Ugotavljanje deklariranih bakterij v probioticnih prehranskih dopolnilih in zdravilih na slovenskem trgu Determination of labeled bacteria in probiotic food supplements and medicinal products (OTC) on Slovenian market Bojana Bogovič Matijašic, Metoda Zorič Peternel, Irena Rogelj Povzetek: Na slovenskem trgu se število probiotlčnih prehranskih dopolnil oziroma zdravil hitro povečuje. Pomemben kriterij kakovosti teh Izdelkov je število živih probiotičnih mikroorganizmov, ki zagotavljajo njihovo učinkovitost. Proizvajalci, distributerji ali prodajalci se redko odločajo za preiskave probiotičnih izdelkov v neodvisnih laboratorijih, saj slovenska zakonodaja ne predpisuje preverjanja njihove sestave pred prodajo. Namen raziskave je bil zato pregledati ustreznost probiotičnih prehranskih dopolnil ter probiotičnih zdravil (OTC), naprodaj v slovenskih lekarnah. Od 20 probiotičnih prehranskih dopolnil je le pet izdelkov vsebovalo dovolj živih mikroorganizmov glede na deklaracijo, pri dveh izdelkih pa število ni bilo deklarirano. V šestih izdelkih z metodo PCR nismo našli živih predstavnikov vseh navedenih vrst. Obe probiotični zdravili sta ustrezali tako po vrstni sestavi kot po številu probiotičnih bakterij. Rezultati kažejo na potrebo po boljši kontroli kakovosti tovrstnih izdelkov. Ključne besede: probiotična prehranska dopolnila, probiotična zdravila, kakovost probiotičnih izdelkov, PCR Abstract: There are an increasing number of probiotic food supplements or medicinal products on the Slovenian market. Probiotic microorganisms in these products have to be viable otherwise the effects may not be expected. Producers, distributors or sellers do not decide often for the analysis of probiotic products in independent laboratories since Slovenian legislation does not require control of their content before being sold. The aim of this study was to survey the suitability of probiotic food supplements and medicinal products (OTC) available in Slovenian pharmacies. Five food supplements out of 20 tested contained enough viable microorganisms while the number was not declared in two products. In six products the viable representatives of all declared species were not found by PCR method. Both probiotic medicinal products were suitable regarding the species composition and number of probiotic bacteria. Results indicate the need for better quality control of such products. Key words: probiotic food supplements, probiotic medicinal products, quality of probiotic products, PCR 1 Uvod Na trgu so probiotiki na voljo v obliki funkcionalnih živil, prehranskih dopolnil in zdravil brez recepta. Med funkcionalnimi živili s probiotiki prevladujejo probiotični jogurti in mlečni napitki, sledijo jim siri in mlečni namazi s probiotiki, vse več pa je tudi živil rastlinskega izvora, namenjenih predvsem vegetarijancem. Prehranska dopolnila in zdravila pa vsebujejo liofilizirane probiotične mikroorganizme v obliki kapsul, tablet, pastil, peroralnih praškov in peroralnih kapljic. Prehranska dopolnila daleč prednjačijo pred zdravili, saj so regulatorne zahteve za prehranska dopolnila bistveno blažje od tistih za zdravila (1). Posebnost zdravil s probiotiki je, da lahko navajajo neposredne učinke na bolezenska stanja, ki so dokazani, medtem ko pri hrani oz. prehranskih dopolnilih to ni dovoljeno, oziroma so trditve in navedbe lahko samo splošne (2, 3). Podobno velja tudi za oglaševanje. Kljub temu da proizvajalci, dobavitelji ali uvozniki prehranskih dopolnil niso dolžni preverjati sestave izdelkov pred prodajo, pa se v zadnjem času vse pogosteje odločajo za preiskave v neodvisnih laboratorijih, saj se zavedajo, da s tem pridobijo večje zaupanje kupcev. Ker je zanesljivo potrjevanje probiotičnih mikrooganizmov mogoče samo s kombinacijo klasičnih in sodobnih, nekoliko zahtevnejših mikrobioloških metod, ki se še razvijajo, v EU zaenkrat še ne obstajajo standardne Bojana Bogovič Matijašič, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko, Katedra za mlekarstvo, Groblje 3, 1230 Domžale Metoda Zorič Peternel, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko, Katedra za mlekarstvo, Groblje 3, 1230 Domžale Irena Rogelj, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko, Katedra za mlekarstvo, Groblje 3, 1230 Domžale metode za preiskave probiotičnih izdelkov, prvi laboratoriji za tovrstne analize pa so šele v postopkih akreditacije. Leta 2006 so bili prvič objavljeni podatki o ustreznosti probiotičnih izdelkov, naprodaj v Sloveniji (4). Avtorici sta v raziskavo zajeli 6 prehranskih dopolnil v obliki kapsul, tablet ali praška, enega probiotičnega zdravila brez recepta (OTC) ter 11 probiotičnih mlečnih izdelkov. Pokazalo se je, da je označevanje teh izdelkov pogosto pomanjkljivo ali neustrezno glede števila živih probiotičnih bakterij in navedenih vrst. V raziskavi, katere rezultati so predstavljeni v tem delu, pa smo pregledali 20 probiotičnih prehranskih dopolnil ter dve probiotični Preglednica 1: Vrste in izvor referenčnih bakterijskih sevov. Table 1: Species and source of reference bacterial strains. Bif. bifidum ATCC 29521 Bif. infantis FAM 14390 Bif. longum ATCC 15708 Ec. faecium ATCC 6057 Lb. acidophilus ATCC 4356 Lb. bulgaricus ATCC 11842 Lb. casei ATCC 393 Lb. paracasei DSM 5622 Lb. gasseri ATCC 20243 Lb. plantarum ATCC 8014 Lb. reuteri ATCC 55730 Lb. rhamnosus ATCC 53103 Lb. salivarius LMG 9477 Lc. lactis LMG 7930 Str. thermophilus CCM 7711 ATCC, American Type Culture Collection FAM, Swiss Federal Research Station for Animal Production and Dairy Products, Bern, Švica LMG, Belgian Coordinated Collections of Microorganisms, Gent, Belgija DSM, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, „Braunschweig, Nemčija CCM Czech Collection of Microorganisms, Brno, Češka Republika zdravili (OTC) s polic slovenskih lekarn, kupljenih v letu 2009. Ker s konvencionalnimi gojitvenimi metodami lahko ugotavljamo le določene skupine oziroma rodove probiotičnih bakterij v izdelku, ne moremo pa potrditi prisotnosti posameznih navedenih vrst, smo uporabili tudi molekularno biološke metode. 2 Materiali in metode 2.1 Probiotični izdelki Probiotične izdelke smo kupili v lekarnah v Sloveniji. Hranili smo jih pri sobni temperaturi do analize, izvedene pred iztekom roka uporabnosti. 