Sašo Mravljak1, Petra Hudler2, Blaž Grošelj3 Biološke osnove zdravljenja z ionizirajočim sevanjem The Biological Principles of Ionizing Radiation Treatment IZvLEČEK KLJUČNE BESEDE: ionizirajoče sevanje, radioterapija, rak, radiosenzitivnost, DNA-popravljalni mehanizmi Ionizirajoče sevanje se uporablja za zdravljenje raka. Temelji na glavnem učinku ionizi- rajočega sevanja, poškodbi molekule DNA in posledičnem odmrtju obsevane celice. Poleg poškodb DNA povzroča tudi druge znotrajcelične poškodbe makromolekul. Glavna razli- ka med zdravim in rakastim tkivom je boljša sposobnost zdravih celic v popravljanju zno- trajceličnih poškodb. Obsevanje se izvaja v dnevnih odmerkih – frakcijah, kar omogoči zdravemu tkivu, da lahko sproti in učinkoviteje kot rakasto popravlja nastale znotrajce- lične poškodbe. V prispevku bomo predstavili različne učinke ionizirajočega sevanja na celico. Predstavljeni bodo glavni biološki mehanizmi, ki jih zdrava celica uporabi, da je zdravljenje z ionizirajočim sevanjem učinkovito. aBSTRaCT KEY WORDS: ionizing radiation, radiotherapy, cancer, radiosensitivity, DNA repair mechanisms Ionizing radiation is a method used to treat cancer. It is based on the main effect of ioni- zing radiation, namely, the damage to the DNA molecule, and the resulting death of the irradiated cell. In addition to DNA damage, it also causes other intracellular damage to macromolecules. The big difference between healthy and cancerous tissue is that healt- hy cells are better able to repair intracellular damage. Irradiation is delivered in daily doses – fractions – so that healthy tissue can repair intracellular damage more efficiently than cancerous tissue. This article presents the various effects of ionizing radiation on the cell. The main biological mechanisms used by the cell to make ionizing radiation treat- ment effective are also presented. 1 Sašo Mravljak, štud. med., Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Vrazov trg 2, 1000 Ljubljana; saso.mravljak@mf.uni-lj.si 2 Izr. prof. dr. Petra Hudler, univ. dipl. mikr., Inštitut za biokemijo in molekularno genetiko, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Vrazov trg 2, 1000 Ljubljana; petra.hudler@mf.uni-lj.si 3 Doc. dr. Blaž Grošelj, dr. med., Sektor za radioterapijo, Onkološki inštitut Ljubljana, Zaloška cesta 2, 1000 Ljubljana; Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Vrazov trg 2, 1000 Ljubljana; Katedra za onkologijo, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Zaloška cesta 2, 1000 Ljubljana; bgroselj@onko-i.si 319Med Razgl. 2023; 62 (3): 318–38 • doi: 10.61300/mr6203008 • Pregledni članek mr23_3_Mr10_2.qxd 26.9.2023 9:26 Page 319 UvOD Ionizirajoče sevanje se že več kot stoletje uporablja za zdravljenje raka, v redkih pri- merih pa tudi za benigna obolenja. Slovenci so, še v Avstro-Ogrski monarhiji, bili med prvimi  na  svetu,  ki  so  tovrstno  sevanje uporabljali za zdravljenje. Dr. Emil Bock iz Deželne bolnišnice v Ljubljani  je  že  leta 1902 kupil prvi radijev aplikator. Prav tako pa smo bili med prvimi na svetu, kjer se je tovrstno zdravljenje razvilo v samostojno medicinsko specializacijo – radioterapijo – onkološko  vedo,  ki  ionizirajoče  sevanje uporablja za zdravljenje pretežno malignih bolezni.  Temelji  predvsem  na  glavnem učinku ionizirajočega sevanja – poškodbah najpomembnejše molekule v celici – DNA, kar navadno vodi v odmrtje obsevane celi- ce (1, 2). Vsaka prizadeta celica po tovrst- nem zdravljenju lahko odmre – tako zdra- va  kot  tudi  rakasta,  kar  je  odvisno  od sevalnega  odmerka.  Glavna  razlika  med zdravim  in  rakastim  tkivom pa  je  boljša sposobnost  zdravih  celic  v  popravljanju znotrajceličnih poškodb. Tkiva, tako zdra- va kot tudi rakasta, so različno občutljiva za  ionizirajoče  sevanje,  zato  govorimo o radiosenzitivnosti. Obsevanje (zdravljenje z  ionizirajočim  sevanjem)  se  izvaja  po dnevnih odmerkih – frakcijah. Na ta način se omogoči, da zdravo tkivo lahko sproti učinkoviteje popravlja nastale znotrajceli- čne poškodbe in si opomore. Zdravljenje se izvaja  načeloma  do  sevalne  meje,  ko  je popravilo zdravih celic še učinkovito in torej poškodba  zdravega  tkiva  še  popravljiva. Ob teh odmerkih je verjetnost, da tumorsko tkivo odmre, še vedno velika. V prispevku bomo podrobneje predstavili različne učin- ke, ki jih ima sevanje na celico – biološke osnove zdravljenja z ionizirajočim sevanjem. FIZIKaLNI UČINKI SEvaNJa Sevanje je naravno prisotno v našem oko- lju že od začetka obstoja planeta. Posledično se je življenje razvilo in prilagodilo v okolju, na katerega deluje tudi sevanje. Poznamo 320 Sašo Mravljak, Petra Hudler, Blaž Grošelj Biološke osnove zdravljenja z ionizirajočim sevanjem več vrst sevanj. Sevanja prihajajo iz veso- lja  (prasevanje  oz. mikrovalovno  sevanje ozadja) ter iz zemlje, kar imenujemo zemelj- sko sevanje. Prav tako sevanje izvira tudi iz naših  lastnih  teles,  kar  opisujemo kot notranje  sevanje.  V  sledeh  je  prisotno v zraku, hrani, vodi in v gradbenih mate- rialih, ki se uporabljajo pri gradnji domov in drugih konstrukcij (3). Sevanje je oddajanje elektromagnetnih valov ali osnovnih delcev iz izvora v pro- stor  (4).  Elektromagnetno  sevanje potuje skozi prazen prostor s hitrostjo 3,0 × 108 metrov na sekundo – 300.000 kilometrov na sekundo. Elektromagnetni spekter vključuje na  nizkofrekvenčnem  (dolgovalovnem) koncu spektra radijske valove (pod katere spada  tudi  kratkovalovno  sevanje  (KV), katerega navidezno paradoksno poimeno- vanje izhaja iz prvotne razdelitve radijskih valov), nato mikrovalove, infrardeče seva- nje, vidno svetlobo, ultravijolično sevanje (UV), rentgenske žarke in na skrajnem viso- kofrekvenčnem  (kratkovalovnem)  koncu še žarke gama (slika 1). Energija fotona je premo sorazmerna s frekvenco valovanja, zato imajo žarki gama najvišjo energijo (pri- bližno eno milijardo elektronvoltov (eV)), medtem ko imajo radijski valovi zelo nizko energijo (približno 1 feV) (3, 5, 6). Ionizirajoče in neionizirajoče sevanje Sevanje delimo na ionizirajoče in neioni- zirajoče – kot pove ime, na lastnost, če lahko povzroči ionizacijo snovi, s katero medse- bojno delujejo. To pomeni, da ionizirajoče sevanje izbija elektrone atomom, ki pride- jo v stik s sevanjem. Okoljsko sevanje  je večinoma  neionizirajoče  vrste,  vključno s pretežnim delom ultravijoličnega (UV) in velikim delom ostalega elektromagnetne- ga spektra. Ionizirajoče sevanje vključuje visokofrekvenčni  del  elektromagnetnega spektra – rentgenske žarke in žarke gama ter sevanje v obliki delcev, kot so delci alfa, beta in nevtroni. Pod ionizirajoče sevanje mr23_3_Mr10_2.qxd 26.9.2023 9:26 Page 320 se lahko uvršča tudi UV-sevanje z višjimi frekvencami oz. višjo energijo – del UV-C- -spektra, del daljnega UV-spektra (angl. far ultraviolet)  in  skrajni  UV-spekter  (angl. extreme ultraviolet)  (5–7).  