rezultati kažejo, da so na fazne prehode bolj občutljivi večji vezikli. Obenem ni bilo opazne signifikantne razlike pri -18 °C in -80 °C kar nakazuje, da na stabilnost veziklov predvsem vpliva prehod med različnimi fazami pakiranja lipidov in ne toliko vrednost temperature. V primeru spremembe ionske jakosti ali osmolarnosti raztopine se stabilnost lipidov zmanjša. Npr. pri spremembi osmolarnosti (dodatek glukoze) se je zmanjšalo število veziklov, kar kaže na ireverzibilne poškodbe oziroma razpad membrane. Pri spremembi ionske jakosti se je poleg zmanjšanja števila veziklov pojavilo tudi puščanje veziklov, kar je bilo vidno kot nižja povprečna intenziteta posameznega vezikla. Podoben učinek kot pri dodatku glukoze je bil opazen tudi pri dodatku etanola v raztopino veziklov. Opažena povečana občutljivost na kemijske spremembe okoliške tekočine kažejo na nestabilnost raztezanja membrane, saj se lipidni dvosloj razpre oziroma raztrga že pri relativnih raztezkih med 2 in 4 % (Boucher in sod., 2007; Doktorova in sod., 2019). Zaradi fluidne organizacije dvosloja lahko pride do začasne poškodbe dvosloja v obliki pore in puščanja snovi iz notranjosti vezikla v okolico, ki se lahko zapre (Leontiadou in sod. 2004) kar smo opazili pri spremembi ionske jakosti. Dodatek prostih radikalov se je izkazal kot učinkovit način za propad dvosloja. Ob dodatku 1 mM raztopine železovega (II) suflata (FeSO4) in 1 mM raztopine vodikovega peroksida (H2O2) je prišlo do propada večine veziklov. Do razpada veziklov je prišlo ob presežku kritične koncentracije stresorja. Prosti radikali povzročijo oksidacijo lipidov, kar povzroči reorganizacijo lipidov v dvosloju in nastanek por (Cwiklik in Jungwirth, 2010). Reorganizacija membrane z oksidiranimi lipidi vodi v propad veziklov. Pri dodajanju amfifilnih molekul (surfaktant Triton X-100) v raztopino veziklov smo opazili znatno zmanjšanje števila veziklov. Podobno kot pri prostih radikalih je bilo potrebno doseči oziroma preseči kritično koncentracijo detergenta v raztopini, da je prišlo do popolnega razpada veziklov. Začetni učinek na vezikle smo opazili pri koncentraciji 0,21 mM, medtem ko je bilo viden popoln propad veziklov pri koncentraciji 0,85 mM. Molekule detergenta so v večini primerov inverzno konične oblike in s svojim vstavljanjem v membrane povzročijo stres v lipidnem dvosloju (Atilgan in Sun, 2007). Z višanjem koncentracije molekul v dvosloju inducirajo nastanek por in pri koncentracijah nad kritično micelarno koncentracijo pride do raztapljanja dvosloja s strani detergenta (Inque in Kitagawa, 1976). Za boljše razumevanje mehanizma razpada in odziva dvosloja po dodatku detergenta smo vezikle opazovali direktno pod mikroskopom. Pri direktnem opazovanju raztapljanja DOPC veziklov z detergentom Triton X-100 pod mikroskopom smo opazili izrazito dinamično spreminjanje oblik veziklov pred popolnim raztapljanjem lipidnega dvosloja. Dodatek detergenta k sferičnim veziklom je povzročil oscilacije in uvihanje membrane, kar je vodilo v nastanek različnih hruškastih in diskastih oblik, sledilo je 103 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 izoblikovanje izrastkov in tetrov iz veziklov. Hitre in dinamične spremembe pri dodatku detergenta so vodile v raztapljanje vezikla. Za natančnejšo razlago opaženih oblik smo spremembe oblik opisali z numeričnimi simulacijami. Molekule detergenta se preferenčno vstavljajo v področja kjer je večja ukrivljenost, kjer ta področja dodatno stabilizirajo, obenem pa lahko povzročijo nastanek nanotub, endoveziklov ali reorganiziranja membrane (Atilgan in Sun, 2007; Drab in sod., 2019; Fošnarič in sod., 2003; Kralj-Iglič in sod., 2000; Kralj-Iglič in sod., 2005). Ker je pri lipidnih dvoslojih »flip-flop« počasen proces (Sudbrack in sod., 2011) je sprememba spontane ukrivljenosti dvosloja zaradi vstavljanja molekul detergenta glavno gonilo za spremembe sferične oblike vezikla. Opazovan fenomen dinamike oblik smo razložili z enostavnim matematičnim modelom Monte Carlo v neravnovesnem stanju. Oblike lipidnega dvosloja smo spreminjali na podlagi dveh parametrov: koncentracije detergenta v dvosloju in privlaka med molekulami detergenta (združevanje molekul v gruče). Pri nizkih koncentracijah detergenta detergent povzroči nastanek rahlih uvihavanj membrane, ki so se povečala z večanjem koncentracije detergenta v dvosloja. Če se molekule detergenta združeni v skupke inducirajo dodatno ukrivljenost membrane, ki se kaže kot nastanek izrastkov. Izrazito velike fluktuacije lipidnega dvosloja, ki smo jih opazili po dodatku detergenta, bi lahko bile povzročene tudi s fizikalnimi in mehanskimi stresorji, s katerimi se redno srečujemo pri laboratorijskem delu, ki bi lahko vplivali na stabilnost veziklov in sferoplastov. Pipetiranje z avtomatsko pipeto se vsakodnevno uporablja v raziskovalnih laboratorijih in je lahko tudi vir mehanskega stresa v obliki strižnih sil. Učinek pipetiranja na stabilnost veziklov je bil viden pri 500 ali več ponovitvah pipetiranja, kar je pri rutinskem laboratorijskem delu nerealno visoko. Drugi vir strižnih napetosti je vorteksiranje vzorca kjer 4 minutno vorteksiranje pri rotacijski hitrosti do 3000 obratov na minuto (ang. rpm) ni imelo signifikantnega učinka na vezikle. Rezultati kažejo kot da se je z vorteksiranjem celo povečalo skupno število veziklov. Obenem pa se volumen in intenziteta veziklov nista spremenila, zato predvidevamo, da se je vzorec zgolj dobro premešal in je bil posledično bolj homogen kakor začetni vzorec. V primeru, da smo v vzorec dodali steklene kroglice in nato vorteksirali je bil učinek na lizo veziklov znatno višji. Z dodatkom kroglic v vzorec smo povišali strižne napetosti (Lee in sod., 1998), kar je bilo za vezikle uničujoče. Apliciranje striga z rotacijskim reometrom do strižnih hitrosti (ang. »shear rate«) 18500 s-1 ni dalo signifikantne spremembe v stabilnosti veziklov. De Haas in sod. (1997) so pokazali, da se majhni 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoholin (DMPC) vezikli obnašajo podobno kot suspenzija trdnih delcev v redčenih raztopinah, kjer je majhna verjetnost, da pride do medsebojnih interakcij med vezikli in v bolj koncentrirani raztopini, kjer interakcija med vezikli ni več zanemarljiva. To nakazuje da strižne sile na makroskopski skali ne bodo imeli znatnega vpliva na mikroskopske delce. Pri eksperimentih so bili vezikli stabilni vse do 1800 bar hidrostatičnega tlaka, ko se je število veziklov zmanjšalo medtem, ko ni bilo 104 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 signifikantnega zmanjšanja intenzitete fluorescence veziklov. Molekulam v dvosloju se ob povišanem statičnem tlaku (1000 bar) zmanjša površina in volumen – največji delež sprememb se zgodi v nepolarnem repu. Ob povišanju tlaka se debelina dvosloja bistveno ne spremeni, pričakujemo pa lahko zmanjšanje upogibne konstante (Ding in sod. 2017). Upogibni elastični modul določa fleksibilnost in obliko membrane, vpliva na strukturo in nastanek nelamelarnih lipidnih faz ter vpliva na druge fizikalne in funkcijske lastnosti membrane (Marsh, 2006). Na upogibnost membran najbolj vpliva sestava dvosloja – na primer negativno nabiti 1,2-dioleoil-sn-glicerol-3-fosfat (DOPG) lipidi se lažje oblikujejo v vezikel kakor nevtralno nabiti lipidi (Nomura in sod., 2001; Nomura in sod., 2004), obenem pa odbojne sile med negativno nabitimi glavami lipidov povečajo razmak, kar dodatno stabilizira sferično strukturo vezikla (Kato in sod., 2015). Iz eksperimentalnega pregleda vpliva mehanskih in fizikalno kemijskih stresorjev izhaja, da so lipidni vezikli in sferoplasti zelo občutljive strukture, na katere ima večina uporabljenih stresorjev vpliv, če so le aplicirani dovolj dolgo ali v zadostni količini. Iz tega izhaja, da bi ekstremne razmere, ki se zgodijo ob pojavu kavitacije, lahko imele uničujoč učinek na lipidne vezikle. Da bi to dokazali smo uporabili dva tipa kavitacije – akustično in hidrodinamsko. Oba tipa kavitacije sta učinkovito uničila lipidne vezikle. Pri hidrodinamski kavitaciji smo uporabili mikro-kavitacijsko napravo z brizgami in krožno zožitvijo premera 0,6 mm, kjer je bila ocenjena povprečna hitrost potovanja vzorca približno 50 m/s. Skozi zožitev smo vzorec potisnili do največ 100-krat, ko je po stotih ciklih propadla večina veziklov. Poleg tega je razvidno, da se je po tretiranju zmanjšal povprečen volumen veziklov. Ker se intenziteta fluorescence ni bistveno spremenila je verjetno med kavitacijo prišlo do nastanka defektov ter puščanja veziklov. To bi lahko imelo pomembne posledice pri uničevanju bakterijskih celic. V primeru, da pride do puščanja citoplazmske membrane bi to lahko pomenilo uničenje celice. Analiza distribucije veziklov po velikosti tekom kavitiranja veziklov nakazuje, da se distribucija veziklov spremeni – večji vezikli so bolj dovzetni na razpad. Po stotih ciklih ostanejo v suspenziji predvsem vezikli z manjšim premerom (okrog enega mikrometra). Pri akustični kavitaciji smo uporabili dve napravi: ultrazvočno banjico in ultrazvočno sondo. Ultrazvočna banjica je imela manjši vpliv na vezikle kakor ultrazvočna sonda. Z večanjem izhodne moči pri banjici smo opazili povečan razpad veziklov, vendar se veziklom ni spremenila povprečna fluorescenca, kar nakazuje da pri nežnejšemu tipu akustične kavitacije ne pride tako pogosto do puščanja veziklov. Pri ultrazvočni sondi smo spreminjali jakost soniciranja z nastavljanjem amplitude nihanja. Pri 3 µm amplitudi ultrazvok ni imel znatnega vpliva na vezikle, medtem ko je pri 6 µm amplitudi bil že viden signifikanten upad v številu veziklov. Z nadaljnjim višanjem amplitude je bil opažen eksponenten upad števila veziklov. Nižanje intenzitete fluorescence veziklov kaže na večje puščanje veziklov pri višjih amplitudah, kar je pričakovano, saj akustično valovanje povzroči nastanek oscilacij in začasnih por v dvosloju (Pong in sod., 2006). V primeru, da pore zrastejo preko kritične velikosti pa lahko pride do razpada vezikla 105 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 (Marmottant in sod., 2008). Predviden mehanizem razpada veziklov pri soniciranju je zaradi pojava sonoporacije (nastanka por zaradi osciliranja tlaka) ter pojava kavitacije (Miller in sod., 2002; Schroeder in sod., 2009). Distribucija veziklov po velikosti kaže, da z višanjem amplitude ultrazvoka večji vezikli prej razpadejo. To je v skladu z literaturo saj se akustična kavitacija uporablja za pripravo majhnih unilamelarnih veziklov iz velikih multilamelarnih veziklov (Saunders in sod., 1962; Schroeder in sod., 2009). 