2.2 Bakterijski sevi in pogoji kultivacije Imena in izvor bakterijskih sevov, ki smo jih uporabili kot referenčne seve v reakcijah PCR, so navedeni v Preglednici 1. Omenjene seve smo oživili iz zamrznjenih kultur, ki jih hranimo v mikrobni zbirki na Katedri za mlekarstvo Biotehniške fakultete v Ljubljani, z dvakratnim precepljanjem v gojišče MRS (Merck). Str. thermophilus smo inkubirali pri 42 °C v aerobnih razmerah, vse ostale pa pri 37 °C. Bifidobakterijesmo tako v tekočem kot v trdnem gojišču inkubirali v anaerobnih razmerah, ki smo jih zagotovili z uporabo sistema Genbox (Bio-Merieux). Laktobacile v trdnem gojišču smo inkubirali v anaerobnih razmerah, v tekočem gojišču pa v aerobnih. Bifidobakterije smo gojili v tekočem gojišču MRS (Merck) z dodanim cistein hidrokloridom (Merck) v koncentraciji 0,05 % (w/v), laktobacile pa v običajnem gojišču MRS. 2.3 Ugotavljanje števila mikroorganizmov z metodo štetja na ploščah Število mikrorganizmov posameznih skupin, rodov oziroma vrst smo ugotavljali z nacepljanjem vzorcev na standardna selektivna gojišča (Preglednica 2). Uporabili smo hranljive podloge proizvajalca Merck. Anaerobne pogoje inkubacije smo zagotovili s sistemom GenBox (Bio-Merieux). Analizirali smo po 1 g vzorca oziroma 1 ml izdelka v obliki suspenzije ali 5 kapljic izdelka v kapalni steklenički. Za razredčevanje smo uporabljali % Ringerjevo raztopino, ki smo ji dodali 0,05 % L-cistein hidroklorida. Po končani inkubaciji smo prešteli izrasle kolonije Bakterija Izvor Bif. animalis ssp. lactis LMG 8314 Preglednica 2: Gojišča in pogoji gojenja mikroorganizmov. Table 2: Media and cultivation conditions for microorganisms. Vrsta mikroorganizma Gojišče Pogoji gojenja Lactobacillus acidophilus MRS+clia+ciprofloxb, pH=6,8 37 °C, anaer., 3 dni Lactobacillus gasseri Skupni laktobacili Rogosa 37 °C, anaer., 3 dni Mezofilni laktobacili Rogosa 30 °C, anaer., 3 dni Bifidobacterium MRS+0,05% cistein+mupc, pH=6,8 37 °C, anaer., 3 dni Streptococcus thermophilus M17 42 °C, aer., 3 dni Lactococcus M17 30 °C, aer., 3 dni Plesni in kvasovke YGC 24 °C, aer., 3-5 dni Enterococcus CATC 37 °C, aer., 3 dni Bacillus BHI 37 °C, aer., 2 dni clia- clindamycin (Sigma), koncentracija v gojišču 0,1 pg/ml ciprofloxb- ciprofloxacin (Fluka), koncentracija v gojišču 10 pg/ml mupc - mupirocin (AppliChem), koncentracija v gojišču 50 pg/ml s pomočjo elektronskega števca (EŠKO 7L, LABO Ljubljana). Število kolonljsklh enot (KE) mikroorganizmov v enoti probiotičnega izdelka smo izračunali po naslednji formuli (5): KE = n / (f 1 + fb 0,1) d) Legenda: n ... vsota kolonij izraslih na ploščah fa ... število plošč, uporabljenih v prvi razredčitvi fb ... število plošč, uporabljenih v drugi razredčitvi d ... recipročni razredčitveni faktor najnižje razredčitve 2.4 Ugotavljanje prisotnosti deklariranih vrst iz rodov Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Enterococcus in Bifidobacterium v izdelkih DNA smo iz referenčnih sevov (Preglednica 1) osamili s komercialnim kitom Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega), po navodilih proizvajalca. Modificirali smo le liziranje bakterijskih celic na začetku protokola, ki je potekalo 45 minut pri 37 °C, s pomočjo lizocima (Sigma, 10 mg/ml) in mutanolizina (Sigma, 25 U/ml). Na podoben način smo izolirali tudi skupno DNA iz mešanice kolonij, zraslih po nacepljanju izdelkov na posamezna gojišča (Preglednica 2): M17 za laktokoke, Rogosa za laktobacile, gojišče z mupirocinom za bifidobakterije ter CATC za enterokoke. Prisotnost posameznih vrst probiotičnih bakterij smo ugotavljali s pomočjo metode PCR (eng. polymerase chain reaction - verižna reakcija s polimerazo), pri čemer smo uporabili v literaturi opisane vrstno specifične začetne oligonukleotide in reakcijske pogoje: Bifidobacterium (Bif.) bifidum, Bif. lactis, Bif. infantis in Bif. longum (6); Lactobacillus (Lb.) acidophilus, Lb. gasseri, Lb. casei, Lb. plantarum Lb. reuteri in Lb. rhamnosus (7); Lb. paracasei (8); Lb. salivarius (9); Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus (10); Lactococcus lactis (11); Enterococcus faecium (12) in Streptococcus thermophilus (13). Velikost pomnožkov PCR smo ugotavljali z agarozno gelsko elektroforezo (2 % agaroza), pri čemer smo gele obarvali z barvilom SybrGreen I. 2.5 Identifikacija izolatov Bacillus Za vrsto Bacillus coagulans, ki smo jo ugotovili v 4 izdelkih, ni na voljo dovolj specifičnih začetnih oligonukleotidov za PCR, zato smo to vrsto potrjevali na podlagi ugotavljanja nukleotidnega zaporedja dela gena za bakterijsko 16S rRNA. Genomsko DNA smo iz kulture izolatov Bacillus, zraslih na gojišču BHI, osamili s komercialnim kitom Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega), po navodilih proizvajalca. 660 bp dolgi odsek variabilne regije V1/V3 gena za 16S rDNA (685705 pri E. coli) smo pomnožili s PCR z začetnimi oligonukleotidi P1 in P4, kakor so opisali Klijn in sod. (14). Nukleotidno zaporedje pomnožkov PCR, očiščenih s pomočjo komercialnega kompleta Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega), so ugotavljali v laboratoriju Microsynth (Balgach, Švica). Nukleotidna zaporedja smo primerjali s tistimi, ki so shranjena v genski banki NCBI (National Center for Biotechnology Informations, Rockville, Bethesda, ZDA), s pomočjo programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), ki je dostopen na medmrežju (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). 3 Rezultati in razprava Rezultati pregleda prehranskih dopolnil s polic slovenskih lekarn, kupljenih v letu 2009, so strnjeni v priloženi preglednici (Preglednica 3). Od skupaj 20 pregledanih, je pet izdelkov (25 %) vsebovalo število probiotičnih mikroorganizmov, skladno z deklaracijo, pri 12 izdelkih je bilo ugotovljeno število nižje od navedenega, pri dveh izdelkih pa število ni bilo navedeno. V enem izdelku nismo uspeli potrditi živih bakterij. Navajanje vrst je bilo z izjemo enega izdelka zadovoljivo, oznake sevov pa so prej izjema kot pravilo. Navedene vrste smo večinoma tudi potrdili, z izjemo izdelkov z velikim številom različnih bakterij (6-8), pri katerih v nobenem primeru med živimi bakterijami nismo našli prav vseh navedenih vrst. Pregledali smo tudi dve probiotični OTC zdravili, ki pa sta bili ustrezni tako po vrsti kot po številu probiotičnih bakterij. Pri navajanju pričakovanih učinkov probiotikov sicer nismo naleteli na deklarativne nepravilnosti, saj je le pri obeh probiotičnih OTC zdravilih zapisano, da je izdelek namenjen zdravljenju, in sicer »preventivo in podporno zdravljenje pri driskah« medtem, ko na prehranskih dopolnilih ni direktnih »zdravstvenih trditev«. Navedbe na prehranskih dopolnilih namreč omenjajo pomoč pri vzpostavitvi porušene črevesne mikroflore, blagodejno delovanje na imunski sistem, preventivno delovanje pri dietah in nekaterih bolezenskih stanjih (driska odraslih in otrok, driska ob antibiotični terapiji, kronične vnetne bolezni črevesja, atopijski dermatitis, različne alergije in kronična zaprtja), prispevek k dobri presnovi nujno potrebnih hranilnih snovi ali boljše počutje oseb v zrelih letih. Opozoriti pa je potrebno, da takšne navedbe potrošnika zlahka zavedejo, saj hitro spregleda malenkostne dodatke, kot