Sevanje,  ki  se uporablja v radioterapiji, je bodisi elektro- magnetno (npr. rentgensko sevanje) bodisi sevanje delcev (npr. obsevanje z elektroni) in vodi v ionizacijo snovi/bioloških molekul (8). Sevanje delcev sestavljajo delci alfa, ki  so  jedra helija z dvema protonoma  in dvema nevtronoma. So težki in pozitivno nabiti delci. Ker energijo izgubljajo izred- no hitro, ne morejo prodreti skozi kožo oz. dlje kot 0,04mm v tkivo, zato se za zuna- nje obsevanje ne uporabljajo. Težava lahko nastane,  če  jih  zaužijemo  ali  vdihnemo. Tovrstno  tveganje poznamo npr. pri vdi- hovanju  plina  radona  in  lahko  predsta- vljajo tveganje za občutljive organe, pred- vsem pljuča (3, 8, 9). Delci alfa imajo visok linearni prenos energije (angl. linear energy transfer, LET), kar pomeni, da na svoji poti skozi  snov  ionizirajoči delec odda veliko energije snovi, preko katere prehaja. Tako na svoji poti oddajajo energijo, ki je od 100- do 1000-krat večja od energije, ki jo odda- jajo žarki gama, in povzročijo veliko ioni- zacij (10). Energija, ki se absorbira v enoti mase snovi, je absorbiran odmerek (enota za merjenje  je gray (Gy)). Če ta odmerek uravnovesimo glede na relativno biološko učinkovitost, dobimo ekvivalentni odmerek (enota za merjenje je sievert (Sv)). Delci alfa  imajo  zelo  visok  dejavnik  relativne biološke učinkovitosti (4). Poškodbe, ki jih povzročajo alfa delci, so predvsem dvojni prelomi DNA (angl. double-strand breaks, DSB), ki so kot poškodbe večinoma težje popravljivi (8, 9). Terapevtsko se delce alfa uporablja pri notranjem obsevanju z npr. Ra223 za zdravljenje razsejanega raka pro- state pri bolnikih s kostnimi zasevki (10). Brahiterapija  oz.  notranje  obsevanje  je 321Med Razgl. 2023; 62 (3): naraščajoča valovna dolžina naraščajoči energija in frekvenca rentgenski žarki žarki γ ultravijolično sevanje infrardeče sevanje mikrovalovi FM TV KV AM radijsko valovanje 1 x 10 4 1 x 10 2 1 x 10 –2 1 x 10 –4 4 x 10 –7 5 x 10 –7 6 x 10 –7 7 x 10 –7 valovna dolžina (m) 1 x 10 –8 1 x 10 –12 1 x 10 –14 Elektromagnetni spekter vid a svetloban Slika 1. Elektromagnetno sevanje ima lastnost elektromagnetnega valovanja in hkrati delca energije (foto- na) in ga lahko ponazorimo s t. i. elektromagnetnim spektrom. Visokofrekvenčni del elektromagnetnega spektra spada pod ionizirajoče sevanje. Sposobnost ionizacije ima tudi sevanje nekaterih drugih delcev, ki niso del elektromagnetnega spektra in nimajo omenjene dvojne lastnosti. Ustvarjeno s spletnim orod- jem BioRender.com (4, 6, 7). mr23_3_Mr10_2.qxd 26.9.2023 9:26 Page 321 način zdravljenja z ionizirajočim sevanjem, pri katerem so viri sevanja v neposredni bli- žini ali pa v tumorju (4). V drugo skupino sevanja delcev uvrš- čamo delce beta, ki so visokoenergijski elek- troni. Gibljejo se hitro in imajo negativni naboj. Imajo večji doseg v zraku v primer- javi z alfa delci in lahko prodrejo skozi kožo, a jih zaustavi že tanka plast plastične ali alu- minijaste  folije  in  oblačila.  Podobno  kot delci alfa so nevarnejši pri zaužitju ali vdi- hanju (3). V medicini se delci beta upora- bljajo  pri  zdravljenju  različnih  vrst  raka, predvsem z brahiterapevtskimi aplikator- ji stroncija  (Sr90) za zdravljenje tumorjev očesne veznice (11).  V tretjo skupino ionizirajočega sevanja prištevamo fotone visoke energije, kot so rentgenski žarki (oz. žarki X) in žarki gama, ki so oboji del spektra elektromagnetnega sevanja (8). Rentgenski žarki in žarki gama imajo  bistveno  višjo  energijo,  kot  delci alfa ali beta, kar jim omogoča prehod več- jih razdalj. Imajo izjemno prodorne lastnosti in  zahtevajo  robustnejšo  zaščito,  kot  je debela svinčena obloga, da se zmanjša nji- hov učinek. Rentgenski žarki se uporablja- jo v slikovni diagnostiki (npr. rentgensko slikanje  in  slikanje  s  CT)  zaradi  svoje značilnosti, da lažje prodirajo skozi kožo in druga  mehka  tkiva  kot  skozi  kosti. Uporabljajo se tudi za radioterapevtsko zdra- vljenje praktično vseh tumorjev in v neka- terih primerih celo pri zdravljenju benignih lezij (3, 8). Viri sevanja z nizkim LET, kot so rentgenski žarki in žarki gama, povzročajo redko (sporadično) ionizacijo na poti skozi snov (12). Na kvantni ravni neionizirajoče sevanje nima  dovolj  energije,  da  bi  popolnoma izbilo elektron iz atoma oz. molekule (kar se imenuje ionizacija), vendar lahko vzbu- di  elektrone  in  povzroči  prehod  atoma v vzbujeno stanje (13). V nasprotju z neio- nizirajočim je ionizirajoče sevanje veliko agresivnejše pri medsebojnem delovanju z makromolekulami, a tudi neionizirajoči viri sevanja lahko škodujejo biološkim tki- vom (7, 14, 15). KEMIČNI UČINKI SEvaNJa Osrednja dogma radiobiologije je, da ioni- zirajoče  sevanje  poškoduje  tako  celične strukture kot tudi celične molekule, pred- vsem  nukleinske  kisline,  kar  lahko  vodi v celično smrt. Poškodbe nukleinskih kislin se kažejo kot spremembe kemijske struk- ture nukleotidnih baz in sladkorjev, enojni prelomi  DNA  (angl.  single-strand breaks, SSB) in DSB ter združevanje oz. navzkrižno povezovanje molekul DNA. V celično smrt pa poleg sevalnih poškodb molekule DNA lahko vodijo tudi poškodbe znotrajceličnih beljakovin  in  lipidov  ter  organelov,  npr. mitohondrijev  in  endoplazemskega  reti- kuluma (7, 16). Izpostavljenost sevanju povzroči poškod- be dušikovih baz, kot so oksidativne spre- membe dušikovih baz in prelomi DNA, ki lahko vodijo do nastanka abazičnih mest. Reakcije med dušikovimi bazami, hidrok- silnimi radikali kot tudi hidriranimi elek- troni  potekajo  s  hitrostjo,  ki  jo  omejuje difuzija. Reakcije lahko obsegajo npr. desa- turacijo (uvajanje dvojnih vezi, da molekula nastane nenasičena) ter odvzem vodikovih atomov od metilnih in aminskih skupin (7). Glavni  vzrok  za  nastanek  prelomov DNA je sevalna poškodba deoksiriboze. Ta poškodba se pojavi naključno in pogosto neposredno zaradi t. i. hidroksilnega napa- da –  ko  hidroksilni  radikal  neposredno učinkuje na molekulo DNA ter na encime, vezane na nukleinsko kislino. DSB nasta- nejo, ko dva hidroksilna radikala koordini- rano  medsebojno  delujeta  z  bližnjimi sladkornimi mesti, kar vodi do pretrganja vijačnice. Hidroksilni radikali lahko poleg deoksiriboze  poškodujejo  tudi  dušikove baze (7). DSB, ki jih povzroča ionizirajoče sevanje, predstavljajo najbolj smrtonosno vrsto  poškodb  DNA,  če  jih  popravljalni mehanizmi poškodb DNA ne uspejo popra- viti.  