3.1.2 Bakterija E. coli in celice z oslabljenimi komponentami celične stene Rezultati dinamike lipidnih veziklov so pokazali, da lahko prihaja do znatnih fluktuacij lipidnega dvosloja zaradi delovanja zunanjih dejavnikov. Pri tem lahko lipidni dvosloj razpade, kar bi imelo pogubne posledice za bakterijske celice. Običajno bakterijska celica ni izgrajena samo iz lipidnega dvosloja ampak še iz dodatnih struktur, ki lipidni dvosloj stabilizirajo. Zaradi tega bi lahko bilo delovanje kavitacije na bakterijske celice oslabljeno. Stresorji, ki so se izkazali za zelo učinkovite pri veziklih (kavitacija in vorteksiranje s kroglicami) imajo lahko znaten vpliv na živost bakterijskih celic E. coli (Cameron in sod., 2008; Ramanan in sod., 2008; Šarc in sod., 2018; Ho in sod., 2006; Sun in sod., 2018; Zupanc in sod., 2019). Po drugi strani ima detergent Triton X-100 manjši učinek na celice kot pri veziklih saj se vgradi v zunanjo membrano, jo oslabi in poveča prepustnost za druge molekule (na primer antibiotike), podobno kot dodatek kelatorja EDTA (Miki in Hardt, 2013), vendar je njegova vgradnja v citoplazemsko membrano manjša. Zanimivo, da centrifugiranje celic pri 15000x g povzroči propad 36 % celic E. coli (Gilbert in sod., 1990; Pembrey in sod., 1999), kar je primerljivo z učinkom centrifugiranja veziklov. Razvoj hidrodinamske kavitacijske naprave v laboratorijskem merilu za proučevanje vplivov različnih celičnih struktur na živost bakterijskih celic se je izkazal za zelo težak izziv. V okviru doktorske disertacije nismo uspeli razviti naprave, kjer bi se pojavila kavitacija izključno na testni zožitvi in ne tudi na črpalki ter bi pri tem z uporabo mililitrskih delovnih volumnov dobili zanesljivo delovanje naprave ter vzdržljivost oziroma tesnjenje vseh komponent pri visokih tlakih. Uporabljena mikro-kavitacijska naprava z zožitvijo, ki smo jo uporabili pri veziklih ni zdržala zadostnega števila pasaž, ki so potrebne pri eksperimentih z bakterijskimi celicami. Pri eksperimentih z bakterijo E. coli na potisni postaji s stisnjenim zrakom in Venturijevo zožitvijo (napravo so uporabili Filipić in sod. (2022)) ni prišlo do znatnih sprememb v živosti bakterijske kulture E. coli po 1000 pasažah. Pri napravi na rotor-stator črpalki (napravo so uporabili Kolbl Repinc in sod. (2021)) prav tako ni bilo znatnih sprememb v živosti bakterijske kulture E. coli po 1000 pasažah. Pri napravi z Venturi zožitvijo in zobato črpalko (napravo so uporabili pri Podbevšek in sod. (2022)) pa smo ugotovili, da že sama črpalka in pretočni ventil vplivata na živost bakterij E. coli kar pomeni, da ne moremo zagotovo 106 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 ločiti efekt hidrodinamske kavitacije na zožitvi od ostalih stresorjev, ki se pojavljajo na ventilu in črpalki. Poleg tega smo v raziskovalni skupini razvili dodatno mikro-kavitacijsko napravo, kjer preliminarni rezultati kažejo na znaten učinek hidrodinamske kavitacije na bakterije, vendar trenutna vzdržljivost naprave predstavlja eno izmed glavnih šibkih točk, ki onemogoča rutinsko uporabo naprave v raziskovalne namene. Zaradi omenjenih težav smo v nadaljevanju doktorske disertacije vpliv posameznih bakterijskih struktur na živost bakterij pri kavitaciji testirali z uporabo akustične kavitacije z ultrazvočno sondo. Pri soniciranju bakterije E. coli z ultrazvočno sondo (20 kHz) in pri 15 µm amplitudi smo opazili eksponenten trend upada živosti celic s konstanto razpada ( k). Hitro deleče celice (celice v eksponenti fazi rasti) so bile bolj dovzetne na propad zaradi soniciranja kakor nedeleče celice v stacionarni fazi rasti. Konstanta razpada celic ( k) v eksponentni fazi rasti je znašala 0,16±(0,02) ter za celice v stacionarni fazi rasti 0,03±(0,01). Torej, 90 s soniciranje bakterijske kulture v eksponentni fazi rasti je povzročilo zmanjšanje števila živih celic za 3,4 log, medtem ko je pri celicah v stacionarni fazi rasti prišlo do zmanjšanja števila celic za 1,4 log. Do tega verjetno pride, ker se posameznim plastem celične stene spremeni sestava in struktura. Na primer pri citoplazemski membrani se s spremembo fiziološkega stanja spremeni sestava dvosloja, kar povzroči bolj urejeno stanje molekul v dvosloju, peptidoglikanski sloj ima več navzkrižnih povezav in krajše peptidne verige, LPS sloj se poveča in tudi sinteza EPS gradnikov se poveča (Amsler in sod., 1993; Glauner in sod., 1988; Ivanov in Fomchenkov, 1989; Olsén in sod., 1989; Pisabarro in sod., 1985; Souzu, 1986;). Da bi preverili vpliv posamezne plasti celične stene na stabilnost celic pri kavitaciji smo spreminjali lastnosti posameznih plasti z dodajanjem kemijskih reagentov ali manipulacije celic na genetskem nivoju. EPS sloj smo modificirali z delecijo genov, ki imajo zapis za tri glavne komponente EPS sloja: kodrasti proteini, PGA in kolanska kislina. Konstanta eksponentnega upada k se ni signifikantno razlikovala v primerjavi z divjim tipom, tako v eksponentni kot v stacionarni fazi rasti. EPS sloj je najbližja struktura okoliški tekočini oziroma kavitacijskim mehurčkom, zato bi lahko zaradi svoje mehke strukture dušil vpliv kavitacije na celice (Gao in sod., 2014). Torej bi lahko pričakovali povečano občutljivost mutant na soniciranje, vendar v našem primeru deloma oslabljena kapsula ni bila bolj občutljiva na sonikacijo. Kapsularne komponente se obsežneje sintetizirajo pod stresnimi pogoji (na primer stacionarna faza rasti), vendar pri naših eksperimentih tudi pri mutantah v stacionarni fazi rasti nismo opazili signifikantnih sprememb v stabilnosti bakterijskih kulture v primerjavi s celicami divjega tipa. Zunanja membrana služi kot dodatna bariera za prehod molekul, obenem pa v kombinaciji s peptidoglikanom služi kot opora celici pri osmotskem tlaku (Delcour, 107 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 2008; Rojas in sod., 2018). Konstanta eksponentnega upada k se tudi v primeru oslabitve zunanje membrane ni signifikantno spremenila v primerjavi z divjim tipom. Da je dejansko prišlo do reorganizacije zunanje membrane v eksponentno rastočih bakterijskih celicah smo posredno videli preko povečane prepustnosti membransko nepropustnega fluorescentnega barvila propidijevega jodida saj se je pri eksponentnih celicah izpostavljenimi z EDTA povečal delež celic obarvanih s propidijevim jodidom. Pri celicah v stacionarni fazi rasti ni prišlo do signifikantne razlike v prepustnosti barvila v celice. Iz dobljenih rezultatov lahko zaključimo, da zunanja membrana nima večjega vpliva na odpornost celic na kavitacijo. Peptidoglikan je bil dolgo poznan kot edina struktura v celici, ki daje celici mehansko oporo (Auer in Weibel, 2017; Madigan in sod., 2008). V naši raziskavi je oslabljen peptidoglikan znatno senzibiliziral celice za propad pri soniciranju. Za reorganizacijo in oslabitev peptidoglikana smo uporabili dve učinkovini: encim lizocim in antibiotik cefaleksin, ki imata različna načina delovanja na peptidoglikanski sloj. Dodatek lizocima ni signifikantno vplival na konstanto eksponentnega upada. Morfološko se celice tudi niso signifikantno spremenile. Kot smo omenili zgoraj, je zunanja membrana fizična pregrada za prehod velikih molekul v celico (npr. lizocima), zato je verjetno, da lizocim ni prišel do peptidoglikana in ga razgradil. V primeru dodatka cefaleksina eksponentnim celicam pa vidimo signifikantno zvišanje konstante razpada ( k = 0,53±(0,08)). Učinek antibiotika na celicah smo videli kot morfološko spremembo, kjer so bile celice daljše in imele filamentozno rast (dimenzije 5,84±(0,96) × 0,86±(0,10) μm). Ob dodatku cefaleksina stacionarnim celicam vpliv na propad po soniciranju ni viden, saj deluje antibiotik samo na rastoče celice. Če povečamo prepustnost zunanje membrane (kombinacija lizocima in EDTA) pa lahko opazimo učinek lizocima, saj se spremeni oblika celic iz paličaste v sferično obliko (sferoplasti). Sferoplasti, pripravljeni iz eksponentnih celic so signifikantno bolj dovzetni za propad pri soniciranju kakor celice divjega tipa v eksponentni fazi rasti. Ravno tako je bila signifikantna razlika pri sferoplastih pripravljenih iz stacionarnih celic ( k=0,05±(0,01)) v primerjavi celicami divjega tipa v stacionarni fazi rasti. Pri sferoplastih pride do večinske razgradnje peptidoglikanskega sloja in zunanje membrane, tako da ostane intaktna samo notranja membrana (Birdsell in Cota-Robles, 1976; Clifton in sod., 2015; Onitsuka in sod., 1979; Voss, 1964). Zanimivo je, da so bili sferoplasti iz stacionarnih celic bolj stabilni v primerjavi z eksponentnimi sferoplasti, kar nakazuje na bolj rigidno in odporno citoplazemsko membrano stacionarnih celic. V primeru inkubacije celic z antibiotikom cefaleksin, kateri povzroči tvorbo dolgih filamentov, ter EDTA in lizocima nastanejo gigantski sferoplasti, ki imajo premer 4,5±(1,0) μm. Tako pripravljeni sferoplasti so zelo dovzetni za propad med soniciranjem, konstanta k je znašala 0,76±(0,32). Podoben učinek soniciranja je bil viden pri liposomih, ki so po velikosti in strukturi zelo podobni uporabljenim veziklom. 108 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 To kaže, da samo citoplazemska membrana ni učinkovita pri zaščiti bakterij pred kavitacijo. Potrebne so še druge strukture celične stene. Dobljeni rezultati nedvoumno kažejo, da ima odločilno vlogo pri stabilnosti celic E. coli pri kavitaciji sprememba peptidoglikanskega sloja. Ostali sloji kot ošibljena zunanja membrana ali spremenjen EPS sloj nimata znatnega vpliva. Ker se je pri modifikacijah celične stene spremenila tudi oblika in velikost celic: paličasta, sferična in filamenti bi lahko imela oblika celice tudi vpliv na učinkovitost kavitacije. Primerjava velikosti celic in konstante k kaže na odvisnost konstante k od velikosti celic, kar nakazuje, da bi lahko imela tudi velikost celic vpliv na stabilnost celic pri soniciranju. Lahko bi sklepali, da so večje celice bolj občutljive. Podoben trend smo opazili tudi pri veziklih, kjer so najprej razpadli večji vezikli. Med soniciranjem lahko pride do nastanka prostih reaktivnih radikalov, vendar pričakujemo, da pri soniciranju z nizkimi frekvencami, kot smo ga uporabili v tej disertaciji, ne nastane večja količina prostih radikalov (Jordens in sod., 2016; Mason in sod., 2011; Nasseri in sod., 2017). Za dokaz nastanka radikalov med soniciranjem smo naredili eksperiment z ditiotreitol (DTT), vendar z omenjeno metodo nismo zaznali signifikantne koncentracije prostih radikalov med soniciranjem. Prav tako z lovilcem radikalov – metanolom nismo zaznali signifikantne spremembe v koncentraciji prostih radikalov. Zato sklepamo, da nastanek prostih radikalov ni glavni mehanizem inaktivacije bakterij pri nizko-frekvenčni akustični kavitaciji. 3.1.3 Vpliv individualnega kavitacijskega mehurčka na individualno bakterijsko celico Opazovanje efekta gruče kavitacijskih mehurčkov na lipidne vezikle, sferoplaste ali bakterije ni enostavno. Problem tako pri hidrodinamski kot pri ultrazvočno inducirani kavitaciji je velika količina energije, ki je s kavitacijo vnesemo v sistem in povzroča intenzivno mešanje lipidnih veziklov oziroma bakterij, kar znatno znižuje ločljivost pri direktnem opazovanju pojava. Za podrobnejše in bolj osnovno razumevanje pojava kavitacije in vpliva kavitacije na bakterijske celice se je potrebno osredotočiti na vpliv posameznega mikrometrskega kavitacijskega mehurčka na individualne bakterijske celice, kar zaradi tehničnih omejitev doslej še ni bilo raziskano. Ker se interakcija med mikromehurčkom in bakterijo dogaja na mikrometrski prostorski in mikrosekundni časovni skali pomeni, da smo na skrajni meji zaznavanja, ki jo omogoča trenutna tehnika. V tej disertaciji smo razvili novo eksperimentalno metodo in opisali kolaps kavitacijskega mikromehurčka z matematičnim modelom, kar predstavlja popolnoma nov pogled na kavitacijo in njen vpliv na bakterijske celice. Poleg tega je ta raziskava ponudila nov vpogled v mehanski odziv bakterijske celice na visokofrekvenčno mehansko obremenitev. 109 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Odziv bakterij na visokofrekvenčne dražljaje so v preteklosti že poskušali raziskovati, vendar so raziskovalci prišli do nasprotujočih ugotovitev. Npr. visokofrekvenčno elektromagnetno polje ni imelo vpliva na rast bakterij Staphylococcus epidermidis in S. aureus, medtem ko je imelo vpliv na Pseudomonas aeruginosa (Salmen in sod., 2018; Wietzikoski Lovato in sod., 2018). Avtorji so inaktivacijo bakterij večinsko pripisali temperaturnemu gradientu in nastanku ROS. Čeprav je pri kavitaciji možen nastanek ROS, je bilo pokazano, da je za generacijo ROS pri gruči mehurčkov potreben daljši čas in veliko kavitacijskih dogodkov (Mason in sod., 2011; Podbevšek in sod., 2022; Yusof in sod., 2016). Zaradi kratkoživosti radikalov in majhne verjetnosti za njihov nastanek je detekcija ROS pri kolapsu enega mehurčka na mikrometrski in nanosekundni prostorski in časovni skali tehnično izredno zahtevna. V nalogi smo nastanek prostih radikalov pri kolapsu mikromehurčka zanemarili. Ob kolapsu mehurčka lahko v centru mehurčka temperatura naraste vse do nekaj tisoč Kelvinov (Suslick in sod., 1999). Vendar je takšen dvig temperature zelo kratkoživ in je omejen na center mehurčka. Iz preteklih računskih raziskav je znano, da je lahko termičen učinek na bakterijsko celico znaten le v primeru ko je celica v neposrednem kontaktu z mehurčkom (Zevnik in Dular, 2020; Zevnik in Dular, 2021; Zevnik in Dular 2022). Mejna plast s spremenjeno temperaturo okoli mehurčka je zelo majhna, poleg tega je temperaturni dvig pod kritično temperaturo za bakterijske celice, zato lahko temperaturni učinek ob kolapsu posameznega mikromehurčka na bakterijske celice zanemarimo (Mitsuzawa in sod., 2006). Po drugi strani pa bi mehanski stresorji (kompresijske in strižne obremenitve) lahko imeli vpliv na bakterijske celice. Eksperimentalni in