so »pomoč, blagodejno, preventivno, prispevek ali boljše počutje« in ga pritegne bolj atraktivna paleta bolezenskih stanj, običajno navedena v oklepajih. Na pomanjkljivosti probiotičnih izdelkov, predvsem prehranskih dopolnil s probiotiki, raziskovalci opozarjajo že vrsto let (15, 16, 17, 18, 19). Tudi raziskava izpred petih let o probiotičnih izdelkih na slovenskem trgu je potrdila neprimernost nekaterih izdelkov. Najpogostejše pomanjkljivosti so bile odsotnost živih predstavnikov deklariranih vrst, premajhno število živih bakterij in nepravilno poimenovanje probiotičnih bakterij (4). Od šestih prehranskih dopolnil je samo eno (~ 16,7 %) popolnoma odgovarjalo navedbam o sestavi in številu mikroorganizmov, kar je še nekoliko manj, kot v predstavljeni raziskavi. Žive bifidobakterije smo na primer dokazali le v dveh izdelkih, čeprav so bile deklarirane kar v petih, vrste Lb. acidophilus pa celo v nobenem od štirih, ki bi jo morale vsebovati. Pri treh izdelkih števila mikroorganizmov sploh ni bilo navedenega, dva izdelka pa sta jih vsebovala premalo. Probiotični jogurti in mlečni napitki so se takrat odrezali veliko bolje kot prehranska dopolnila. Po sestavi so večinoma ustrezali, le pri bifidobakterijah je bilo nekaj pomanjkljivosti pri navedbi vrst. Od 11 omenjenih izdelkov jih je pet vsebovalo več kot 107 KE/ml vse do konca uporabnosti, ostali pa vsaj 106 KE/ml (4). S 100 g izdelka z 107 KE/ml zaužijemo 109 živih probiotičnih bakterij - kar je povprečno število probiotikov v odmerku prehranskega dopolnila. Preglednica 3: Ustreznost 20 probiotičnih prehranskih dopolnil in 2 probiotičnih zdravil, kupljenih v slovenskih lekarnah v letu 2009, glede prisotnosti deklariranih vrst mikroorganizmov in njihovega števila. Table 3: Suitability of 20 probiotic food supplements and 2 probiotic medicinal products (OTC) obtained in Slovenian pharmacies in 2009 regarding the presence of labeled species of microorganisms and their number. DEKLARIRANI DEKLARIRANO UGOTOVLJENO USTREZNOST PROBIOTIKI ŠTEVILO ŠTEVILO PROBIOTICNA PREHRANSKA DOPOLNILA Lb. acidophilus y Skupno: 1011 KE /stekleničko Skupno: 1,8x109 KE/stekleničko- ne ustreza Lb. paracasei y Bif. lactis: 24x109 KE/stekleničko Bif. lactis: 1,8x109 KE/stekleničko prenizko Lb. plantarum y Lb. acidophilus: 6,4x109 KE/stekleničko Lb. acidophilus: 1,2x107 KE/stekleničko število Bif. lactis ✓ Lb. plantarum: 28 x 109 KE/stekleničko Lb. paracasei: 0,32x109 KE/stekleničko Lb. plantarum+Lb. paracasei: 2,2x107 KE/stekleničko Lb. gasseri y 107 KE/tableto 1,5x107 KE/tableto ustreza Bif. bifidum y Bif. longum y Lb. reuteri y 108 KE/tableto 1,4x107 KE/tableto ne ustreza Protectis prenizko število Lb. acidophilus 7,5x108 KE/kapsulo 1,2x107 KE/kapsulo ne ustreza Lb. bulgaricus prenizko število Lb. sporogenes nepravilno (neobstoječa vrsta) ime v =Bacillus coagulans y deklaraciji Streptococcus (Lb. sporogenes) thermophilus y odsotnost Bif. bifidum KE treh vrst Lb. acidophilus y 1,5x109 KE/vrečko 4,8x108 KE/vrečko ne ustreza Lb. bulgaricus prenizko število Lb. sporogenes odsotnost KE (neobstoječa vrsta)= dveh vrst Bacillus coagulans y Streptococcus y thermophilus Bif. bifidum Lb. plantarum y 1010 KE/kapsulo 3,8x109 KE/kapsulo ne ustreza prenizko število Lb. gasseri y 107 KE/tableto 4,3x106 KE/tableto ne ustreza Bif. bifidum y prenizko število Bif. longum y Lb. reuteri 108 KE/5 kapljic 