Učinkoviti  popravljalni  mehanizmi 322 Sašo Mravljak, Petra Hudler, Blaž Grošelj Biološke osnove zdravljenja z ionizirajočim sevanjem mr23_3_Mr10_2.qxd 26.9.2023 9:26 Page 322 tako predstavljajo ključno obrambno lini- jo proti tovrstnim poškodbam (1). BIOLOšKI UČINKI SEvaNJa Biološki učinki sevanja so odvisni od vrste sevanja, količine izpostavljenosti ter vrste tkiv, ki so izpostavljena sevanju. Različne vrste  ionizirajočega  sevanja  povzročajo različne vzorce poškodb. Delci alfa navad- no povzročijo poškodbe na površini kože, če jih  vdihnemo,  pa  lahko  povzročijo  tudi poškodbe v tkivih. Delci beta običajno pov- zročajo lokalne poškodbe, kot so opekline, vendar lahko poškodujejo tudi globlja tkiva, če  jih zaužijemo ali vdihnemo. Nevtroni, rentgensko sevanje in sevanje gama lahko povzročijo tako lokalne poškodbe kot tudi sevalno bolezen, če je prizadet velik del tele- sa (12). Biološki učinki sevanja so odvisni tudi od vrste izpostavljenih tkiv. Michalowski deli  tkiva  na  hierarhična  in  fleksibilna. Glede na model obstajajo tri celične vrste. Matične celice služijo namenu podvajanja, pri  čemer  nastanejo  hčerinske  celice,  ki ohranjajo nabor matičnih celic ali se dife- rencirajo v različne vrste celic. Te celice so predvsem v bazalni plasti kože ali znotraj črevesnih kript. Funkcionalne celice pred- stavljajo  popolnoma  zrele  celice,  ki  niso sposobne nadaljnje delitve. Zajemajo zrele epitelijske celice v črevesju in koži ter krvne celice, kot so nevtrofilci in rdeče krvničke. Tretja vrsta so dozorevajoče, delno diferen- cirane celice, ki se še lahko delijo, a je njihov delitveni potencial omejen zaradi odsotno- sti telomeraze. Takšne celice najdemo npr. v kostnem mozgu (17, 18). Za hierarhična tkiva (tip H) je značilna prisotnost vseh treh vrst celic. Matične celi- ce nenehno ustvarjajo dozorevajoče celice, ki  sčasoma  dosežejo  popolno  zrelost  in postanejo funkcionalne celice. Hierarhična tkiva obsegajo večino epitelijskih plasti in kostni  mozeg.  V  splošnem  se  tkiva  tipa H hitro odzovejo na poškodbe zaradi seva- nja, saj  je prizadeta občutljiva populacija matičnih celic. To zavira proizvodnjo zre- lejših celic, kar vodi do znakov, kot je stanj- šanje pokožnice ali zmanjšana proizvodnja krvnih celic. Nasprotno pa fleksibilna tkiva (tip F) obsegajo funkcionalne celice, ki se načeloma redko delijo, vendar jih je mogo- če k temu spodbuditi kot odgovor na poškod- bo. Te celice so funkcionalne, vendar ohranijo sposobnost  ponovnega  vstopa  v  celični cikel, če je to potrebno. Primeri tkiv tipa F vključujejo jetra, ščitnico in usnjico kože. Večina tkiv je mešanica obeh tipov in se nji- hov odziv na sevanje temu primerno razli- kuje (17, 18). Torej, tkiva s celicami, ki imajo kratek življenjski cikel, so dovzetnejša za sevanje. To sevanje sproži znotrajcelične mehaniz- me, ki vodijo v eno od vrst celične smrti – najpogosteje apoptozo, lahko pa tudi nekro- zo. Hitro deleče se celice, npr. spermatoci- ti,  hematopoetski  prekurzorji,  krožeči limfociti in črevesne kriptne celice, spada- jo med najobčutljivejše celične tipe (12, 19). NEPOSREDNI IN POSREDNI UČINKI SEvaNJa Dva glavna mehanizma medsebojnega delo- vanja ionizirajočega sevanja z biološkimi molekulami so neposredni učinki, kjer gre za odlaganje energije v makromolekule, in posredni učinki, pri katerih energija med- sebojno deluje z vodo in tvori reaktivne kisi- kove  zvrsti  (angl.  reactive oxygen species, ROS).  ROS  imajo  samoojačevalni  učinek preko  medsebojnega  delovanja  z  lipidi, predvsem  membranskimi,  in  s  kisikom. Neposredni  škodljivi  učinki  se  navadno hitreje popravijo, medtem ko lahko škoda zaradi  posrednih  učinkov,  posredovanih z ROS, vztraja in se krepi. Neposredni učin- ki so tudi redkejši, ker je verjetnost, da žarek zadene DNA, relativno majhna, saj te kri- tične komponente sestavljajo majhen del celice (20). Neposredni učinki ionizirajočega sevanja vključujejo medsebojno delovanje energije s snovjo, ki vodi v ionizacijo na molekuli 323Med Razgl. 2023; 62 (3): mr23_3_Mr10_2.qxd 26.9.2023 9:26 Page 323 DNA (20). To lahko vodi v strukturne spre- membe  DNA  in  posledično  v  poškodbe celic  ali  celo  njihovo  smrt.  Poškodovane celice, ki preživijo, lahko kasneje povzročijo karcinogenezo ali druge nepravilnosti. Ta proces je prevladujoč pri sevanjih z visokim LET ter pri obsevanju z visokimi odmerki (21).  Rakave  celice  lahko  pridobijo  tudi genetske spremembe, ki povzročajo izgu- bo učinkovitih mehanizmov obrambe proti poškodbam DNA, kar vodi v večjo občut- ljivost za ionizirajoče sevanje (radiosenzi- bilnost)  rakavih  celic  (1).  V  vsakodnevni radioterapevtski  praksi  je  ravno  razlika v občutljivosti zdravih in rakavih celic na sevalne poškodbe ključen dejavnik za uspe- šno izvedeno zdravljenje. Iskanje načinov, kako oslabiti popravljalne mehanizme raka- vih celic, je predmet številnih raziskav. Tako je ciljanje signalnih poti odziva na poškod- be DNA eden izmed ključnih in obetavnih pristopov za selektivno radiosenzibilizaci- jo rakavih celic. Usmerjenost žarkov gama ali rentgen- skih žarkov v vodo celic vodi v tvorbo ROS, kot sta hidroksilni radikal (•OH) in ionizi- rana voda (H2O +). Obstaja tudi vrsta drugih manj raziskanih reducentov, kot sta vodi- kov radikal (H•) in hidrirani elektroni (eaq –). V zelo kratkem času se tvorijo tudi sekun- darni ROS, ki so posledica primarnih ROS, npr. superoksid (O2• –) in vodikov peroksid (H2O2). Med radiolitičnimi produkti vode so najpogostejši hidroksilni radikali, ki lahko povzročijo pomembne poškodbe nuklein- skih kislin (7). Kar 60% celične škode ioni- zirajočega sevanja z rentgenskimi žarki in žarki gama povzročijo posredni učinki seva- nja (1). V nekaterih primerih so poškodbe s prostimi radikali neposreden vzrok bole- zenskega stanja (npr. poškodbe tkiva zaradi izpostavljenosti ionizirajočemu sevanju) (22). Nastanek ROS lahko vodi tudi v nastanek rea- ktivnih dušikovih zvrsti (angl. reactive nitro- gen species, RNS),  kot  so  peroksinitritni anion (OONO–), dušikov dioksid (NO2•) in didušikov  trioksid  (N2O3).  