računski rezultati kažejo, da je glavni vir mehanskih obremenitev pri kavitaciji nastanek curka proti trdni površini. Ob udarcu curka v steno površine se spremeni smer toka radialno od centra curka, kar povzroči lokalno visoke tlake in strižne sile na pritrjene okoliške bakterijske celice. Pokazali smo, da je maksimalni strig, ki ga občuti bakterija, v rangu MPa in hidrodinamska sila v rangu nekaj deset µN. Pri tako velikih vršnih obremenitvah lahko pride do poškodb bakterij. Eksperimentalni rezultati kažejo na tri možne izide ob kolapsu mehurčka na okoliške pritrjene celice – celice se odtrgajo od površine, celice ostanejo pritrjene ampak so poškodovane ali pa kavitacijski mehurček nima efekta na celico. Verjetnost za odtrganje in poškodovanje celic eksponentno pada v odvisnosti od brez-dimenzijske razdalje med mehurčkom in bakterijo. Podoben efekt je bil opažen tudi pri raziskavah z evkariontskimi celicami (Gac in sod., 2007; Hellman in sod., 2008; Jasikova in sod., 2019; O’Connor in sod., 2021; Ohl in sod., 2006; Rau in sod., 2006; Zhou in sod., 2012). Pri kolapsu posameznega mehurčka smo iz eksperimentalnih meritev in matematičnega modela določili, da je za odtrganje celice potrebna hidrodinamska sila v razponu med 15,9 nN in 1 µN. Pri hidrodinamski sili pod 15,9 nN ne pričakujemo odtrganja, medtem ko pri silah nad 1 µN je verjetnost za odtrganje zelo visoka (P = 1). Silo odtrganja 110 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 bakterijske celice E. coli iz steklene površine obdane s PLL so izmerili Potthoff in sod. (2015) s FluidFM metodo, s katero so določili silo odtrganja posamezne bakterijske celice 14 nN. Izmerjena vrednost s FluidFM metodo je primerljiva z našimi rezultati. Mehanske obremenitve, ki so bile potrebne za poškodovanje celice so bile višje, hidrodinamska sila za poškodovanje celic je bila v rangu med 59,6 nN in 1,5 µN. Sila za poškodovanje celic se sklada z rezultati raziskovalcev Shiu in sod. (1999), ki so določili silo lize celic E. coli pri 3,6 µN. Izračunane najvišje mehanske obremenitve so bile locirane v centru mehurčka zaradi nastanka visokoenergijskega curka, usmerjenega proti steni. Ti rezultati se skladajo z eksperimentalnimi rezultati, ki kažejo na popolno odtrganje celic v samem centru mehurčka. Maksimalna strižna napetost ob steni pri kolapsu mikromehurčka je bila 145 kPa, ki se sklada z raziskavami Zeng in sod. (2018), kjer so poročali o maksimalni strižni napetosti okrog 100 kPa. Računski model je za naš primer pokazal, da ob kolapsu mikromehurčka nastaneta dva tipa curkov: klasičen curek (Dular in sod. 2019) ter zelo tanek in hiter curek (Koch in sod., 2021; Lechner in sod., 2019; Lechner in sod., 2020; Reuter in Ohl, 2021). Klasičen curek je bil viden na eksperimentalnih posnetkih medtem ko nastanek hitrega in tankega curka nismo opazili. Hiter curek je sicer že bil eksperimentalno opažen, vendar pri bistveno večjih (milimetrskih) mehurčkih (Koch in sod., 2021; Lechner in sod., 2020; Reuter in Ohl, 2021a). Iz naših rezultatov izhaja, da tip curka ni imel signifikantnega vpliva na stopnjo odtrganja ali poškodovanja celic E. coli. Rezultati tudi kažejo, da morajo biti bakterije pri kavitaciji v stiku ali v neposredni bližini mehurčka, da ima kavitacija učinek na celice. Kljub temu, da je pri gruči kavitacijskih mehurčkov večina mehurčkov izven mejne razdalje za uničenje bakterij je statistično gledano dovolj neposrednih interakcij mehurček-bakterija, da kavitacija uspešno uničuje bakterije v večjem volumnu in dalj časa trajajoči kavitaciji (npr. pri več pasažah). Seveda se lahko pri gruči kavitacijskih mehurčkov ustvarijo še dodatne mehanske obremenitve, kot so mikro in makro tokovi, ki lahko imajo lahko tudi uničujoč učinek na bakterije (Marmottant in Hilgenfeldt, 2003). Za povečanje učinkovitosti kavitacije je torej potrebno povečati možnosti direktne interakcije med mehurčki in bakterijami – npr. s povečanjem števila pasaž, časa treniranja, ali gostote generiranih mikromehurčkov. Določanje mejnih vrednosti hidrodinamske sile in strižne napetosti pri uničevanju bakterijskih celic E. coli predstavlja pomemben korak pri optimizaciji obstoječih in novih metod čiščenja odpadnih voda, ki temeljijo na mehanskem uničenju. Natančnejše razumevanje vpliva posameznega mehurčka na bakterijske celice bo zagotovo omogočilo napredek kavitacijske tehnologije v aplikativne namene čiščenja odpadnih voda. 111 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Prikazani rezultati v okviru doktorske disertacije nakazujejo, da ima hidrodinamska kavitacija uničujoč učinek na fosfolipidne vezikle in bakterijske celice E. coli. Kljub pozitivnim rezultatom pa smo opazili, da je uporaba hidrodinamske kavitacije še vedno tehnično zahteven proces, kjer je ponovljivost pojava kavitacije in zanesljivost kavitacijskih naprav še vedno eden izmed glavnih omejujočih problemov ki upočasnjujejo napredek tehnologije v aplikativne namene. V okviru naloge smo poskusili natančneje opredeliti proces inaktivacije bakterijskih celic s pomočjo kavitacije. Za aplikativne namene pa bi bilo v prihodnje potrebno preveriti energijsko učinkovitost samega procesa, pri čemer bi lahko umestili učinkovitost čiščenja s kavitacijo med ostale procese čiščenja vode. Direktna primerjava akustične in hidrodinamske kavitacije kaže, da imata metodi različen trend inaktivacije bakterijskih celic. Pri akustični kavitaciji pride na začetku tretiranja do hitrega razpada celic, ki se s časom ustali. Pri hidrodinamski kavitaciji pa je uničenje pri začetnih ciklih tretiranja nižje, nato pa eksponentno narašča z višanjem števila ciklov. Možen vzrok za razliko v fenomenu bi lahko bil različen mehanizem delovanja, ali pa je razlika samo posledica različnega vnosa energije. Poleg tega spremembe v parametrih, kot so amplituda ter frekvenca pri akustični kavitaciji, oziroma spreminjanje geometrije zožitve ter tlačne razlike pri hidrodinamski kavitaciji, lahko različno vplivajo na potek inaktivacije bakterijskih celic. Vplivi teh parametrov pa tudi niso dobro poznani. Čeprav so celice v eksponentni fazi rasti bolj dovzetne na propad zaradi kavitacije in je lažje določati razlike med različnimi tretmaji, najdemo v okolju večinoma celice v stacionarni fazi rasti. Zato bi se bilo potrebno v nadaljnjih raziskavah še bolj osredotočiti na te celice v izogib precenjevanju učinkovitosti kavitacije pri realnih okoljskih vzorcih. V namene čiščenja odpadnih voda bi bil najboljši izkupiček določenega procesa popolno uničenje celic oziroma sterilizacija. Doseganje popolnega uničenja bakterijskih celic s kavitacijo je najverjetneje malo verjetno saj pri procesu vplivamo samo na določen delež celotnega volumna vzorca, kar pomeni da bi v teoriji potrebovali enormno število ciklov oziroma časa izpostavljenosti kavitaciji. Obenem se z manjšanjem števila celic najverjetneje tudi manjša verjetnost, da bo prišlo do kolapsa mehurčka v neposredni bližini bakterijske celice, kar bi še dodatno podaljšalo čas tretiranja vzorca s kavitacijo. Doprinos k odpornosti na kavitacijo posameznih komponent celične stene smo pokazali pri modelnem predstavniku gram negativne skupine bakterij s tankim slojem peptidoglikana. Gram pozitivne bakterijske celice imajo drugačno sestavo celične stene, kjer je peptidoglikanski sloj veliko debelejši, vendar nimajo zunanje membrane, zato bi bilo potrebno za natančnejše razumevanje odziva celic na kavitacijo preveriti tudi gram pozitivne bakterijske kulture ter druge specializirane oblike bakterijskih celic – na primer spore. Razvoj metode generiranja posameznega mehurčka na mikrometrski skali predstavlja novo metodo, ki omogoča širok spekter uporabe v namene raziskav mehanske karakterizacije bakterijskih celic. Možnost manipuliranja kavitacijskega mehurčka na mikroskopski skali je lahko obetavna metoda za brezkontaktno manipulacijo v mikrofluidnih sistemih, mikrostrukturiranje površin ali delcev. Obenem 112 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 bi generiranje mehanskih sil na tako kratki časovni in majhni prostorski skali lahko pripomoglo k zelo natančnim manipulacijam posameznih celic, kjer bi lahko uporabili kavitacijski mehurček kot »nano« skalpel. Z njim bi lahko hitro in natančno ustvarili lokalno poškodbo ali manipulacijo celice za vnos določenih molekul v celico ali selektiven izpust določenih komponent iz celice. Pritrjene bakterije predstavljajo enostaven model začetne faze nastanka biofilma, zato bi lahko omenjena metoda služila tudi za karakterizacijo mehanskih lastnosti biofilma na mikroskopski skali. 3.1.4 Pregled doprinosa kandidata in ostalih sodelavcev v okviru doktorske disertacije Doktorand Žiga Pandur je naredil vse eksperimente in analizo rezultatov v okviru doktorske naloge, kjer sta mentor (prof. dr. David Stopar) in somentor (prof. dr. Matevž Dular) s svetovanjem, sprotnim spremljanjem raziskav usmerjala in pomagala doktorandu skozi celoten študij. Dodatno je za celostno razumevanje interakcije med kavitacijskim mehurčkom in bakterijsko celico v disertacijo vključeno delo sodelavca dr. Jure Zevnik, ki je opravil numerične simulacije kolapsa posameznega mehurčka ob togi steni in določil maksimalne sile ob kolapsu mehurčka na bakterijsko celico. Celotno raziskovalno delo skupaj z numeričnimi simulacijami o interakciji med kavitacijskim mehurčkom in bakterijskimi celicami je bilo poslano v pregled za objavo v znanstveni reviji Science Advances. Pri spremljanju dinamike raztapljanja veziklov z detergentom Triton X-100 je dr. Mitja Drab s sodelavci opravil matematičen opis sprememb oblik vezikla zaradi vstavljanja detergenta v fosfolipidni dvosloj, kjer je bilo skupaj z eksperimentalnim opazovanjem pojava objavljeno kot raziskovalen članek v znanstveni reviji Biophysical Journal. 3.2 SKLEPI Na podlagi rezultatov doktorske disertacije podajamo naslednje sklepe. Lipidni dvosloj (vezikel in sferoplast) je izredno podajna in neraztezna struktura. Zato imata sprememba osmotskega tlaka in ionske jakosti raztopine vpliv na stabilnost lipidnega dvosloja. Pipetiranje in vorteksiranje niso imeli znatnega vpliva na stabilnost veziklov, razen ko smo število ponovitev povečali nerealno visoko. Znaten vpliv na stabilnost lipidnega dvosloja ima vgradnja detergentskih molekul, ki povzroči hitre oscilacije lipidnih veziklov. Za mehanistično razlago oscilacij lipidnih dvoslojev smo uporabili Monte Carlo simulacijo, ki je imitirala neravnotežne pogoje ob začetku raztapljanja lipidnega dvosloja in upoštevala postopno vgradnjo detergenta v lipidni dvosloj. Kavitacija je imela največji učinek na lipidne vezikle in sferoplaste, manj na bakterije v eksponenti fazi in najmanj na bakterije v stacionarni fazi rasti. S selektivnim 113 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 spreminjanjem komponent bakterijske celične stene smo ugotovili, da ima največji efekt na odpornost bakterij na kavitacijo peptidoglikanski sloj. Po odstranitvi peptidoglikanskega sloja so bakterije postale zelo občutljive za kavitacijo, primerljive občutljivosti lipidnega dvosloja. Z razvojem nove metode generiranja posameznega kavitacijskega mikromehurčka smo preučili vpliv interakcije med izbranim mikromehurčkom in bakterijsko celico. Rezultati kažejo, da ima kavitacijski mehurček učinek le če je generiran v neposredni bližini bakterijske celice saj se verjetnost za poškodbo celice znotraj projicirane brez-dimenzijske razdalje bakterija-mikromehurček eksponentno zmanjšuje. Z eksperimentalnimi rezultati smo kalibrirali rezultate matematičnega modela in določili mejne vrednosti hidrodinamske sile in strižne napetosti za poškodovanje bakterijske celice oziroma njeno odtrganje iz površine po interakciji s kavitacijskim mikromehurčkom. 3.2.1 Potrditev hipotez V nalogi sta bili postavljeni dve raziskovalni hipotezi. 1: Gruča hidrodinamsko generiranih kavitacijskih mehurčkov v primerjavi z običajnimi fizikalno-kemijskimi stresorji učinkovito lizira fosfolipidne vezikle, sferoplaste in bakterijske celice. Ta hipoteza je bila potrjena. Gruča hidrodinamsko generiranih mehurčkov je zelo učinkovito orodje za uničenje fosfolipidnih veziklov in sferoplastov. Hidrodinamska kavitacija je uspešna metoda za uničenje bakterijskih celic, vendar bi bilo potrebno njeno učinkovitost za uspešno komercializacijo povečati. 