2,4x107 KE/5 kapljic ne ustreza Protectis prenizko število Bif. bifidum y 5x109 KE/vrečko 1,1x1010 KE/vrečko delno ustreza Lb. acidophilus y skupno število Lb. casei je ustrezno Lb. plantarum y odsotnost KE Lb. rhamnosus dveh vrst Lb. salivarius y Lactococcus lactis y Bif. bifidum 5x109 KE/vrečko 1,4x1010 KE/vrečko delno ustreza Bif. lactis y skupno število Lb. acidophillus (2x) y je ustrezno Lb. paracasei y odsotnost KE Lb. plantarum y dveh vrst Lb. rhamnosus Lb. salivarius y Enterococcus faecium y DEKLARIRANI DEKLARIRANO UGOTOVLJENO USTREZNOST PROBIOTIKI ŠTEVILO ŠTEVILO PROBIOTIČNA PREHRANSKA DOPOLNILA Lb. casei 4x109 KE/vrečko 1,3x1010 KE/vrečko delno ustreza Lb. rhamnosus skupno število Lb. plantarum s je ustrezno Bif. bifidum s odsotnost KE Bif. lactis s dveh vrst Bif. longum s Lb. bulgaricus 1x1010 KE/ kapsulo 2x108 KE/ kapsulo ne ustreza (2 seva) prenizko število Lb. gasseri Streptococcus thermophilus Bacillus coagulans s 2x109 spor B. coagulans/stekleničko 2,9x106 spor B. coagulans/stekleničko ne ustreza prenizko število Bacillus coagulans s 2x109 spor B. coagulans/kapsulo 1,2x107 spor B. coagulans/kapsulo ne ustreza prenizko število Lb. acidophilus La-14 s 2,6x1010 KE/kapsulo 6,2x1010 KE/kapsulo ustreza Lb. paracasei Lpc-37 s Lb. plantarum Lp-115 s Bif. lactis BI-14 s Lb. acidophilus DDS-1 s 7,2x109 KE/kapsulo 1,0x109 KE/kapsulo ne ustreza Lb. bulgaricus DDS-14 s prenizko število Bif. bifidum Lb. acidophilus s 4x109 KE/kapsulo 3,5x108 KE/kapsulo ne ustreza Lb .bulgaricus s prenizko število Lb. paracasei s odsotnost KE Bif. bifidum dveh vrst Bif. longum Str. thermophilus s »acidophilus« Ni navedeno 1,0x103 KE kvasovk/ml suspenzije ne ustreza »bifidus« 1,1x107 KE bakterij/ ml suspenzije deklaracija ne »saccharomyces« navaja števila imena so nepopolna Lb. gasseri PA 16/8 s Ni navedeno 7,1x106 KE/tableto ne ustreza Bif. bifidum MF 20/5 s deklaracija ne Bif. longum SP 07/3 s navaja števila Lb. rhamnosus 2x1010 KE laktobacilov/stekleničko Nismo ugotovili živih bakterij ne ustreza Lb. acidophilus število živih Lb. bulgaricus bakterij pod Bif. bifidum mejo detekcije Str. thermophilus PROBIOTIČNI ZDRAVILI Lb. gasseri s 1,2x107 KE/kapsulo 5,8x107 KE/kapsulo ustreza Bif. infantis s Enterococcus faecium s Lb. acidophilus s 109 KE/kapsulo 3,5x109 KE/kapsulo ustreza Bif. animalis ssp. lactis s 109 KE/kapsulo 3,7x109 KE/kapsulo Slika 1: Reprezentativna slika agaroznega gela (2 % w/vol agaroze) po elektroforezi vzorcev DNA, osamljene iz kultivabilne populacije probiotikov iz različnih probiotičnih izdelkov, ter pomnožene v reakciji verižnega pomnoževanja s polimerazo (PCR), specifični za posamezne bakterijske vrste: Bif. lactis (proge 2-4, 680 bp), Bif. bifidum (proge 6-8, 278 bp), Bif. longum (proge 12-14, 831 bp) in Bif. infantis (proge 15-18, 828 bp). Proge 1, 11 in 19, DNA velikostni standard 100 bp (Fermentas); Progi 10 in 20, DNA velikostni standard Ultra low range (Fermentas); proga 2, referenčni vzorec DNA za Bif. lactis; progi 3 in 4, DNA iz dveh izdelkov; proga 5, negativna kontrola; proge 6-8, DNA iz treh izdelkov; proga 9, negativna kontrola; progi 12 in 13, DNA iz dveh izdelkov; proga 14, negativna kontrola; proga 15, referenčni vzorec za Bif. infantis; proga 16, DNA iz izdelka; proga 17, DNA iz izdelka; proga 18, negativna kontrola. Figure 1: Representative picture of agarose gel (2 % w/vol agarose) after