Na  splošno  je tvorba ROS in RNS zaradi ionizirajočega sevanja še posebej škodljiva za celico, saj so v mnogih primerih novonastali reakcij- ski produkti bolj reaktivni kot njihovi pred- hodniki (7). Skupni (kumulativni) učinki zgodnjih, hitrih biokemičnih procesov, ki jih povzroča ionizirajoče sevanje, se kažejo v kasnejših fazah celične škode, vključno z upočasnje- vanjem celične delitve, poškodbami signal- nih  beljakovin  in  poškodovanjem  mem- brane. Ti celični učinki se lahko pojavijo v obdobju od nekaj minut do 10 ur (7). Učinek očividca Učinek očividca  (angl. bystander effect)  je opredeljen kot biološki učinek, ki se izrazi v (bližnjih) celicah, katerih jedra niso bila neposredno obsevana. V onkologiji je ta uči- nek znan tudi kot sevalno sprožen učinek očividca (angl. radiation induced bystander effect,  RIBE).  Učinek  sta  prva  opisala Nagasawa  in  Little  in  vključuje  različne učinke  na  celico  in  jedro,  med  drugimi DNA-poškodbe,  kromosomsko  nestabil- nost,  genetske  spremembe  in  apoptozo. Vloga in razsežnost RIBE v klinični radio- terapiji še ni dobro opredeljena (1, 23, 24). Posredovanje signalov med neposredno obsevano  celico  in  celicami  v  bližini  se lahko doseže preko različnih mehanizmov. Možna je izmenjava molekul med sosednji- mi celicami skozi presledkovne stike, spo- razumevanje med oddaljenimi celicami s pre- nosom topnih dejavnikov, izmenjava hlapnih komponent med fizično ločenimi populaci- jami celic ter prenosom elektromagnetnih signalov  (npr. preko UV-sevanja) od obse- vanih celic do oddaljenih celic (25, 26).  Obsevane celice izločajo signalne mole- kule, ki vstopajo v neizpostavljene zdrave celice, kar lahko pri njih vodi v podoben odziv kot pri neposredno obsevanih celicah. Med signalnimi molekulami učinka se je izkazal za pomembnega posrednika transformirajoči rastni  dejavnik  beta  1  (angl.  transforming growth factor beta 1, TGF-β1), verjetno pa tudi 324 Sašo Mravljak, Petra Hudler, Blaž Grošelj Biološke osnove zdravljenja z ionizirajočim sevanjem mr23_3_Mr10_2.qxd 26.9.2023 9:26 Page 324 številni drugi potencialni posredniki, kot so tumorje nekrotizirajoči dejavnik alfa (angl. tumor necrosis factor alpha,  TNF-α),  inter- levnik 6 (IL-6), IL-8 in ROS (1). Nedavno objavljene raziskave nakazu- jejo, da je eden od pomembnih mehanizmov celičnega sporazumevanja, posredovanega s topnimi dejavniki, (tudi) medcelično spo- razumevanje z zunajceličnimi vezikli, pred- vsem z eksosomi. Ti vezikli lahko vsebujejo mRNA, mikroRNA (miRNA) in beljakovine, ki so  funkcionalne  in se  lahko prenesejo v druge celice, kar vodi v imunski odziv/kar- cinogenezo (27). V kontekstu RIBE, posre- dovanih preko eksosomov, proces verjetno spodbuja  tako  citotoksične/genotoksične učinke kot tudi zaščitne učinke za celico. V raziskavah so npr. odkrili, da so eksoso- mi, sproščeni iz obsevanih celic raka dojk, povečali raven kromosomskih aberacij in spodbudili proizvodnjo ROS. Po drugi stra- ni pa je bilo ugotovljeno, da eksosomi, sproš- čeni iz obsevanih celic raka glave in vratu, spodbujajo popravljanje DNA in s tem pri- 325Med Razgl. 2023; 62 (3): spevajo  k  povečani  neobčutljivosti  celic, tkiv ali organov za  ionizirajoče sevanje – radiorezistenci (26, 28, 29). Daljnotarčni učinek Abskopalni učinek (angl. abscopal effect) je sposobnost lokaliziranega sevanja, da spro- ži protitumorski odziv na oddaljenih mestih, ki sevanju niso bila izpostavljena. V iska- nju primernega slovenskega izraza ga bomo v nadaljevanju poimenovali »daljnotarčni uči- nek«. Vključuje imunski odziv, ki je v veliki meri posredovan s citotoksičnimi limfociti T (s prisotnim označevalcem tkivne sklad- nosti  8  (angl.  cluster of differentiation 8, CD8)) in ga pretežno sprožijo učinki seva- nja na tumorsko tkivo, kar povzroči sproš- čanje antigenov v krvni obtok. Ta proces lahko  sproži  imunski  odgovor  (slika 2). Daljnotarčni učinek  je prvič opisal Mole v začetku 50. let prejšnjega stoletja (30–32). Radioterapija običajno deluje imuno- supresivno – predvsem, če so v obseva- nem polju limfne bezgavke. Obstajajo pa limfna bezgavka antigeni APC imunski odziv imunski odziv obsevane tumorske celice neobsevane celice tumorskega zasevka naivni citotoksični limfocit T aktivirani citotoksični limfocit T Slika 2. Diagram, ki prikazuje mehanizem aktivacije imunskega odziva na radioterapijo. Antigene iz poško- dovanih tumorskih celic lahko privzamejo antigen predstavitvene celice (APC), ki nato potujejo v limfno bezgavko in sprožijo aktivacijo limfocitov T. Aktivirani limfociti T, usmerjeni proti tumorsko specifičnim antigenom, nato vstopijo v primarni tumor in neobsevane tumorske zasevke. Legenda receptorjev: △ – ligand za receptor Fas, membransko beljakovino aktiviranih limfocitov T in nekaterih drugih vrst celic (angl. first apoptosis signal ligand, FasL), ○ – T-celični receptor, □ – receptor programirane celične smrti 1 (angl. programmed cell death receptor 1, PD-1) (33). mr23_3_Mr10_2.qxd 26.9.2023 9:26 Page 325 raziskave, ki kažejo, da lahko povzroči tudi spremembe v imunskem sistemu, ki so bla- godejne  za  bolnike  z  rakom.  Obsevanje namreč povišuje izražanje kalretikulina na površini  umirajočih  tumorskih  celic,  kar dendritičnim  celicam  olajša  prepoznavo in  fagocitozo mrtvih  tumorskih  celic. Te umirajoče tumorske celice lahko izločajo tudi molekule, ki delujejo kot signali nevar- nosti in pripomorejo k izboljšanju zorenja dendritičnih celic. Poleg neposrednega ubi- janja tumorskih celic sevanje spodbuja tudi izražanje beljakovin, ki olajšajo predstavi- tev antigenov, kar poteka tako, da antigen predstavitvena celica (APC) zajame s tumor- jem povezani antigen (angl. tumor-associated antigene, TAA) in ga predstavi citotoksične- mu limfocitu T. To vodi v lažjo prepoznavo tumorskih celic in napad tako na primar- no  tumorsko mesto  kot  tudi  na  zasevke drugje v telesu. Kaže, da sevanje spodbuja izražanje  kemokinov,  ki  lahko  vpokličejo aktivirane efektorske celice T pomagalke (s prisotnim CD4) in citotoksične limfoci- te T na mesta, kjer je tumor. Celokupno vsi mehanizmi spodbujajo izkušene citotoksi- čne  limfocite  T,  da  odstranijo  tumorske celice (33, 34). Klinični vidik daljnotarčnega učinka je nejasen, trenutno v obsegu poročil o posa- meznih primerih (35, 36). Zelo verjetno pa sinergistično  združevanje  radioterapije z imunoterapijo vodi v okrepljen daljnotarčni učinek, kar v prihodnosti morda omogoča uporabo  radioterapije  tudi  za  modalnost v zdravljenju razsejane bolezni (33).  