2: Z implozijo posameznega kavitacijskega mehurčka v bližini bakterijske celice pride do porušenja membranske integritete, kar omogoča lizo bakterijske celice. Ta hipoteza je bila v celoti potrjena. Interakcija med kavitacijskim mikromehurčkom in bakterijsko celico uniči integriteto bakterijske membrane. Sproščena energija omogoča odtrganje bakterijskih celic in njihovo poškodovanje v obsegu, ki je enak premeru kavitacijskega mikromehurčka. Za potrditev hipoteze je bilo potrebno razviti popolnoma nov eksperimentalni pristop, ki omogoča generiranje kavitacijskega mikromehurčka v neposredni bližini izbrane bakterijske celice na časovni skali nanosekunde in prostorski skali mikrometra. 114 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 4 POVZETEK (SUMMARY) 4.1 POVZETEK Kavitacija je pojav parnih mehurčkov v kapljevini, ki hitro in agresivno implodirajo. Sprva je bila kavitacija sprejeta kot nezaželen pojav, saj so se ob kavitaciji turbinskih motorjev pojavile vibracije, povišana glasnost turbinskih motorjev ter erozija materialov (Franc in Michel, 2004). Vendar sproščena energija ob kolapsu mehurčkov lahko uničuje tudi druge materiale, na primer biološke delce kot so bakterijske celice in druge biološke kontaminante. V času ko čista voda postaja luksuzna dobrina, postaja kavitacija ena izmed potencialnih tehnologij za čiščenje in obdelavo vode. Čeprav je bilo narejeno že veliko raziskav na temo uporabe kavitacije za učinkovito razgradnjo bioloških kontaminant v vodi, se trenutno objavljeni rezultati znatno razlikujejo kar nakazuje na slabo razumevanje delovanja kavitacije na biološke vzorce (Zupanc in sod., 2019). Kljub uporabi kavitacije v namene inaktivacije bakterijskih celic in drugih bioloških kontaminant se še vedno smatra sam proces kot fenomen »črne škatlice« kjer ni točno poznan mehanizem delovanja kavitacije na bakterijske celice. Pri hidrodinamski kavitaciji se lokalno pojavljajo ekstremne razmere kot so visoka temperatura, nastanek mikrocurkov z visokimi hitrostmi, tlačnih valov, kisikovih reaktivnih zvrsti (Brennen, 1995; Chahine in Hsiao, 2015; Koda in sod., 2003; Suslick in sod., 2011). Bakterijska celica je visoko-reguliran sistem omejen s celično steno, ki omogoča kemijsko, fizikalno in mehansko stabilnost na okoljske stresorje (Madigan in sod., 2008). Širok spekter ekstremnih razmer ob kolapsu in hiter potek kolapsa mehurčkov še dodatno otežuje določitev točnega mehanizma interakcije kavitacije in bakterijske celice. Poleg tega tudi ni znano katera celična struktura najbolj pripomore k stabilnosti celice pri kavitaciji. V disertaciji smo s selektivnim pristopom raziskali vpliv kavitacije na lipidne vezikle, bakterijske celice E. coli in celice z modificiranimi komponentami posameznih slojev v celični steni. Citoplazemska membrana je eden izmed najbolj osnovnih slojev za obstoj celice saj nadzoruje prehod velikih in nabitih molekul v in iz celice. Gram negativne bakterijske celice imajo poleg citoplazemske membrane še tanek peptidoglikanski sloj, zunanjo membrano in EPS sloj (Madigan in sod., 2008). Kot najbolj enostaven model bakterijske celice smo vzeli DOPC fosfolipidni vezikel, ki je imel v lumnu fluorescentno barvilo (natrijev fluoresceinat), kar nam je omogočilo zajem slik s fluorescentnim konfokalnim mikroskopom. Takšna membranska struktura je osmotsko nestabilna, obenem pa je izredno podajna struktura. Zaradi velikega nabora ekstremnih pogojev, ki nastanejo ob pojavu kavitacije, smo najprej preverili stabilnost veziklov na posamezne fizikalno-kemijske in mehanske stresorje. Fizikalno-kemijski stresorji kot so sprememba ionske jakosti, osmolarnosti so imeli vpliv na stabilnost veziklov. Sprememba temperature je na vezikle imela vpliv le v primeru znižanja temperature pod temperaturo faznega prehoda lipidov (pod -16 °C) ali pri dvigu temperature na 80 °C. 115 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Vstavljanje molekul detergenta v lipidni dvosloj se je izkazal kot zelo učinkovit način uničenja veziklov. Zaradi vstavljanja molekul detergenta v dvosloj je prišlo do znatnih fluktuacij v dvosloju vezikla kar smo opazili kot dinamične spremembe oblike vezikla pred popolnim raztapljanjem. Nastanek neravnovesnega stanja v dvosloju smo poskusili mehanistično razložiti z računskim modelom. Z Monte Carlo računskim modelom smo predpostavili dve spremenljivki, na podlagi katerih smo dobili primerljive rezultate sprememb oblik. Na dinamiko spreminjanja oblik pri dodatku detergenta vpliva koncentracija molekul detergenta v dvosloju in tendenca združevanja detergenta v gruče. Predstavljen model nam je omogočil bolj podroben mehanističen vpogled v možne fluktuacije vezikla (lipidnega dvosloja) pred popolno porušitvijo dvosloja. Mehanski stresorji, ki so prisotni pri rutinskem laboratorijskem delu (pipetiranje in vorteksiranje) niso imeli znatnega vpliva na stabilnost, razen pri zelo visokem številu ponovitev. Centrifugiranje je imelo majhen vpliv na stabilnost veziklov. Povišan hidrostatski tlak ravno tako ni imel učinka. Apliciranje striga z rotacijskim reometrom do hitrosti striženja 18500 s-1 ni vplivalo na stabilnost veziklov. Ko smo dodali v vzorec steklene kroglice in vzorec vorteksirali smo uspešno razbili lipidne vezikle. Rezultati so pokazali, da so vezikli razmeroma stabilni na nizke ionske spremembe, temperaturne spremembe, centrifugiranje in izredno občutljivi na vstavljanje amfifilnih molekul ter visoke strižne sile. Izpostavitev veziklov hidrodinamski kavitaciji se je izkazala kot učinkovita metoda za uničenje veziklov. Vezikle smo izpostavili še akustični kavitaciji s sonotrodo in akustični kavitaciji v ultrazvočni banjici. Akustična kavitacija z ultrazvočno banjico je imela nižji učinek kot kavitacija s sonotrodo. Bakterija E. coli je Gram negativna paličasta bakterija, katere sevi so lahko potencialni patogeni za človeka in se lahko prenašajo preko kontaminiranih vodnih okolij. Bakterijskim celicam smo selektivno oslabili ali odstranili izbrane komponente celične stene: EPS sloj, ošibili zunanjo membrano ter spremenili ali odstranili peptidoglikanski sloj. Kot vir kavitacije smo uporabili akustično kavitacijo s sonotrodo, kjer smo pokazali, da je glavna komponenta, ki daje odpornost na kavitacijo peptidoglikanski sloj. Fiziološko stanje bakterijskih celic znatno vpliva na stabilnost celic pri soniciranju – celice v stacionarni fazi rasti so značilno bolj odporne kakor celice v eksponentni fazi rasti. V primeru, ko celici odstranimo zunanjo membrano in peptidoglikanski sloj (sferoplasti), dobimo podoben odziv na soniciranje kot pri liposomih. Kavitacija se je izkazala, kot učinkovit postopek za uničevanje lipidnih veziklov, sferoplastov, bakterijskih celic ali bakterijskih celic s spremenjeno sestavo celične stene. Vezikli in sferoplasti so bili najbolj dovzetni za propad pri kavitaciji, medtem ko je pri bakterijskih celicah bilo potrebno dovesti več energije za viden učinek. Za odpornost bakterij na kavitacijo je najbolj pomemben peptidoglikanski sloj, saj se dovzetnost za propad zelo poveča, če ga odstranimo. Pri bakterijah z odstranjenim peptidoglikanom postane stabilnost celic na kavitacijo zelo podobna stabilnosti veziklov. Spreminjanje EPS sloja 116 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 ali zunanje membrane nima znatnega vpliva na stabilnosti bakterijske celice pri soniciranju. Vpliv posameznega mikromehurčka na bakterijsko celico še ni bil proučen v literaturi. V nalogi smo razvili metodo za generiranje mikrometrskih kavitacijskih mehurčkov, kar nam je omogočilo neposredno preučevanje interakcije bakterijske celice s kavitacijskim mehurčkom. Z uporabo optične pincete za natančno pozicioniranje zarodnega mehurčka smo lahko hitro in natančno z visokonapetostno razelektritvijo sprožili kavitacijski mikromehurček. Kavitacijski mehurček je imel drastičen vpliv na pritrjene bakterijske celice v neposredni bližini kolapsa mehurčka. Kolaps kavitacijskega mikromehurčka je povzročil odtrganje bakterijskih celic v centru ekspandirajočega mehurčka. Coni odtrganih bakterij je sledila cona s poškodovanimi, a pritrjenimi celicami. Vplivno območje mehurčka za poškodovanje celice je bilo znotraj maksimalnega radija mehurčka, medtem ko je bla verjetnost za odtrganje celic na dvakratni razdalji maksimalnega radija mehurčka. Z računalniško analizo mikroskopskih slik bakterijskih celic smo določili verjetnost za izid interakcije med mehurčkom in bakterijo (odtrgana, poškodovana ali nespremenjena). S pomočjo matematičnega modela smo dobili bolj natančen in dodaten vpogled v dinamiko procesa kavitacije mikromehurčka. Ugotovili smo dva mehanizma nastanka curkov, ki sta odvisna od razdalje mehurčka od trdne stene (γ). Pri mikromehurčkih, ki so zelo blizu stene (γ<0,3) se ustvari hiter in tanek curek, kar je bilo eksperimentalno opaženo pri milimetrskih mehurčkih, v našem primeru generiranja mikromehurčkov pa jih nismo opazili, najverjetneje zaradi resolucijske omejitve uporabljene opreme. Pri mikromehurčkih, ki so oddaljeni od stene γ>0,4 nastane klasičen kavitacijski curek, ki smo ga opazili tudi pri naših eksperimentih. Simulacije so pokazale, da so največje mehanske obremenitve pojavijo ob nastanku curka. Na podlagi modela smo lahko ocenili mejne hidrodinamske sile ter strižne napetosti za odtrganje ali poškodovanje celice, ki sta znašala 1 µN in 145 kPa za odtrganje celice ter 1,5 µN in 217 kPa za poškodovanje celice. Natančnejše razumevanje vpliva posameznega mehurčka na bakterijske celice bo omogočilo napredek kavitacijske tehnologije v aplikativne namene čiščenja odpadnih voda. Poleg tega novo razvita metoda generiranja kavitacijskih mikromehurčkov in določanje mehanskih lastnosti bakterijske celice omogoča nov vpogled v delovanje bakterijskega sveta. 4.2 SUMMARY A sudden decrease in pressure triggers the formation of vapor and gas bubbles inside a liquid medium (also called cavitation). This leads to many key engineering problems: material loss, noise, and vibration of hydraulic machinery (Franc and Michel, 2004). On the other hand, cavitation is a potentially useful phenomenon: the extreme conditions are increasingly used for a wide variety of applications such as surface cleaning, enhanced chemistry, and wastewater treatment (i.e. bacteria eradication and virus 117 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 inactivation). Despite the significant progress, a large gap persists between the understanding of the mechanisms that contribute to the effects of cavitation and its application. Although engineers are already commercializing devices that employ cavitation, we are still not able to answer the fundamental questions such as: how bubbles can clean, disinfect, enhance chemical activity, kill bacteria or what makes bacteria resistant to cavitation phenomena? In this thesis we approached these fundamental questions by selective modifications of bacterial cell wall structures or by study of simplified cell models such as spherical lipid bilayer structures (vesicles, spheroplasts). Lipid vesicles are widely applied in research, diagnostics, medicine, industry, and as biological model systems. We showed for the first time the effect of hydrodynamic cavitation on vesicle stability and compare it to the effect of well described chemical, physical and mechanical treatments. Fluorescein loaded giant 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) lipid vesicles were treated by hydrodynamic cavitation which is a promising new method for the inactivation of biological samples. Hydrodynamic treatment was compared to various chemical, physical, and mechanical stressors such as ionic strength and osmolarity agents (glucose, Na+, Ca2+, and Fe3+), free radicals, shear stresses (pipetting, vortex mixing, rotational shear stress), high pressure, electroporation, centrifugation, surface active agents (Triton X-100, ethanol), microwave irradiation, heating, freezing-thawing, ultrasound (ultrasonic bath, sonotrode). The fluorescence intensity of the individual fluorescein loaded lipid vesicles was measured with confocal laser microscopy. The