electrophoresis of DNA samples isolated from the cultivable population of probiotics from different probiotic products and amplified in PCR specific for different bacterial species: Bif. lactis (lanes 2-4, 680 bp), Bif. bifidum (lanes 6-8, 278 bp), Bif. longum (lanes 12-14, 831 bp) and Bif. infantis (lanes 15-18, 828 bp). Lanes 1, 11 and 19, DNA ladder 100 bp (Fermentas); Lanes 10 and 20, DNA ladder Ultra low range (Fermentas); lane 2, reference DNA of Bif. lactis; lanes 3 and 4, DNA from two products; lane 5, negative control; lanes 6-8, DNA from three products; lane 9, negative control; lanes 12 and 13, DNA from two products; lane 14, negative control; lane 15, reference DNA of Bif. infantis; lane 16, DNA from a product; lane 17, DNA from a product; lane 18, negative control. Velja pa omeniti, da mnogi menijo, da metoda štetja na ploščah, ki se tradicionalno uporablja za ugotavljanje kakovosti probiotičnih izdelkov, ni najprimernejša. Razen tega, da je selektivnost razpoložljivih gojišč nezadostna, kar lahko vodi v precenjeno število posameznih probiotičnih bakterij, je znano tudi, da sposobnosti razmnoževanja oz. kultivabilnosti probiotičnih bakterij v laboratorijskih pogojih ne moremo enačiti z živostjo in aktivnostjo. Lahtinen in sod. so na primer pokazali, da imajo tudi probiotične bakterije, ki niso sposobne zrasti na gojišču, nekatere lastnosti živih celic, kot so esterazna aktivnost, nepoškodovana citoplazmina membrana in ohranjen pH gradient (20). V zadnjem času se uveljavljajo tudi alternativne metode za ugotavljanje živosti, med katerimi je poleg tekočinske citometrije zelo obetavna tudi metoda PCR v realnem času, ki v kombinaciji s tretiranjem vzorcev s propidijevim monoazidom omogoča razlikovanje nepoškodovanih bakterij od mrtvih (21). V bližnji prihodnosti lahko zato pričakujemo nove in/ali izpopolnjene metode ter standarde, ki bodo omogočili zanesljivejšo in bolj striktno kontrolo probiotičnih izdelkov, kar bo v korist in zaščito tako potrošnika kot kakovostnih proizvajalcev. 4 Sklep Na slovenskem trgu je trenutno naprodaj več probiotičnih prehranskih dopolnil, ki ne ustrezajo deklaracijam. Odstopanja so največja pri številu živih probiotičnih bakterij, v nekaterih izdelkih pa ni prisotnih živih predstavnikov vseh deklariranih vrst. Ugotovljeno stanje kaže na potrebo po boljši kontroli kakovosti tovrstnih izdelkov. Zagotavljanje kakovosti otežuje tudi pomanjkanje ustreznih, standardiziranih metod za ugotavljanje števila živih probiotikov, ter akreditiranih laboratorijev. Kljub številnim pomanjkljivostim so zaenkrat še vedno najbolj razširjene kultivacijske metode. Kombinacija slednjih z molekularno biološkimi metodami omogoča preverjanje selektivnosti metode štetja na ploščah ter potrjevanje prisotnosti posameznih vrst v izdelkih. 5 Literatura 1. Tuš M, Mlinarič A. Prehranska dopolnila - zakonodaja, problematika, primeri. Farm Vest, 2007; 58:72-73. 2. Pravilnik o prehranskih dopolnilih (Uradni list RS, št. 82/03, 44/04, 72/05 in 22/07). 3. Uredba (ES) št. 1924/2006 Evropskega Parlamenta in Sveta o prehranskih in zdravstvenih trditvah na živilih. 4. Matijasic BB, Rogelj I. Demonstration of suitability of probiotic products. An emphasis on survey of commercial products obtained on Slovenian market. Agro Food Ind Hi Tech, 2006; 17(3): 38-40. 