DETERMINISTIČNI UČINKI SEvaNJa Deterministični  oz.  nestohastični  učinki so spremembe v organizmu po absorpciji pražnega oz. nadpražnega odmerka ionizi- rajočega  sevanja  (4).  Prag  odmerka,  pod katerim  se  ne  pojavijo,  se  razlikuje med zdravljenimi bolniki. Jakost učinka je lahko odvisna od časa in odmerka izpostavljeno- sti ter vrste sevanja. Vsi zgodnji učinki in večina pozno nastalih učinkov na tkiva so deterministični učinki. Vedno vodijo v smrt celice, če je odmerek dovolj velik (slika 3). Deterministične  učinke  lahko  delimo  na akutne in kronične učinke (13). Akutni  učinki  se  pojavijo,  ko  oseba prejme velik odmerek sevanja v kratkem času,  kar  povzroči  takojšnje  zdravstvene težave, kot so slabost, bruhanje, glavobol, vročina, opekline kože in tkiva (13). Z aku- tnimi učinki sevanja je povezan tudi pojem akutne sevalne bolezni, ki je kontinuiteta kliničnih  manifestacij  in  se  nanaša  na znake in simptome, ki so posledica absor- birane doze ionizirajočega sevanja več kot 1 Sv in se pojavijo v nekaj dneh po izpo- stavljenosti (4, 37, 38). Kronični učinki se pojavijo po dolgo- trajni izpostavljenosti sevanju in povzročajo dolgoročne učinke, kot so siva mrena, rak, genetske spremembe in začasna ali trajna neplodnost (13). Skupek bolezenskih znakov, ki  se  pojavijo  po  daljši  izpostavljenosti ionizirajočemu sevanju v odmerku do 1 Sv, imenujemo kronična sevalna bolezen  (4). Kronični učinki so nevarni in težko ozdra- vljivi ter lahko povzročijo celo smrt. Ti učin- ki niso takoj opazni in se lahko razvijejo v nekaj mesecih ali letih (13). STOHaSTIČNI UČINKI SEvaNJa Za stohastične oz. »naključne« učinke je zna- čilno, da se z višanjem odmerka povečuje verjetnost  pojavnosti  bolezni  in  nimajo praga, pod katerim je zagotovo, da se nega- tivni učinek ne bo pojavil, ter se lahko poja- vijo  z  zakasnitvijo  do  nekaj  desetletij. Somatski stohastični učinki so omejeni na izpostavljeno osebo in povzročajo posledi- ce, ki se  lahko kažejo pri  izpostavljenem posamezniku. Dedni stohastični učinki se pojavijo, ko ionizirajoče sevanje poškodu- je genetski material v reproduktivnih celi- cah, kar pomeni, da se lahko ti učinki/genet- ske  spremembe  prenašajo  iz  generacije v generacijo (slika 3). Sevalno povzročene genetske spremembe v genih in posamez- 326 Sašo Mravljak, Petra Hudler, Blaž Grošelj Biološke osnove zdravljenja z ionizirajočim sevanjem mr23_3_Mr10_2.qxd 26.9.2023 9:26 Page 326 zaščitni  in  znižajo  verjetnost  pojavnosti raka (39, 42). Luckey je leta 2008 predpo- stavil, da bi dvig izpostavljenosti praseva- nju iz običajnih 2–3 μSv/leto za 3000-krat na vse do 8 Sv/leto, prinesel mnogotere bla- godejne  učinke  (slika  3)  (39, 42, 44, 45). Primer te hipoteze je sporna študija Cohena iz leta 1995, ki je pokazala, da je pri ljudeh, ki  živijo  v  delih  ZDA  z  visokimi  ravnmi radioaktivnega plina radona, manj verjet- no, da bodo umrli zaradi pljučnega raka (46, 47). Vendar pa je leta 2003 Puskin pokazal, da je to mogoče bolje razložiti z upošteva- njem  različne  razširjenosti  kajenja  v  teh pokrajinah (48). Model učinka očividca je podrobneje opisan v poglavju Učinek oči- vidca (glej zgoraj) (39). DNa-POPRavLJaLNI MEHaNIZMI Neposredne in posredne poškodbe jedrne in mitohondrijske DNA zaradi sevanja in zaradi s sevanjem povzročenega oksidativ- nega stresa, kot so DSB, abazična mesta in oksidativne  poškodbe  dušikovih  baz  in deoksiriboze, zaznajo mehanizmi odziva na poškodbe DNA (angl. DNA damage respon- se, DDR) (16, 49, 50). Ti mehanizmi aktivi- rajo različne DNA-popravljalne mehanizme, odvisno od vrste poškodbe  (slika 4)  (50). Ionizirajoče  sevanje  v  celicah  sesalcev sproži nastanek približno 850 pirimidinskih lezij, 450 purinskih lezij, 1000 SSB in 20–40 DSB na celice na 1 Gy z nizkim LET. Vzorec odlaganja  energije  sevanja  v  strukturne 327Med Razgl. 2023; 62 (3): nikovi DNA lahko vodijo v splav oz. rojstvo otroka s prirojenimi malformacijami (tera- togenost)  (13, 39).  Pri  determinističnih učinkih opisujemo jakost učinka v odvis- nosti od odmerka. Pri stohastičnih učinkih pa takšne povezave ni, saj bo oseba razvi- la raka ali pa ga ne bo, in prag odmerka, pri katerem je tveganje za nastanek raka ničel- no, ne obstaja (13). Posledično lahko opazujemo odvisnost med verjetnostjo nastanka določenega sta- nja npr. vzbuditev (indukcijo) raka v odvis- nosti od odmerka. Za napovedovanje sto- hastičnih učinkov so bili predlagani različni modeli  (13, 39). Brezpražni premo soraz- meren model predpostavlja, da se tveganje za nastanek raka premo sorazmerno pove- čuje, minimalna količina sevanja, pri kate- ri ni tveganja za nastanek raka, pa ne obsta- ja. Dotični model sicer ne upošteva dejstva, da se živa bitja na Zemlji prilagajamo na prasevanje že milijarde let in smo razvili mehanizme, ki škodo sevanja preprečujejo in  popravljajo  že  nastalo  škodo  (39–42). Linearno-kvadratni model predlaga, da se tveganje za nastanek raka povečuje s kva- dratno premo sorazmerno funkcijo. Krivulja je esasta in kaže, da imajo največji vpliv na povečevanje verjetnosti za nastanek raka relativno srednji odmerki (39, 40, 43). Model odziva na odmerek, na katerega smo pri- lagojeni, imenovan tudi sevalna hormeza, ki predpostavlja, da so nizki odmerki seva- nja oz. odmerki, na katere smo prilagojeni, medsebojno delovanje sevanja in tkiva ni trajnih posledic nastanek prostih radikalov popravilo poškodb DNA–poškodbe celična smrt (deterministični učinki) trajna sprememba (stohastični učinki) genetska Slika 3. Diagram nastanka determinističnih oz. stohastičnih učinkov. mr23_3_Mr10_2.qxd 26.9.2023 9:26 Page 327 komponente nukleinske kisline določa pro- storsko razporeditev lezij v molekuli DNA, ki so lahko razporejene v skupkih na raz- dalji nekaj nanometrov – zaradi poti žarkov in zaradi strukture kromatina, oz. so raz- porejene posamično po celotnem kromati- nu  (51).  