distribution of lipid vesicle size, vesicle fluorescence intensity, and the number of fluorescein loaded vesicles was determined before and after the treatment with different stressors. The different environmental stressors were ranked in order of their relative effect on liposome fluorescein release. Of all tested chemical, physical and mechanical treatments for stability of lipid vesicles, the most detrimental effect on vesicles stability had hydrodynamic cavitation, vortex mixing with glass beads and ultrasound. This work provides a benchmark for lipid vesicle robustness to a variety of different physico-chemical and mechanical parameters important in lipid vesicle preparations and applications. It is known that giant vesicles undergo dynamic morphological changes when exposed to a detergent. The solubilization process may take multiple pathways. In this work, we identify lipid vesicle shape dynamics before the solubilization of 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine giant vesicles with Triton X-100 detergent. The violent lipid vesicle dynamics was observed with laser confocal scanning microscopy and was qualitatively explained via a numerical simulation. A three-dimensional Monte Carlo scheme was constructed that emulated the nonequilibrium conditions at the beginning stages of solubilization, accounting for a gradual addition of Triton X-100 detergent molecules into the lipid bilayers. We suggest that the main driving factor for 118 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 morphology change in lipid vesicles is the associative tendency of the TR molecules, which induces spontaneous curvature of the detergent inclusions, an intrinsic consequence of their molecular shape. The majority of the observed lipid vesicle shapes in the experiments were found to correspond very well to the numerically calculated shapes in the phase space of the possible solutions. The results give an insight into the early stages of lipid vesicle solubilization by amphiphilic molecules, which is nonequilibrium in nature and very difficult to study. The bacterial cell, however, is more complex structure compared to lipid bilayer and more resistant to cavitation. The applications of cavitation in industrial settings are plagued by the lack of the knowledge of the exact mechanism of action of sonication on bacterial cells, variable effectiveness of cavitation on bacteria, and inconsistent data of its efficiency. In this study we have systematically changed material properties of E. coli cells to probe the effect of different cell wall layers on bacterial resistance to ultrasonic irradiation (20 kHz, output power 6,73 W, horn type, 3 mm probe tip diameter, 1 ml sample volume). We have determined the rates of sonolysis decay for bacteria with compromised major capsular polymers, disrupted outer membrane, compromised peptidoglycan layer, spheroplasts, giant spheroplasts, and in bacteria with different cell physiology. The non-growing bacteria were 5-fold more resistant to sonolysis than growing bacteria. The most important bacterial cell wall structure that determined the outcome during the sonication was peptidoglycan. If peptidoglycan was remodelled, weakened, or absent the cavitation was very efficient. Cells with removed peptidoglycan had sonolysis resistance equal to lipid vesicles and were extremely sensitive to sonolysis. The results suggest that bacterial physiological state as well as cell wall architecture are major determinants that influence the outcome of bacterial sonolysis. To evaluate the effect of cavitation on bacterial cell at a fundamental level, one needs to downscale the cavitation process to a single cavitation bubble which is similar in size to a bacterial cell. Here we present a method to deliver a nanoscale spatial and temporal energy quantum to mechanically remove and destroy the individual bacterial cells. The method allows for accurate and fast positioning of the single microbubble on the individual bacterial cell with optical tweezers and triggering of the single violent microscale cavitation event. The interaction between the single cavitation microbubble and the individual bacterial cell was studied with fluorescence microscopy in real time. The results demonstrate that energy delivered during the single cavitation event destroys or detaches bacteria by shear and hydrodynamic stress loads. Mechanical and numerical models were used to estimate the maximal shear stress and hydrodynamic forces for detachment or survival of the individual bacterium. 119 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 5 VIRI Akhatov I., Lindau O., Topolnikov A., Mettin R., Vakhitova N., Lauterborn W. 2001. Collapse and rebound of a laser-induced cavitation bubble. Physics of Fluids, 13, 10: 2805-2819. Almeida P. F. F., Vaz W. L. C. 1995. Lateral diffusion in membranes. V: Handbook of biological physics. Lipowsky R., Sackmann E. (ur.). Amsterdam, Elsevier: 305-357. Amir A., Babaeipour F., McIntosh D. B., Nelson D. R., Jun S. 2014. Bending forces plastically deform growing bacterial cell walls. Proceedings of the National Academy of Sciences, 111, 16: 5778-5783. Amro N. A., Kotra L. P., Wadu-Mesthrige K., Bulychev A., Mobashery S., Liu G. Y. 2000. High-resolution atomic force microscopy studies of the Escherichia coli outer membrane: Structural basis for permeability. Langmuir, 16, 6: 2789-2796. Amsler, C. D., Cho M., Matsumura P.. 1993. Multiple factors underlying the maximum motility of Escherichia coli as cultures enter post-exponential growth. Journal of Bacteriology, 175: 6238-6244. Annegowda H. V., Bhat R., Min-Tze L., Karim A. A., Mansor S. M. 2012. Influence of sonication treatments and extraction solvents on the phenolics and antioxidants in star fruits. Journal of Food Science and Technology, 49, 4: 510-514. Araújo G. R. d. S., Viana N. B., Gómez F., Pontes B., Frases S. 2019. The mechanical properties of microbial surfaces and biofilms. The Cell Surface, 5: 100028, doi: 10.1016/j.tcsw.2019.100028: 8 str. Atilgan E., Sun S. X. 2007. Shape transitions in lipid membranes and protein mediated vesicle fusion and fission. Journal of Chemical Physics, 126: 095102, doi: 10.1063/1.2483862: 10 str. Auer G. K., Weibel D. B. 2017. Bacterial cell mechanics. Biochemistry, 56, 29: 3710-3724. Azuma Y., Kato H., Usami R., Fukushima T. 2007. Bacterial sterilization using cavitating jet. Journal of Fluid Science and Technology, 2, 1: 270-281. Bangham A. D., Horne R. W. 1964. Negative staining of phospholipids and their structural modification by surface-active agents as observed in the electron microscope. Journal of Molecular Biology, 8, 5: 660-668. 120 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Balasundaram B., Harrison S. T. L. 2006. Study of physical and biological factors involved in the disruption of E. coli by hydrodynamic cavitation. Biotechnology Progress, 22: 907-913. Balleza D. 2012. Mechanical properties of lipid bilayers and regulation of mechanosensitive function. Channels, 6: 220-233. Bavi N., Nakayama Y., Bavi O., Cox C. D., Qin Q. H., Martinac B. 2014. Biophysical implications of lipid bilayer rheometry for mechanosensitive channels. Proceedings of National Academy of Sciences, 111: 13864-13869. Bayer M. E., Thurow H. 1977. Polysaccharide capsule of Escherichia coli: microscope study of its size, structure, and sites of synthesis. Journal of Bacteriology, 130: 911-936. Beveridge T. J. 1981. Ultrastructure, chemistry, and function of the bacterial wall. International Review of Cytology, 72: 229-317. Beveridge T. J., Graham L. L. 1991. Surface layers of bacteria. Microbiological Reviews, 55: 684-705. Bhuyan M. K., Soleilhac A., Somayaji M., Itina T. E., Antoine R., Stoian R. 2018. High fidelity visualization of multiscale dynamics of laser-induced bubbles in liquids containing gold nanoparticles. Scientific Reports, 8: 9665, doi: 10.1038/s41598-018-27663-z: 12 str. Birdsell D. C., Cota-Robles E. H. 1976. Production and ultrastructure of lysozyme and ethylenediaminetetraacetate-lysozyme spheroplasts of Escherichia coli. Journal of Bacteriology, 93, 1: 427-437. Blount Z. D. 2015. The natural history of model organisms: The unexhausted potential of E. coli. eLife, 4: e05826, doi: 10.7554/eLife.05826: 12 str. Borkent B. M., Arora M., Ohl C. D., De Jong N., Versluis M., Lohse D., Mørch K. A, Klaseboer E., Khoo B. C. 2008. The acceleration of solid particles subjected to cavitation nucleation. Journal of Fluid Mechanics, 610: 157-182. Boucher P. A., Joós B., Zuckermann M. J., Fournier L. 2007. Pore formation in a lipid bilayer under a tension ramp: modeling the distribution of rupture tensions. Biophysical Journal, 92: 4344-4355. 121 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Böckmann R. A., Grubmüller H. 2004. Multistep binding of divalent cations to phospholipid bilayers: a molecular dynamics study. Angewandte Chemie International Edition, 43: 1021-1024. Böckmann R. A., Hac A., Heimburg T., Grubmüller H. 2003. Effect of sodium chloride on a lipid bilayer. Biophysical Journal, 85: 1647-1655. Brackbill J. U., Kothe D. B., Zemach C. 1992. A continuum method for modeling surface tension. Journal of Computational Physics, 100, 2: 335-354. Braun V., Rehn K. 1969. Chemical characterization, spatial distribution and function of a lipoprotein (Murein-Lipoprotein) of the E. coli cell wall. The specific effect of trypsin on the membrane structure. European Journal of Biochemistry, 10: 426-438. Braun V., Sieglin U. 1970. The covalent murein-lipoprotin structure of the Escherichia coli cell wall. The attachment site of the lipoprotein on the murein. European Journal of Biochemistry, 13: 336-346. Brennen C.E. 1995. Cavitation and bubble dynamics. Oxford, University Press: 300 str. Cameron M., McMaster L. D., Britz T. J. 2008. Electron microscopic analysis of dairy microbes inactivated by ultrasound. Ultrasonics Sonochemistry, 15: 960-964. Canselier J. P., Delmas H., Wilhelm A. M., Abismaïl B. 2002. Ultrasound emulsification - An overview. Journal of Dispersion Science and Technology, 23: 333-349. Cerecedo L. M., Dopazo C., Gomez-Lus R. 2018. Water disinfection by hydrodynamic cavitation in a rotor-stator device. Ultrasonics Sonochemistry, 48: 71-78. Chahine G. L, Hsiao C. T. 2015. Modelling cavitation erosion using fluid–material interaction simulations. Interface Focus, 5: 20150016, doi: 10.1098/rsfs.2015.0016: 12 str. Chrysikopoulos C. V., Manariotis I. D., Syngouna V. I. 2013. Virus inactivation by high frequency ultrasound in combination with visible light. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 107, 1: 174-179. Claessens M. M. A. E., Van Oort B. F., Leermakers F. A. M., Hoekstra F. A., Stuart M. A. C. 2004. Charged lipid vesicles: effects of salts on bending rigidity, stability, and size. Biophysical Journal, 87: 3882-3893. 122 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Clifton L. A, Skoda M. W. A., Le Brun A. P., Ciesielski F., Kuzmenko I., Holt S. A, Lakey J. H. 2015. Effect of divalent cation removal on the structure of Gram-negative bacterial outer membrane models. Langmuir, 31, 1: 404-412. Coderch L., Fonollosa J., De Pera M., Estelrich J., De La Maza A., Parra J. L. 2000 Influence of cholesterol on liposome fluidity by EPR. Relationship with percutaneous absorption. Journal of Controlled Release, 68, 1: 85-95. Costerton W., Irvin R. T., Cheng K. J. 1981. The bacterial glycocalyx in nature and disease. Annual Review of Microbiology, 35, 1: 299-324. Cwiklik L., Jungwirth P. 2010. Massive oxidation of phospholipid membranes leads to pore creation and bilayer disintegration. Chemical Physics Letters, 486: 99-103. Danese P. N., Pratt L. A., Kolter R. 2000. Exopolysaccharide production is required for development of Escherichia coli K-12 biofilm architecture. Journal of Bacteriology, 182, 12: 3593-3596. de Haas K. H., Blom C., van den Ende D., Duits M. H. G., Haveman B., Mellema J. 1997. Rheological behavior of a dispersion of small lipid bilayer vesicles. Langmuir, 13, 25: 6658-6668. Delcour A. H. 2008. Outer membrane permeability and antibiotic resistance. Biochimica et Biophysica Acta, 1794, 5: 808-816. Ding W., Palaiokostas M., Shahane G., Wang W., Orsi M. 2017. Effects of high pressure on phospholipid bilayers. The Journal of Physical Chemistry B, 121, 41: 9597-9606. Doktorova M., LeVine M. V., Khelashvili G., Weinstein H. 2019. A new computational method for membrane compressibility: bilayer mechanical thickness revisited. Biophysical Journal, 116: 487-502. Drab, M., Stopar D., Kralj-Iglič V., Iglič A. 2019. Inception mechanisms of tunneling nanotubes. Cells, 8, 6: 626, doi: 10.3390/cells8060626: 17 str Drakopoulou S., Terzakis S., Fountoulakis M. S., Mantzavinos D., Manios T. 2009. Ultrasound-induced inactivation of Gram-negative and Gram-positive bacteria in secondary treated municipal wastewater. Ultrasonics Sonochemistry, 16: 629-634. Dular M., Požar T., Zevnik J., Petkovšek R. 2019. High speed observation of damage created by a collapse of a single cavitation bubble. Wear, 418-419: 13-23. 