5. ISO 4833: Microbiology - General Guidance for the enumeration of microorganisms - Colony count technique at 30 °C, 1991: 5. 6. Matsuki T, Watanabe K, Tanaka R, Fukuda M, Oyaizu H. Distribution of Bifidobacterial species in human intestinal microflora examined with 16S rRNA-gene-target species-specific primers. Appl Environ Microbiol, 1999: 65: 4506-4512. 7. Walter J, Tannock GW, Tilsala - Timisjarvi A, Rodtong S, Loach DM, Munro K, Alatossava T. Detection and identification of gastrointestinal Lactobacillus species by using denaturing gradient gel electrophoresis and species-specific PCR primers. Appl Environ Microbiol, 2000; 66: 297303. 8. Ward LJH, Timmins MJ. Differentiation of Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei and Lactobacillus rhamnosus by polymerase chain reaction. Lett Appl Microbiol, 1999; 29: 90-92. 9. Chagnaud P, Machinis K, Coutte LA, Marecat A, Mercenier A. Rapid PCR-based procedure to identify lactic acid bacteria: application to six common Lactobacillus species. J Microbiol Meth, 2001; 44: 139-148. 10. Torriani S, Zapparoli G, Dellaglio F. Use of PCR-Based Methods for Rapid Differentiation of Lactobacillus delbrueckii subsp. bugaricus and L. delbrueckii subsp. lactis. Appl Environ Microbiol, 1999; 65(10): 4351-4356. 11. Deasy BM, Rea MC, Fitzgerald GF, Cogan TM, Beresford TP. Rapid PCR Based Method to Distinguish between Lactococcus and Enterococcus. Syst Appl Microbiol, 2000; 23: 510-522. 12. Dutka-Malen S, Evers S, Courvalin P. Detection of Glycopeptide Resistance Genotypes and Identification to the Species Level of Clinically Relevant Enterococci by PCR. J Clin Microbiol, 1995; 33: 24-27. 13. Tilsala-Timisjärvi A, Alatossava T. Development of oligonucleotide primers from the 16S-23S rRNA intergenic sequences for identifying different dairy and probiotic lactic acid bacteria by PCR. Int J Food Microbiol, 1997; 35: 49-56. 14. Klijn N, Weerkamp AH, De Vos WM. Identification of Mesophilic Lactic Acid Bacteria by Using Polymerase Chain Reaction-Amplified Variable Regions of 16S rRNA and Specific DNA Probes. Appl Environ Microbiol, 1991; 57(11): 3390-3393. 15. Hamilton-Miller JM, Shah TS, Winkler JT. Public health issues arising from microbiological and labeling quality of foods and supplements containing probiotic microorganisms. Pub Health Nutr, 1999; 2: 223-229. 16. Temmerman R, Pot B, Huys G, Swings J. Identification and antibiotic susceptibility of bacterial isolates from probiotic products. Int J Food Microbiol, 2003; 81(1): 1-10. 17. Elliot E, Teversham K. An evaluation of nine probiotics available in South Africa, August 2003. S Afr Med J, 2004; 94(2): 121-4. 18. Huff BA. Caveat emptor. "Probiotics" might not be what they seem. Can Fam Physician, 2004; 50: 583-7. 19. Aureli P, Fiore A, Scalfaro C, Casale M, Franciosa G. National survey outcomes on commercial probiotic food supplements in Italy. Int J Food Microbiol, 2010; 137(2-3): 265-273. 20. Lahtinen SJ, Ouwehand AC, Reinikainen JP, Korpela JM, Sandholm J, Salminen SJ. Intrinsic Properties of So-Called Dormant Probiotic Bacteria, Determined by Flow Cytometric Viability Assays. Appl Environ Microbiol, 2006; 72(7): 5132-5134. 21. Kramer M, Obermajer N, Bogovic Matijasic B, Rogelj I., Kmetec V. Quantification of live and dead probiotic bacteria in lyophilised product by real-time PCR and by flow cytometry. Appl Microbiol Biotechnol, 2009: 84(6): 1137-1147.