Slednja  razporeditev  je  značilna predvsem po delovanju ROS. Razlika med endogeno  in  eksogeno  poškodbo  je  pro- storska razporeditev. Pri endogeni poškod- bi gre za enakomerno razporeditev vzdolž vijačnice, pri obsevanju pa nastanejo zgoš- čene poškodbe, ki so za popravljanje zah- tevnejše (52). Abazična mesta, oksidativne poškodbe in SSB prepoznavajo in učinko- vito popravljajo številni DNA-popravljalni mehanizmi, kot npr. popravljanje z izrezo- vanjem baz (angl. base excision repair, BER) po kratki ali dolgi poti (53). Pri obeh poteh prepozna  poškodovano  bazo  ena  izmed DNA-glikozilaz in jo odcepi, da nastane aba- zično mesto. Nato pa delujejo DNA-(apu- rinsko/apirimidinsko mesto) endonukleaze 1 (APE1) oz. DNA-(apurinsko/apirimidinsko mesto) liaze (AP-liaze), da nastanejo SSB. SSB  se  popravijo  po  kratki  poti,  tako  da nastalo vrzel  zapolni DNA-polimeraza  β, DNA-ligaza III pa katalizira povezovanje (ligacijo) obeh koncev verig, pri tem ver- jetno  sodeluje  tudi  strukturna oz.  pove- zovalna  beljakovina  XRCC1  (angl. X-ray repair cross-complementing protein 1). Lahko se aktivira tudi dolga pot BER, pri čemer se odcepi več nukleotidov in pri tem sode- lujejo  še  dejavnik  procesivnosti  PCNA (angl.  proliferating cell nuclear antigen), DNA-polimeraza δ/ε, endonukleaza FEN1 (angl. flap structure-specific endonuclease 1) in DNA-ligaza I. Pri obeh poteh sodeluje tudi poli-ADP-riboza polimeraza 1 (PARP1), ki prepozna in se veže na SSB ter aktivira BER (53, 54). Večino oksidativnih poškodb, ki  jih  povzroči  obsevanje,  torej  popravi sistem BER. V hipoksičnem okolju,  ki  je pogosto značilno za tumorje, lahko nasta- jajo tudi ciklodeoksinukleozidi, ki jih popra- vi DNA-popravljalni mehanizem z izrezo- vanjem nukleotidov (angl. nucleotide excision repair, NER). Nepopravljene poškodbe, kot so  SSB  in  poškodovane  dušikove  baze, lahko ustavijo replikacijske vilice, kar pov- zroči  nastanek  DSB.  DSB  so  lahko  pre- prosti, pri katerih se prekineta vezi v obeh verigah  DNA,  lahko  pa  so  kompleksni, pri  čemer pride  ob  prekinitvah  tudi  do dodatnih poškodb, kot so abazična mesta ali oksidativne poškodbe dušikovih baz  (50). Ravno te poškodbe celični mehanizmi naj- teže pravilno popravijo in kopičenje takš- nih poškodb vodi v celično smrt. Ker različni odmerki obsevanja in razli- čne  vrednosti  LET  različno  vplivajo  na poškodbe DNA, potekajo številne raziska- ve, ki preučujejo, na kakšen način bi lahko spodbudili poškodbe DNA, kot so npr. DSB, ki povzročijo največ škode tumorskim celi- cam (16, 51). Zaznavanje dvojnih prelomov DNa V sesalskih celicah pri popravljanju DSB sodelujeta dva glavna mehanizma, popra- vljanje s homologno rekombinacijo (angl. homologous recombination, HR) in nehomo- logno spajanje koncev DNA (angl. non-homo- logous end joining, NHEJ). DSB prepoznajo med drugim serin/treoninske kinaze družine fosfatidilinozitol-3-kinaze-sorodnih  kinaz (angl. phosphatidylinositol 3‑kinase‑related kinases, PIKK), kot so npr. beljakovinski kom- pleksMRN (sestavljen iz MRE11, RAD50 in NBS1), ATM-kinaza (angl. ataxia-telangiec- tasia mutated kinase),  ATR-kinaza  (angl. ataxia telangiectasia and Rad3-related kina- se) in katalitična podenota od DNA odvisne kinaze (angl. DNA-dependent protein kinase, catalytic subunit,  DNA-PKcs)  (55–58).  To vodi do fosforilacije številnih drugih belja- kovin, ki sprožijo signalne poti, ki aktivirajo HR oz. NHEJ. Pomembno vlogo ima fosfo- rilacija histona H2AX, ki označi prisotnost DSB in vpokliče popravljalne beljakovine na mesto poškodbe, povzročene z obsevanjem (53). Serin/treoninska ATM- in ATR-kinaza poleg  tega  sodelujeta  pri  zaustavitvi  oz. 328 Sašo Mravljak, Petra Hudler, Blaž Grošelj Biološke osnove zdravljenja z ionizirajočim sevanjem mr23_3_Mr10_2.qxd 26.9.2023 9:26 Page 328 vzdrževanju stabilnosti replikacijskih vilic, če je bila poškodba zaznana med podvaja- njem DNA (59). Nehomologno popravljanje s spajanjem koncev DNa NHEJ  deluje  tako,  da  zlepi  poškodovana konca molekule DNA. Pri tem ni potrebna homologna matrična DNA, zato ta meha- nizem lahko uvede nove napake v DNA, ki potencialno vodijo v kromosomsko nesta- bilnost, saj zaradi načina popravljanja DSB brez  homologne  matrične  DNA  pogosto nastanejo majhne delecije (mikrodelecije), v nekaterih primerih pa lahko tudi kromo- somske translokacije (60, 61). Kljub temu je pri sesalcih pomemben mehanizem popra- vljanja DSB, ker lahko deluje v vseh fazah celičnega  cikla.  Prvi  korak  mehanizma NHEJ je vezava heterodimerne beljakovi- ne KU70/80 na  konca DSB,  kar  omogoči vezavo z DNA-PKcs (53). Ta kompleks sode- luje  pri  fosforilaciji  številnih  beljakovin (npr. H2AX, Artemis, DNA-ligaza IV, NHEJ1 oz. XLF (angl. non-homologous end joining factor 1 oz. angl. XRCC4-like factor)) in akti- vaciji  popravljanja  s  spajanjem  koncev DNA. Ena izmed polimeraz, ki sodelujejo pri NHEJ, je DNA‑polimeraza μ. Zaradi okvar- jenih genov v tumorskih celicah je klasična pot NHEJ pogosto okvarjena, zato se v tem primeru aktivirajo alternativne poti. Ena izmed njih je popravljanje DNA s spajanjem koncev na podlagi mikrohomologije (angl. microhomology mediated end joining, MMEJ oz.  angl. alternative end joining,  a-EJ),  pri kateri se na mestu preloma odcepi od 5 do 25 nukleotidov, medtem ko se pri NHEJ obi- čajno odcepijo le štirje nukleotidi. Za MMEJ niso potrebne beljakovine KU, pri popra- vljanju  pa  sodelujejo  druge  beljakovine, kot so PARP1, XRCC1, DNA-ligaza III, kom- pleks MRN in DNA-polimeraza θ (62). Dokazano je bilo, da ima NHEJ pomem- bno vlogo pri radiorezistenci, saj so nekatere beljakovine tega sistema pogosto čezmerno aktivirane. Hussain s sodelavci je pokazal, da imata NHEJ in MMEJ značilen mutacijski odtis, ki ga lahko zaznamo v celičnih linijah, kar bi lahko omogočilo izbor bolnikov, ki bi jih  pred  obsevanjem  zdravili  z  zaviralci NHEJ (63). Nekaj zaviralcev NHEJ, kot sta vortmanin,  ki  zavira  delovanje  od  DNA odvisnih  kinaz  (angl.  