123 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Ellison R. T., Giehl T. J. 1991. Killing of Gram-negative bacteria by lactoferrin and lysozyme. Journal of Clinical Investigation, 88, 4: 1080-1091. Erridge C., Bennett-Guerrero E., Poxton I. R. 2002. Structure and function of lipopolysaccharides. Microbes and Infection, 4, 8: 837-851. Eskin D. G., Al-Helal K., Tzanakis I. 2015. Application of a plate sonotrode to ultrasonic degassing of aluminum melt: Acoustic measurements and feasibility study. Journal of Materials Processing Technology, 222: 148-154. Filipić A., Lukežič T., Bačnik K., Ravnikar M., Ješelnik, Košir T., Petkovšek M., Zupanc M., Dular M., Aguirre I. G. 2022. Hydrodynamic cavitation efficiently inactivates potato virus Y in water. Ultrasonics Sonochemistry, 82: 105898, doi: 10.1016/j.ultsonch.2021.105898: 9 str. Fošnarič, M., Kralj-Iglič V., Bohinc K., Iglič A., May S. 2003. Stabilization of pores in lipid bilayers by anisotropic inclusions. Journal of Physical Chemistry B, 107: 12519-12526. Franc J. P., Michel J. M. 2004. Fundamentals of cavitation. Dordrecht, Springer Netherlands: 306 str. Gac S. L., Zwaan E., van den Berg A., Ohl C. D. 2007. Sonoporation of suspension cells with a single cavitation bubble in a microfluidic confinement. Lab on a Chip. 7, 12: 1666-1672. Gao S., Lewis G. D., Ashokkumar M., Hemar Y. 2014. Inactivation of microorganisms by low-frequency high-power ultrasound: 1. Effect of growth phase and capsule properties of the bacteria. Ultrasonics Sonochemistry, 21, 1: 446-453. Gao Y., Ji Y., Li G., An T. 2016. Theoretical investigation on the kinetics and mechanisms of hydroxyl radical-induced transformation of parabens and its consequences for toxicity: influence of alkyl-chain length. Water Research, 91: 77-85. Gibson K. E. 2014. Viral pathogens in water: occurrence, public health impact, and available control strategies. Current Opinion in Virology, 4: 50-57. Gilbert P., Pemberton D., Wilkinson D. E. 1990. Synergism within poly-hexamethylene biguanide biocide formulations. Journal of Applied Bacteriology, 69: 593-598. 124 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Glauner B., Höltje J. V., Schwarz U. 1988. The composition of the murein of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry, 263: 10088-10095. Godlewska R., Wiśiniewska K., Pietras Z., Jagusztyn-Krynicka E. K. 2009. Peptidoglycan associated lipoprotein (Pal) of Gram-negative bacteria: function, structure, role in pathogenesis and potential application in immunoprophylaxis. FEMS Microbiology Letters, 298: 1-11. Gogate P. R., Pandit A. B. 2005. A review and assessment of hydrodynamic cavitation as a technology for the future. Ultrasonics Sonochemistry, 12, 1-2: 21-27. Gogoi A., Mazumder P., Tyagi V. K., Tushara Chaminda G. G., An A. K., Kumar M. 2018. Occurrence and fate of emerging contaminants in water environment: a review. Groundwater for Sustainable Developement, 6: 169-180. Gregori G., Citterio S., Ghiani A., Labra M., Sgorbati S., Brown S., Denis M. 2001. Resolution of viable and membrane-compromised bacteria in freshwater and marine waters based on analytical flow cytometry and nucleic acid double staining. Applied and Environmental Microbiology, 67: 4662-4670. Griffiths B. S., Philippot L. 2013. Insights into the resistance and resilience of the soil microbial community. FEMS Microbiology Reviews, 37, 2: 112-129. Gumbart J. C., Beeby M., Jensen G. J., Roux B. 2014. Escherichia coli peptidoglycan structure and mechanics as predicted by atomic-scale simulations. PLOS Computational Biology, 10: e1003475, doi: 10.1371/journal.pcbi.1003475: 10 str. Heerklotz H., Epand R. M. 2001. The enthalpy of acyl chain packing and the apparent water-accessible apolar surface area of phospholipids. Biophysical Journal, 80: 271-279. Hellman A. N., Rau K. R., Yoon H. H., Venugopalan V. 2008. Biophysical response to pulsed laser microbeam-induced cell lysis and molecular delivery. Journal of Biophotonics, 1, 1: 24-35. Hiremath P. S., Bannigidad P. 2011. Automated Gram-staining characterisation of bacterial cells using colour and cell wall properties. International Journal of Biomedical Engineering and Technology, 7, 3: 257-265. Ho C. W., Chew T. K., Ling T. C., Kamaruddin S., Tan W. S., Tey B. T. 2006. Efficient mechanical cell disruption of Escherichia coli by an ultrasonicator and recovery of intracellular hepatitis B core antigen. Process Biochemistry, 41: 1829-1834. 125 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Horvat M., Pannuri A., Romeo T., Dogsa I., Stopar D. 2019. Viscoelastic response of Escherichia coli biofilms to genetically altered expression of extracellular matrix components. Soft Matter, 15, 25: 5042-5051. Hunter G., Lucas M., Watson I., Parton R. 2008. A radial mode ultrasonic horn for the inactivation of Escherichia coli K12. Ultrasonics Sonochemistry, 15: 101-109. Inque K., Kitagawa T. 1976. Effect of lipid composition on sensitivity of lipid membranes to Triton X-100. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes, 426: 1-16. Issa R. I. 1986. Solution of the implicitly discretised fluid flow equations by operator-splitting. Journal of Computational Physics, 62, 1: 40-65. Itoh Y., Wang X., Hinnebusch B. J., Preston III J. F. 2005. Depolymerization of ß-1,6-N-acetyl-D-glucosamine disrupts the integrity of diverse bacterial biofilm. Journal of Bacteriology, 187: 382-387. Itoh Y., Rice J. D., Goller C., Pannuri A., Taylor J., Meisner J., Beveridge T. J, Preston III J. F., Romeo T. 2008. Roles of pgaABCD genes in synthesis, modification, and export of the Escherichia coli biofilm adhesin poly-β-1,6-N-acetyl-D-glucosamine. Journal of Bacteriology, 190: 3670-3680. Ivančič T., Jamnik P., Stopar D. 2013. Cold shock CspA and CspB protein production during periodic temperature cycling in Escherichia coli. BMC Research Notes, 6: 248, doi: 10.1186/1756-0500-6-248: 9 str. Ivanov A. I., Fomchenkov V. M.. 1989. Relation between the damaging effect of surface-active compounds on Escherichia coli cells and the phase of culture growth. Mikrobiologiia, 58: 969-975. Jasikova D., Rysova M., Kotek M. 2019. Application of laser-induced breakdown cavitation bubbles for cell lysis in vitro. International Journal of Applied Pharmaceutics, 11, 5: 186-190. Jauffred L., Callisen T. H., Oddershede L. B. 2007. Visco-elastic membrane tethers extracted from Escherichia coli by optical tweezers. Biophysical Journal, 93, 11: 4068-4075. Jeucken A., Molenaar M. R., van de Lest C. H. A., Jansen J. W. A., Helms J. B., Brouwers J. F. 2019. A comprehensive functional characterization of Escherichia coli lipid genes. Cell Reports, 27: 1597-1606. 126 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Jordens J., Bamps B., Gielen B., Braeken L., Van Gerven T. 2016. The effects of ultrasound on micromixing. Ultrasonics Sonochemistry, 32: 68-78. Joyce E. M, Wu X., Mason T. J. 2010. Effect of ultrasonic frequency and power on algae suspensions. Journal of Environmental Science and Health, Part A, 45: 863-866. Kato N., Ishijima A., Inaba T., Nomura F., Takeda S., Takiguchi K. 2015. Effects of lipid composition and solution conditions on the mechanical properties of membrane vesicles. Membranes, 5, 1: 22-47. Kikuchi K., Sugiura M., Nishizawa-Harada C., Kimura T. 2015. The application of the Escherichia coli giant spheroplast for drug screening with automated planar patch clamp system. Biotechnology Reports, 7: 17-23. Koch A. L., Lane S. L., Miller J. A., Nickens D. G. 1987. Contraction of filaments of Escherichia coli after disruption of cell membrane by detergent. Journal of Bacteriology, 169: 1979-1984. Koch M., Rosselló J. M., Lechner C., Lauterborn W., Eisener J., Mettin R. 2021. Theory-assisted optical ray tracing to extract cavitation-bubble shapes from experiment. Experiments in Fluids, 62, 3: 60, doi: 10.1007/s00348-020-03075-6: 19 str. Koda S., Kimura T., Kondo T., Mitome H. 2003. A standard method to calibrate sonochemical efficiency of an individual reaction system. Ultrasonics Sonochemistry, 10: 149-156. Kodama A., Morandi M., Ebihara R., Jimbo T., Toyoda M., Sakuma Y., Imai M., Pu N., Angelova M. I. 2018. Migration of deformable vesicles induced by ionic stimuli. Langmuir, 34, 38: 11484-11494. Koerner M. M., Palacio L. A., Wright J. W., Schweitzer K. S., Ray B. D., Petrache H. I. 2011. Electrodynamics of lipid membrane interactions in the presence of zwitterionic buffers. Biophysical Journal, 101: 362-369. Kralj-Iglič V., Iglič A., Hägerstrand H., Peterlin P. 2000. Stable tubular microexovesicles of the erythrocyte membrane induced by dimeric amphiphiles. Physical Review E, Statistical Physics, Plasmas, Fluids and Related Interdisciplinary Topics, 61: 4230-4234. 127 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Kralj-Iglič V., Hägerstrand H., Veranic P., Jezernik K., Babnik B., Gauger D. R., Iglič A. 2005. Amphiphile-induced tubular budding of the bilayer membrane. European Biophysics Journal, 34: 1066-1070. Kumar P., Libchaber A. 2013. Pressure and temperature dependence of growth and morphology of Escherichia coli: experiments and stochastic model. Biophysical Jurnal, 105, 3: 783-793. Lechner C., Lauterborn W., Koch M., Mettin R. 2019. Fast, thin jets from bubbles expanding and collapsing in extreme vicinity to a solid boundary: A numerical study. Physical Review Fluids, 4, 2: 021601, doi: 10.1103/PhysRevFluids.4.021601: 7 str. Lechner C., Lauterborn W., Koch M., Mettin R. 2020. Jet formation from bubbles near a solid boundary in a compressible liquid: Numerical study of distance dependence. Physical Review Fluids, 5, 9: 093604, doi: 10.1103/physrevfluids.5.093604: 36 str. Lee S. J., Yoon B. D., Oh H. M. 1998. Rapid method for the determination of lipid from the green alga Botryococcus braunii. Biotechnology Techniques, 12: 553-556. Leonenko Z. V., Finot E., Ma H., Dahms T. E. S., Cramb D. T. 2004. Investigation of temperature-induced phase transitions in DOPC and DPPC phospholipid bilayers using temperature-controlled scanning force microscopy. Biophysical Journal, 86, 6: 3783-3793. Leontiadou H., Mark A. E., Marrink S. J. 2004. Molecular dynamics simulations of hydrophilic pores in lipid bilayers. Biophysical Journal, 86, 4: 2156-2164. Li Z. G., Liu A. Q., Klaseboer E., Zhangc J. B., Ohl C. D. 2013. Single cell membrane poration by bubble-induced microjets in a microfluidic chip. Lab on a Chip, 6: 1144-1150. Lin H. Y., Thomas J. L. 2004. Factors affecting responsivity of unilamellar liposomes to 20 kHz ultrasound. Langmuir, 20: 6100-6106. Locascio L., Vreeland W., Jahn A., Gaitan M. 2004. Liposomes as model cellular systems, V: Lab-on-Chips for cellomics. Andersson H., van den Berg A. (ur.). Dortrecht, Springer: 59-81. Lu L., Doak W. J., Schertzer J. W., Chiarot P. R. 2016. Membrane mechanical properties of synthetic asymmetric phospholipid vesicles. Soft Matter, 12: 7521-7528. 128 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Lucht J. M., Bremer E. 1994. Adaptation of Escherichia coli to high osmolarity environments: osmoregulation of the high-affinity glycine betaine transport system proU. FEMS Microbiology Reviews, 14, 1: 3-20. Madigan M.T., Martinko J.M., Dunlap P.V., Clark D.P. 2008. Brock biology of microorganisms. 10th ed. New Jersey, Pearson Education Inc: 1019 str. Maher K., Stevenson D. 1988. Impact frustration of the origin of life. Nature, 331: 612-614. Marmottant P., Hilgenfeldt S. 2003. Controlled vesicle deformation and lysis by single oscillating bubbles. Nature, 423: 153-156. Marmottant P., Biben T., Hilgenfeldt S. 2008. Deformation and rupture of lipid vesicles in the strong shear flow generated by ultrasound-driven microbubbles. Proceedings of the Royal Society A, Mathematical, Physical and Engineering Sciences, 464: 1781-1800. Marsh D. 2006. Elastic curvature constants of lipid monolayers and bilayers. Chemistry and Physics of Lipids, 144: 146-159. Mason T. J., Cobley A. J., Graves J. E., Morgan D. 2011. New evidence for the inverse dependence of mechanical and chemical effects on the frequency of ultrasound. Ultrasonics Sonochemistry, 18, 1: 226-230. Miki T., Hardt W. D. 2013. Outer membrane permeabilization is an essential step in the killing of Gram-negative bacteria by the lectin RegIIIβ. PLOS One. 8, 7: e69901, doi: 10.1371/journal.pone.0069901: 11 str. Miller D. L., Pislaru S. V, Greenleaf J. F. 2002. Sonoporation: Mechanical DNA delivery by ultrasonic cavitation. Somatic Cell and Molecular Genetics, 27: 115-134. Mitsuzawa S., Deguchi S., Horikoshi K. 2006. Cell structure degradation in Escherichia coli and Thermococcus sp. Strain Tc-1-95 associated with thermal death resulting from brief heat treatment. FEMS Microbiology Letters, 260, 1: 100-105. Mo S., Coussios C. C., Seymour L., Carlisle R. 2012. Ultrasound-enhanced drug delivery for cancer. Expert Opinion on Drug Delivery, 9, 12: 1525-1538. Nagle J. F., Wilkinson D. A. 1978. Lecithin bilayers. Density measurement and molecular interactions. Biophysical Journal, 23: 159-175. 129 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Nasseri S., Mahvi A. H., Seyedsalehi M., Yaghmaeian K., Nabizadeh R., Alimohammadi M., Safari G. H. 2017. Degradation kinetics of tetracycline in aqueous solutions using peroxydisulfate activated by ultrasound irradiation: Effect of radical scavenger and water matrix. Journal of Molecular Liquids, 241: 704-714. Needham D., Evans E. 1988. Structure and mechanical properties of giant lipid (DMPC) vesicle bilayers from 20 °C below to 10 °C above the liquid crystal-crystalline phase transition at 24 °C. Biochemistry, 27: 8261-8269. Nickels J. D., Smith J. C., Cheng X. 2015. Lateral organization , bilayer asymmetry, and inter-leaflet coupling of biological membranes. Chemistry and Physics of Lipids, 192: 87-99. Nomura F., Inaba T., Ishikawa S., Nagata M., Takahashi S., Hotani H., Takiguchi K. 2004. Microscopic observations reveal that fusogenic peptides induce liposome shrinkage prior to membrane fusion. Proceedings of the National Academy of Sciences, 101: 3420-3425. Nomura F., Nagata M., Inaba T., Hiramatsu H., Hotani H., Takiguchi K. 2001. Capabilities of liposomes for topological transformation. Proceedings of the National Academy of Sciences, 98: 2340-2345. Ohl C.-D., Arora M., Ikink R., de Jong N., Versluis M., Delius M., Lohse D. 2006. Sonoporation from Jetting Cavitation Bubbles. Biophysical Journal, 91, 11: 4285-4295. Ohrdes H., Ille I., Twiefel J., Wallaschek J., Nogueira R., Rosenwinkel K. H. 2018. A control system for ultrasound devices utilized for inactivating E. coli in wastewater. Ultrasonics Sonochemistry, 40: 158-162. Olsén, A., Jonsson A., Normark S. 1989. Fibronectin binding mediated by a novel class of surface organelles on Escherichia coli. Nature, 338: 652-655. Onitsuka M. O., Rikihisa Y., Maruyama H. B. 1979. Biochemical and topographical studies on Escherichia coli cell surface. IV. Giant spheroplast formation from a filamentous cell. Journal of Bacteriology, 138, 2: 567-574. O’Connor J., Akbar F. B., Hutson M. S., Page-McCaw A. 2021. Zones of cellular damage around pulsed-laser wounds. PloS ONE, 16, 9: e0253032, doi: 10.1371/journal.pone.0253032: 20 str. 130 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Paliwal S., Mitragotri S. 2006. Ultrasound-induced cavitation: applications in drug and gene delivery. Expert Opinion on Drug Delivery, 3, 6: 713-726. Pandit K. R., Klauda J. B. 2012. Membrane models of E. coli containing cyclic moieties in the aliphatic lipid chain. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes, 1818, 5: 1205-1210. Pembrey R. S., Marshall K. C., Schneider R. P. 1999. Cell surface analysis techniques: What do cell preparation protocols do to cell surface properties? Applied and Environmental Microbiology, 65, 7: 2877-2894. Patankar S. V. 1980. Numerical heat transfer and fluid flow. Boca Raton, CRC Press: 214 str. Patinglag L., Melling L. M., Whitehead K. A., Sawtell D., Iles A., and Shaw K.J. 2021. Non-thermal plasma-based inactivation of bacteria in water using a microfluidic reactor. Water Research, 201: 117321, doi: 10.1016/j.watres.2021.117321: 9 str. Peshkovsky A. S., Peshkovsky S. L., Bystryak S. 2013. Scalable high-power ultrasonic technology for the production of translucent nanoemulsions. Chemical Engineering and Processing: Process Intensification, 69: 77-82. Pisabarro A. G., de Pedro M. A., Vázquez D. 1985. Structural modifications in the peptidoglycan of Escherichia coli associated with changes in the state of growth of the culture. Journal of Bacteriology, 161: 238-242. Podbevšek D., Ledoux G., Dular M. 2022. Investigation of hydrodynamic cavitation induced reactive oxygen species production in microchannels via chemiluminescent luminol oxidation reactions. Water Research, 220: 118628, doi: 10.1016/j.watres.2022.118628: 11 str. Podbevšek D., Petkovšek M., Ohl C. D., Dular M. 2021. Kelvin-Helmholtz instability governs the cavitation cloud shedding in Venturi microchannel. International Journal of Multiphase Flow, 142: 103700, doi: 10.1016/j.ijmultiphaseflow.2021.103700: 7 str. Pong M., Umchid S., Guarino A. J., Lewin P. A., Litniewski J., Nowicki A., Wrenn S. P. 2006. In vitro ultrasound-mediated leakage from phospholipid vesicles. Ultrasonics, 45: 133-145. Potthoff E., Ossola D., Zambelli T., Vorholt J.A. 2015. Bacterial adhesion force quantification by fluidic force microscopy. Nanoscale, 7, 9: 4070-4079. 131 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Prosperetti A. 2004. Bubbles. Physics of Fluids, 16, 6: 1852-1865. Pucadyil T. J., Mukherjee S., Chattopadhyay A. 2007. Organization and dynamics of NBD-labeled lipids in membranes analyzed by fluorescence recovery after photobleaching. Journal of Physical Chemistry B, 111, 8: 1975–1983. Quinto-Su P.A. 2014. A microscopic steam engine implemented in an optical tweezer. Nature Communications, 5: 5889, doi: 10.1038/ncomms6889: 7 str. Rajasekhar P., Fan L., Nguyen T., Roddick F. A. 2012. A review of the use of sonication to control cyanobacterial blooms. Water Research, 46: 4319-4329. Ramanan R. N., Ling T. C., Ariff A. B. 2008. The performance of a glass bead shaking technique for the disruption of Escherichia coli cells. Biotechnology and Bioprocess Engineering, 13: 613-623. Rau K. R., Quinto-Su P. A., Hellman A. N., Venugopalan V. 2006. Pulsed laser microbeam-induced cell lysis: time-resolved imaging and analysis of hydrodynamic effects. Biophysical Journal, 91, 1: 317-329. Reuter F., Ohl C. D. 2021 Nonspherical collapse of single bubbles near boundaries and in confined spaces. V: Cavitation and bubble dynamics. Koukouvinis P., Gavaises M. (ur.). Cambridge, Academic Press: 37-72. Reuter F., Ohl C. D. 2021a. Supersonic needle-jet generation with single cavitation bubbles. Applied Physics Letters, 118, 13: 134103, doi: 10.1063/5.0045705: 5 str. Roberts I. S. 1996. The biochemistry and genetics of capsular polysaccharide production in bacteria. Annual Review of Microbiology, 50, 1: 285-315. Rogers H. T., Perkins H. R., Ward J. B. 1980. Microbial cell walls and membranes. London, Chapman & Hall Ltd: 239-291. Rojas E. R., Billings G., Odermatt P. D., Auer G. K., Zhu L., Miguel A., Chang F., Weibel D. B., Theriot J. A., Huang K. C. 2018. The outer membrane is an essential load-bearing element in Gram-negative bacteria. Nature, 559, 7715: 617-621. Salmen S. H., Alharbi S. A., Faden A. A., Wainwright, M. 2018. Evaluation of effect of high frequency electromagnetic field on growth and antibiotic sensitivity of bacteria. Saudi Journal of Biological Sciences, 25, 1: 105-110. 132 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Saranya N., Devi P., Nithiyanantham S., Jeyalaxmi R. 2014. Cells disruption by ultrasonication. Bionanoscience, 4, 4: 335-337. Saunders L., Perrin J., Gammack D. 1962. Ultrasonic irradiation of some phospholipid sols. Journal of Pharmacy and Pharmacology, 14: 567-572. Schlüter-Vorberg L., Prasse C., Ternes T. A., Mückter H., Coors A. 2015. Toxification by transformation in conventional and advanced wastewater treatment: the antiviral drug acyclovir. Environmental Science & Technology Letters, 2: 342-346. Schroeder A., Avnir Y., Weisman S., Najajreh Y., Gabizon A., Talmon Y., Kost J., Barenholz Y. 2007. Controlling liposomal drug release with low frequency ultrasound: Mechanism and feasibility. Langmuir, 23: 4019-4025. Schroeder A., Kost J., Barenholz Y. 2009. Ultrasound, liposomes, and drug delivery: principles for using ultrasound to control the release of drugs from liposomes. Chemistry and Physics of Lipids, 162: 1-16. Shashi K., Satinder K., Bharat P. 2012. A complete review on: Liposomes. International Research Journal of Pharmacy, 3, 7: 10-16. Shiu C., Zhang Z., Thomas C. R. 1999. A novel technique for the study of bacterial cell mechanical properties. Biotechnology Techniques, 13, 10: 707-713. Silhavy T. J., Kahne D., Walker S. 2010. The bacterial cell envelope. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology, 2, 5: a000414, doi:10.1101/cshperspect.a000414: 16 str. Silica Microspheres. 2019. Prouct Data Sheet 702. Fishers, Bangs Laboratories Inc.: 2 str. Simons K., Sampaio J. L. 2011. Membrane organization and lipid rafts. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology, 3: a004697. doi: 10.1101/cshperspect.a004697. Singer S. J., Nicolson G. L. 1972. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science, 175, 4023: 720-731. Sinibaldi G., Occhicone A., Alves Pereira F., Caprini D., Marino L., Michelotti F., Casciola C. M. 2019. Laser induced cavitation: Plasma generation and breakdown shockwave. Physics of Fluids, 31, 10: 103302. doi: 10.1063/1.5119794: 12 str. 133 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Sleytr U.B., Messner P. 2009. Crystalline bacterial cell surface layers (S‐layers) V: Encyclopedia of microbiology. Vol. 1. Schaechter M. (ur.). San Diego, Academic Press/Elsevier Science: 89-98. Small E. F., Dan N. R., Wrenn S. P. 2012. Low-frequency ultrasound-induced transport across non-raft-forming ternary lipid bilayers. Langmuir, 28: 14364-14372. Smith D., Price J., Burby P., Blanco L., Chamberlain J., Chapman M. 2017. The production of curli amyloid fibers is deeply integrated into the biology of Escherichia coli. Biomolecules, 7, 4: 75, doi: 10.3390/biom7040075: 26 str Souzu, H. 1986. Fluorescence polarization studies on Escherichia coli membrane stability and its relation to the resistance of the cell to freeze-thawing. I. Membrane stability in cells of differing growth phase. Biochimica et Biophysica Acta, 861: 353-360. Spiteri D., Chot-Plassot C., Sclear J., Karatzas K. A., Scerri C., Valdramidis V. P. 2017. Ultrasound processing of liquid system(s) and its antimicrobial mechanism of action. Letters in Applied Microbiology. 65, 4: 313-318. Sudbrack, T. P., Archilha N. L., Itri R., Riske K. A. 2011. Observing the solubilization of lipid bilayers by detergents with optical microscopy of GUVs. Journal of Physical Chemistry B, 115: 269-277. Sułkowski W. W., Pentak D., Nowak K., Sułkowska A., Goertz M. P., Goyal N., Montano G. A., Bunker B. C. 2005. The influence of temperature, cholesterol content and pH on liposome stability. Journal of Molecular Structure, 744-747: 737-747. Sun X., Park J. J., Kim H. S., Jin S., Lee S., Om A. S., Yoon j. Y. 2018. Experimental investigation of the thermal and disinfection performances of a novel hydrodynamic cavitation reactor. Ultrasonics Sonochemistry, 49: 13-23. Sun Y., Sun T. L., Huang H. 2014. Physical properties of escherichia coli spheroplast membranes. Biophysical Journal, 107, 9: 2082-2090. Suslick K. S., McNamara W. B., Didenko Y. 1999. Hot spot conditions during multibubble cavitation. V: Sonochemistry and sonoluminescence. Crum L. A., Mason T. J., Reisse J. L., Suslick K. S. (ur.). Dordrecht, Springer: 191-204. Suslick K. S., Eddingsaas N. C., Flannigan D. J., Hopkins S. D., Xu H. 2011. Extreme conditions during multibubble cavitation: Sonoluminescence as a spectroscopic probe, Ultrasonics Sonochemistry. 