DNA-protein kinase, DNA-PK) in fosfatidilinozitol-3-kinaze (PI3K), ter NU7026, ki specifično zavira DNA-PK, so že  preizkušali  na  celičnih  linijah  (64–66). Ugotovili so, da je izpostavljanje celic tem zaviralcem okrepilo delovanje obsevanja in celicam povrnilo radiosenzitivnost. Popravljanje DNa s homologno rekombinacijo HR deluje le v fazah G2 in S celičnega cikla, saj se pri popravljanju uporabi homologna sestrska kromatida kot matrična DNA (53). Ta način popravljanja je zato zelo natančen. Za njeno pravilno delovanje sta poleg osta- lih beljakovin nujno potrebni beljakovini BRCA1/2 (angl. breast cancer 1/2). DSB pre- poznajo  in  vežejo  beljakovine  kompleksa MRN, ATM- in ATR-kinaza, eksonukleaza 1 (EXO1) ali nukleaza DNA2, helikaza BLM (angl. bloom syndrome protein),  BRCA1  in CTIP (angl. carboxy-terminal binding protein), ki cepijo DNA in sodelujejo pri nastanku enoverižnih  3’  koncev  DNA  (53,  67).  Te konce  prekrijejo  beljakovine  RPA  (angl. replication protein A), da jih zaščitijo, nato pa jih izpodrivajo in se na njihovo mesto vežejo  beljakovine  RAD51,  medtem  ko BRCA2, PALB2 (angl. partner and locali- zer of BRCA2),  RAD54  in  BARD1  (angl. BRCA1-associated RING domain protein 1) omogočijo  invazijo  nukleoproteinskega filamenta v homologno sestrsko kromati- do, da nastane D-zanka (53). DNA-polime- raze dodajajo nukleotide v vrzeli, pri čemer delujeta  verigi  sestrske  kromatide  kot matrična  DNA,  novo  nastala  konca  nato zlepi DNA‑ligaza. Pri tem nastanejo Holli - dayeve zanke, ki jih stabilizirajo in razkle- nejo  različne endonukleaze  (GEN1  (angl. flap endonuclease GEN homolog 1),  SLX4 329Med Razgl. 2023; 62 (3): mr23_3_Mr10_2.qxd 26.9.2023 9:26 Page 329 (angl. structure-specific endonuclease subunit SLX4),  beljakovinski  kompleks  MUS81- -EME1 (angl. crossover junction endonuclease MUS81-essential meiotic structure-specific endonuclease 1) …) (68). 330 Sašo Mravljak, Petra Hudler, Blaž Grošelj Biološke osnove zdravljenja z ionizirajočim sevanjem Nekatere genetske različice v genih za dovzetnost raka dojk 1/2 (angl. breast can- cer 1, BRCA1/2) in genu ATM (angl. ataxia telangiectasia mutated) so povezane s pove- čanim tveganjem za nastanek raka dojk, Enoverižni prelomi Poškodbe dušikovih bas Obsežnejše lezije Navzkrižne povezave Dvoverižni prelomi Popravljanje DNA s homologno rekombinacijo Popravljanje DNA z izrezovanjem baz (BER) Popravljanje DNA z izrezovanjem nukleotidov (BER) ATM MRN OGG1, APE1 PARP1 Kratka pot Dolga pot XPG, XPA, TFIIH ERCC1/XPF DDB1/2/XPE XPC GG–NER GG–NER – globalna genomska pot NER TC–NER – s prepisovanjem povezana pot NER TC–NER PARP2 RPA BRCA2/FANCD DNA–PK KU70/80 (NHEJ) RAD51, FANCF Artemis MRN, PARP1, XRCC1 (MMEJ) XRCC4–XLF biološki označevalci DNA–ligaza lDNA–ligaza lII DNA–ligaza l DNA–ligaza l DNA–ligaza lV (NHEJ) DNA–ligaza III (MMEJ) Pol (NHEJ) Pol µ θ (MMEJ) Pol Pol δ ε Pol β XRCC1 Pol δ ε/ PCNA FEN1 RNA pol CSA, CSB β PCNA Pol δ/ε/κ Popravljanje DNA z nehomolognim spajanjem koncev Slika 4. Shematski prikaz DNA-popravljalnih mehanizmov. Ustvarjeno s spletnim orodjem BioRender.com. BER – popravljanje DNA z izrezovanjem baz (angl. base excision repair), OGG1 – 8-oksogvanin DNA-gliko- zilaza 1, APE1 – DNA-(apurinsko/apirimidinsko mesto) endonukleaza 1, PARP1/2 – poli-ADP-riboza poli- meraza 1/2, Pol – DNA-polimeraza, XRCC1 (angl. X-ray repair cross-complementing protein 1), PCNA (angl. proliferating cell nuclear antigen), FEN1 (angl. flap structure-specific endonuclease 1), NER – popravljanje DNA z izrezovanjem nukleotidov (angl. nucleotide excision repair), DDP1/2 (angl. DNA damage-binding pro- tein 1/2), XPE (angl. xeroderma pigmentosum complementation group E protein), XPC (angl. xeroderma pigmentosum complementation group C protein), CSA (angl. Cockayne syndrome group A), CSB (angl. Cockayne syndrome group B), XPG (angl. xeroderma pigmentosum complementation group G protein), XPA (angl. xero- derma pigmentosum complementation group A protein), TFIIH – prepisovalni dejavnik II H (angl. trans- cription factor II H), ERCC1 (angl. excision repair cross-complementation group 1), XPF (angl. xeroderma pigmentosum complementation group F protein), ATM – ATM-kinaza (angl. ataxia-telangiectasia muta- ted kinase), MRN – beljakovniski kompleks MRN (sestavljen iz beljakovin MRE11, RAD50 in NBS1), BRCA2 (angl. breast cancer 2), FANCD (angl. Fanconi anemia group D protein), NHEJ – nehomologno spajanje kon- cev (angl. non-homologous end joining), DNA-PK – od DNA odvisna kinaza (angl. DNA-dependent protein kinase), MMEJ – spajanje koncev na podlagi mikrohomologije (angl. microhomology-mediated end joining), XRCC4-XFL (angl. X-ray repair cross-complementing protein 4-XRCC4-like factor). mr23_3_Mr10_2.qxd 26.9.2023 9:26 Page 330 jajčnikov, črevesa, prostate, in ker so te belja- kovine  pomembne  pri  popravljanju  DSB s HR, bi lahko bile tumorske celice občut- ljivejše  za  obsevanje  (69).  Raziskave  so pokazale nasprotujoče si rezultate, saj so v eni raziskavi odkrili, da bi lahko obseva- nje žensk, mlajših od 30 let, ki so nosilke mutacij v genih BRCA1/2, sprožilo razvoj sekundarnih rakov (70). Kasnejše raziskave na večjih kohortah bolnic so  to hipotezo sicer ovrgle (71, 72). Nasprotujoče rezulta- te so pokazale tudi raziskave obsevanja bol- nic z  rakom dojk  in nosilkami genetskih sprememb v genu ATM, saj so v nekaterih študijah odkrili, da so tumorji bolj radio- rezistentni,  medtem  ko  so  bili  v  drugih občutljivi in povezani z manj ponovitvami bolezni po obsevanju v primerjavi z bolni- cami, ki so prejele le kemoterapijo (69). PET R-JEv RaDIOBIOLOGIJE Leta 1975 je Withers objavil članek z naslo- vom »Štirje R-ji radioterapije« (angl. »The 4 R’s of Radiotherapy«). V članku so bili prvič zajeti najpomembnejši dejavniki, ki določa- jo  odziv  biološkega  tkiva  na  večkratne odmerke sevanja – in tako predstavljajo bio- loško osnovo za radioterapijo raka in omo- gočajo razumevanje za učinkovitost oz. neu- činkovitost pri zdravljenju raka z obsevanjem. Pojem štirih R-jev zajema popravljanje (angl. repair), reoksigenacijo (angl. reoxygenation), prerazporeditev (angl. redistribution) in rege- neracijo (angl. regeneration). Pojav regene- racije se je kasneje preimenoval v repopu- lacijo (angl. repopulation) (73, 74). Leta 1989 so Steel in sodelavci predlagali, da se doda še peti R –  radiosenzitivnost  (angl.  radio- sensitivity)  (74).  