18: 842-846. 134 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Šarc A., Oder M., Dular M. 2014. Can rapid pressure decrease induced by supercavitation efficiently eradicate Legionella pneumophila bacteria?. Desalination and Water Treatment, 57, 5: 2184-2194. Šarc A., Kosel J., Stopar D., Oder M., Dular. 2018. Removal of bacteria Legionella pneumophila, Escherichia coli, and Bacillus subtilis by (super)cavitation. Ultrasonics Sonochemistry, 42: 228-236 Širok B., Dular M., Stoffel B. 2006. Kavitacija. 1. natis. Ljubljana, i2: 167 str. Tandiono T., Ow D. S., Driessen L., Chin C. S., Klaseboer E., Choo A. B., Ohl S. W., Ohl C. D. 2012. Sonolysis of Escherichia coli and Pichia pastoris in microfluidics. Lab on a Chip. 12, 4: 780-786. Teran L. A., Rodríguez S. A., Laín S., Jung S. 2018. Interaction of particles with a cavitation bubble near a solid wall. Physics of Fluids, 30, 12: 123304, doi: 10.1063/1.5063472: 12 str. Thongsomboon W., Serra D. O., Possling A., Hadjineophytou C., Hengge R., Cegelski L. 2018. Phosphoethanolamine cellulose: A naturally produced chemically modified cellulose. Science, 80, 359: 334-338. Tien H. T., Ottova A. 2003. The lipid bilayer concept: Experimental realization and current applications. V: Membrane science and technology, planar lipid bilayers (BLMs) and their applications. Tien H.T., Ottova-Leitmannova A. (ur.). Amsterdam, Elsevier: 1-73. Tinevez J. Y., Perry N., Schindelin J., Hoopes G. M., Reynolds G. D., Laplantine E., Bednarek S. Y., Shorte S. L., Eliceiri K. W. 2017. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods, 115: 80-90. Tuson H. H., Auer G. K., Renner L. D., Hasebe M., Tropini C., Salick M., Crone W. C., Gopinathan A., Huang K. C., Weibel D. B. 2012. Measuring the stiffness of bacterial cells from growth rates in hydrogels of tunable elasticity. Molecular Microbiology, 84, 5: 874-891. Uehara T., Bernhardt T. G. 2011. More than just lysins: peptidoglycan hydrolases tailor the cell wall. Current Opinion in Microbiology, 14: 698-703. Ulrich A., Sami M., Watts A. 1994. Hydration of DOPC bilayers by differential scanning calorimetry. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes, 1191: 225– 230. 135 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Vadillo-Rodríguez V., Dutcher J. R. 2011. Viscoelasticity of the bacterial cell envelope. Soft Matter, 7: 4101-4110. Valap sealant. 2015. Cold Spring Harbor Protocols, doi: 10.1101/pdb.rec082917. van den Bogaart G., Hermans N., Krasnikov V., Poolman B. 2007. Protein mobility and diffusive barriers in Escherichia coli: consequences of osmotic stress. Molecular Microbiology, 64: 858-871. Vezenov D., Barrett M. J. 2013. Young’s modulus of B. subtilis cell wall: measuring and modeling the elasticity of rod-like bacteria. Biophysical Journal, 104, 2: 640-641. Vollmer W. 2007. Structure and biosynthesis of the murein (peptidoglycan) sacculus. V: The periplasm. Ehrmann M. (ur.). Washington, ASM Press: 198-213. Vollmer W., Blanot D., De Pedro M. A. 2008. Peptidoglycan structure and architecture, FEMS Microbiology Reviews, 32, 2: 149-167. Voss J. G. 1964. Lysozyme lysis of Gram-negative bacteria without production of spheroplasts. Journal of General Microbiology, 35, 2: 313-317. Wang X., Preston III J. F., Romeo T. 2004. The pgaABCD locus of Escherichia coli promotes the synthesis of a polysaccharide adhesin required for biofilm formation. Journal of Bacteriology, 186: 2724-2734. Wietzikoski Lovato E. C., Gurgel Velasquez P. A., dos Santos Oliveira C., Baruffi C., Anghinoni T., Machado R. C., dos Reis Lívero F. A., Sato S. W., de Almeida Martins L. 2018. High frequency equipment promotes antibacterial effects dependent on intensity and exposure time. Clinical, Cosmetic and Investigational Dermatology, 11: 131-135. Wilks J. C., Slonczewski J. L. 2007. pH of the cytoplasm and periplasm of Escherichia coli: rapid measurement by green fluorescent protein fluorimetry. Journal of Bacteriology, 189, 15: 5601-5607. Yao X., Jericho M., Pink D., Beveridge T. 1999. Thickness and elasticity of Gram-negative murein sacculi measured by atomic force microscopy. Journal of Bacteriology, 181: 6865-6875. Young F. R. 1989. Cavitation. New York, McGraw-Hill book company: 418 str. 136 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Yow H. N., Pitt M. J., Salman A. D. 2005. Drag correlations for particles of regular shape. Advanced Powder Technology, 16, 4: 363-372. Yusof N. S. M., Babgi B., Alghamdi Y., Aksu M., Madhavan J., Ashokkumar M. 2016. Physical and chemical effects of acoustic cavitation in selected ultrasonic cleaning applications. Ultrasonics Sonochemistry, 29: 568-576. Zeng Q., Gonzalez-Avila S.R., Dijkink R., Koukouvinis P., Gavaises M., Ohl C.-D. 2018. Wall shear stress from jetting cavitation bubbles. Journal of Fluid Mechanics, 846: 341-355. Zevnik J., Dular M. 2020. Cavitation bubble interaction with a rigid spherical particle on a microscale. Ultrasonics Sonochemistry, 69: 105252, doi: 10.1016/j.ultsonch.2020.105252: 13 str. Zevnik J., Dular M. 2021. Liposome destruction by a collapsing cavitation microbubble: A numerical study. Ultrasonics Sonochemistry, 78: 105706, doi: 10.1016/j.ultsonch.2021.105706: 15 str. Zevnik J., Dular M. 2022. Cavitation bubble interaction with compliant structures on a microscale: A contribution to the understanding of bacterial cell lysis by cavitation treatment. Ultrasonics Sonochemistry, 87: 106053, doi: 10.1016/j.ultsonch.2022.106053: 20 str. Zhou Y., Yang K., Cui J., Ye J. Y., Deng C. X. 2012. Controlled permeation of cell membrane by single bubble acoustic cavitation. Journal of Controlled Release. 157,1: 103-111. Zou H., Wang L. 2017. The disinfection effect of a novel continuous-flow water sterilizing system coupling dual-frequency ultrasound with sodium hypochlorite in pilot scale. Ultrasonics Sonochemistry, 36: 246-252. Zupanc M., Pandur Ž., Stepišnik Perdih T., Stopar D., Petkovšek M., Dular M. 2019. Effects of cavitation on different microorganisms: the current understanding of the mechanisms taking place behind the phenomenon. A review and proposals for further research. Ultrasonics Sonochemistry, 57: 147-165. 137 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 ZAHVALA Najprej bi se rad zahvalil mentorju prof. dr. Stopar David in somentorju prof. dr. Dular Matevž za strokovno pomoč in podporo pri doktorskem študiju. Še posebej bi se zahvalil prof. dr. Dular Matevž, da mi je dal možnost biti del njegove raziskovalne skupine in delati raziskave v okviru ERC projekta »CABUM«. Zahvalil bi se tudi dr. Zevnik Jure za znanstven doprinos k eksperimentalnemu delu z opravljenimi numeričnimi analizami, g. Godeša Tone za vso tehnično pomoč in izdelavo testnih naprav pri eksperimentih. Zahvalil bi se tudi ostalim sodelavcem za vso pomoč in svetovanje pri delu. Prav tako bi se zahvalil celotnemu Oddelku za mikrobiologijo na Biotehniški fakulteti, kjer sem lahko izvajal vse mikrobiološke poskuse ter vsem zaposlenim na katedri, ki so mi z nasveti pomagali izboljšati in olajšati izvedbo eksperimentov. Še posebej bi se zahvalil tehnični sodelavki Leskovec Simoni, saj so mi njeni nasveti in pomoč znatno olajšali izvedbo eksperimentov. Na koncu se iskreno zahvaljujem staršema in bratu, ki so mi vedno stali ob strani tekom študija. Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 PRILOGE Priloga A: Objavljen pregledni članek vpliva hidrodinamske kavitacije na mikroorganizme Vpliv kavitacije na mikroorganizme: trenutno razumevanje mehanizmov kavitacije. Pregled in predlogi za nadaljnje raziskave Zupanc M., Pandur Ž., Stepišnik Perdih T., Stopar D., Petkovšek M., Dular M. 2019. Effects of cavitation on different microorganisms: the current understanding of the mechanisms taking place behind the phenomenon. A review and proposals for further research. Ultrasonics Sonochemistry, 57: 147-165. Izvleček: Nenaden padec tlaka povzroči nastanek parnih in plinskih mehurčkov v kapljevini (imenovano tudi kavitacija). To vodi do številnih (ključnih) inženirskih težav: izgube materiala, hrupa in tresljajev hidravličnih strojev. Po drugi strani pa je kavitacija potencialno uporaben pojav: ekstremni pogoji se vedno pogosteje uporabljajo za najrazličnejše aplikacije, kot so površinsko čiščenje, izboljšana kemija in čiščenje odpadne vode (izkoreninjenje bakterij in inaktivacija virusov). Kljub pomembnemu napredku tehnologije kavitacije pa ostaja velika vrzel med razumevanjem mehanizmov, ki prispevajo k učinkom kavitacije, in njeno uporabo. Čeprav inženirji že komercializirajo naprave, ki uporabljajo kavitacijo, še vedno ne moremo odgovoriti na temeljno vprašanje: Kakšni so natančno mehanizmi, s katerimi lahko mehurčki čistijo, razkužujejo, ubijajo bakterije in povečujejo kemično aktivnost? V članku smo opravili temeljit pregled nedavnega dela (od leta 2005 naprej) na področju uničevanja mikroorganizmov s pomočjo kavitacije in naj bi služil kot temelj za razvoj tehnologije v prihajajočih letih. To delo je ponujeno pod Priznanje avtorstva-Nekomercialno-Brez predelav 4.0 Mednarodno licenco Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Priloga B: Objavljen pregledni članek vpliva mehanskih lastnosti posameznih slojev bakterijske celične stene Evolucija mehanske stabilnosti od lipidnega dvosloja do kompleksne strukture ovojev bakterijske celične stene Pandur Ž., Stopar D. 2021. Evolution of mechanical stability from lipid layers to complex bacterial envelope structures. V: Advances in biomembranes and lipid self-assembly. Bongiovanni A., Pocsfalvi G., Manno G., Kralj-Iglič V. (ur.). Cambridge, Academic Press: 207-251. Izvleček: Za preživetje v okolju morajo bakterije nenehno ohranjati strukturno celovitost svoje ovojnice. Citoplazemska membrana predstavlja fizično bariero med bakterijsko celico in okoliško tekočino, vendar imajo le redke samo citoplazemsko membrano. Večina bakterij je razvila številne dodatne plasti, z namenom premostitve težkih pogojev v okolju. Glavni cilj poglavja je predstavitev različnih struktur bakterijske ovojnice, ki so pomembne za mehansko stabilnost celice. Kronološkega poteka razvoja nastanka struktur bakterijske ovojnice nismo podali, saj so te večinoma neznane, vendar predstavimo mehanski pogled za opazovane sloje celične stene. Predstavljeni so lipidni monosloji in dvosloji, kjer raziščemo zakaj takšne strukture so mehansko nestabilne in zakaj so potrebne dodatne površinske plasti. Čeprav je splošno znano, da je peptidoglikan edini strukturni element, ki zagotavlja togost bakterijske ovojnice, nedavne ugotovitve kažejo, da je strižna obremenitev lahko enakomerno porazdeljena med različne plasti. Pri tem ostaja peptidoglikan še vedno bistveni steber v celičnem mehanskem sistemu, vendar le kot del večkompozitne celične pregrade. Predstavili smo tudi vlogo zunanje membrane, S-plasti, kapsule, ovoja in sluzi pri mehanski stabilnosti celice. Čeprav je glavni poudarek po Gramu negativnih in po Gramu pozitivnih bakterijah, je predstavljenih nekaj posebnih primerov prilagoditev bakterijske ovojnice na ekstremna okolja. Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pandur Ž. Mehanizem delovanja kavitacijskih mehurčkov na bakterijsko celico Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Priloga C: Dovoljenje založnika Elsevier za vključitev objavljenega raziskovalnega dela v doktorsko disertacijo z naslovom: A Monte Carlo study of giant vesicle morphologies in nonequilibrium environments (Biophysical Journal). Priloga D: Dovoljenje založnika Elsevier za vključitev objavljenega raziskovalnega dela v doktorsko disertacijo z naslovom: Evolution of mechanical stability from lipid layers to complex bacterial envelope structures (Academic Press).