Posledično  se  v  sodobni literaturi  opisuje  pet  R-jev  radioterapije: popravilo subletalnih poškodb, reoksigena- cija, prerazporeditev celičnega cikla, repo- pulacija in radiosenzitivnost različnih celi- čnih tipov. Nekateri avtorji predlagajo še šesti R, ki se nanaša na reaktivacijo protitumor- skega imunskega odziva (angl. reactivation of the immune system) (74–77). Popravljanje subletalnih poškodb Uničenje celic zaradi ionizirajočega sevanja temelji na nastanku nepopravljivih lezij oz. prelomov DNA. Večina poškodb DNA je sicer subletalnih in jih tumorske celice, ko je obse- vanje  v  začetnih  frakcijah  in  pri  nižjih odmerkih, lahko popravijo z zgoraj opisa- nimi mehanizmi. Ko se čez čas – med zdra- vljenjem z obsevanjem – odmerek viša in poškodbe DNA kopičijo, pa to  lahko vodi v celično smrt (78). Ionizacije, ki jih povzroča sevanje, so v obsevanem tkivu porazdelje- ne naključno,  zato  je uničenje  tumorskih celic  naključen  proces.  Ker  je  uničevanje celic sorazmerno, je razmerje med odmer- kom in preživetjem celic običajno prikaza- no  na  logaritemski  skali  preživetja  celic v odvisnosti od odmerka – t. i. krivulja pre- živetja celic (slika 5) (73). Za razliko od zdra- vih so tumorske celice običajno manj učin- kovite pri popravljanju subletalnih poškodb, ker  je  zanje  pogosto  značilno,  da  imajo okvarjene gene za beljakovine, ki sodeluje- jo  pri  DNA-popravljalnih  mehanizmih. Dokazano pa je, da se tumorske celice zelo razlikujejo po svoji intrinzični celični radio- rezistenci – tako so lahko nekateri tumorji tudi zelo učinkoviti pri DNA-popravljanju. Številne raziskave so pokazale, da k tumor- ski radiorezistenci  prispeva tudi tumorsko mikrookolje (78–81). Čeprav so dobro pozna- ni  blagodejni  učinki  obsevanja  na  celice tumorskega mikrookolja, kot so reaktivaci- ja  protitumorskega  imunskega  odziva  in drugi, pa ima obsevanje lahko tudi naspro- ten  učinek,  in  sicer  spodbudi  infiltracijo tumorjev z imunosupresivnimi imunskimi celicami, ali da spodbudi reprogramiranje s tumorji povezanih fibroblastov (angl. can- cer-associated fibroblasts, CAF),  da  izločajo signalne molekule, ki omogočajo in spod- bujajo  rast  tumorskih celic, omogočajo  in povečajo njihovo  invazivnost,  zagotavljajo presnovke  za  rast  in  prilagajajo  imunski odziv (81, 82). Tako bo izid radioterapevtskega zdravljenja rezultat, ki je odvisen od obsega 331Med Razgl. 2023; 62 (3): mr23_3_Mr10_2.qxd 26.9.2023 9:26 Page 331 poškodb ter učinkovitosti tumorskih celic in tumorskega mikrookolja, da popravijo poško- dovano DNA, zavirajo imunski odziv in pod- pirajo rast tumorskih celic (78). Reoksigenacija Kisik je nujno potreben za tvorbo prostih radikalov,  ki  jih  povzroči  sevanje.  Če  je oksigenacija tkiv slabša, je slabši tudi uči- nek  obsevanja.  Znano  je,  da  hipoksične celice kažejo 2- do 3-krat večjo radiorezi- stenco (78). Kisik povzroča radiosenzitiza- cijo celic, saj lahko fiksira poškodbo, ki bi jo drugače v hipoksičnih razmerah popra- vili znotrajcelični antioksidanti (hipoteza o fiksaciji kisika) (slika 6), hkrati pa vodi v povečano nastajanje in prisotnost ROS (83, 84).  Mikrookolje  tumorja  je  dinamično, s stalno spreminjajočimi se gradienti kisi- ka in vrednostmi pH. Nekateri tumorji vse- 332 Sašo Mravljak, Petra Hudler, Blaž Grošelj Biološke osnove zdravljenja z ionizirajočim sevanjem bujejo kronično ali akutno hipoksične pod- populacije,  ki  potrebujejo  višje  sevalne odmerke  za  njihovo  uničenje.  Prehodne epizode akutne hipoksije tumorja, ki izha- jajo iz prekinjenega dotoka krvi, se lahko hitro  ponovno  oksigenirajo,  medtem  ko lahko  kronična  hipoksija  zaradi  omejene difuzije  kisika  zahteva  daljše  obdobje  za reoksigenacijo (83). Pomen tumorske reok- sigenacije za radioterapijo je, da se s frak- cioniranim  obsevanjem  celic,  ki  so  bile odporne zaradi hipoksije med izpostavlje- nostjo prejšnjemu odmerku, do naslednje- ga odmerka lahko oksigenirajo (ker celice odmirajo in pride do prej hipoksične celi- ce več kisika) in tako postanejo bolj radio- senzibilne. Reoksigenacija  akutno hipok- sičnih celic med dnevnimi odmerki je zato izredno  pomemben  vidik  frakcionirane radioterapije (73, 78, 83, 85). 0,1 1 0,01 0 odmerek ce li č n o p re ž iv e tj e Slika 5. Teoretične krivulje preživetja. Krivulje odmerka in preživetja za celice sesalcev, izpostavljene rent- genskim žarkom ali žarkom gama, običajno kažejo na začetno položnost, čemur sledi strmejše področje. Naraščajoča učinkovitost odmerka (vidna kot večji naklon krivulje) pomeni, da se v celicah kopičijo suble- talne poškodbe, ki vodijo v njihovo smrt. Značilnost večine zdravih celic sesalcev je, da se lahko po nekaj urah po izpostavljenosti sevanju poškodbe popravijo in celice se na ponovno obsevanje odzivajo tako, kot da niso bile predhodno obsevane. To lahko opazujemo kot ponovno izravnanje krivulje preživetja nasled- njega odmerka sevanja (73). mr23_3_Mr10_2.qxd 26.9.2023 9:26 Page 332 Prerazporeditev celičnega cikla Občutljivost  rakastih  celic  se  spreminja skozi celični cikel. Celice so v mitozi (faza M) in fazi G2 najobčutljivejše, mirujoče celi- ce v fazi G1 manj, v pozni fazi S pa najmanj občutljive – tudi do 2,5-krat manj kot celi- ce v fazi G2 ali mitozi. Napredovanje celic iz faze G2, M, G1 v fazo S jim tako zagota- vlja večjo stopnjo zaščite pred sevanjem. Posledično so celice, ki preživijo odmerek obsevanja v asinhronih populacijah celic, v  odpornejših  fazah  celičnega  cikla.  Pri frakcionirani radioterapiji tumorjev s hitrim razmnoževanjem celic heterogenost v kine- tiki  celičnega  cikla  vodi  k  redistribuciji (sinhronizaciji celic v celičnem ciklu) (86). Ko je asinhrona populacija celic izposta- vljena sevanju, imajo celice v občutljivih fazah celičnega cikla bistveno večjo ver- jetnost smrti zaradi sevanja. Z naslednjo frakcijo, ki je čez 24 ur, tumorske celice, ki  se  hitreje  delijo  kot  zdrave  celice,  že vstopijo  v  občutljivejšo  fazo  celičnega cikla. To ponovno vodi v smrt tumorskih celic (73, 85). Repopulacija Repopulacija tumorskih celic je eden glav- nih vzrokov za omejeno učinkovitost kon- vencionalnih frakcioniranih oblik radiote- 333Med Razgl. 2023; 62 (3): rapije. Tako normalna tkiva kot tudi tumor- ji imajo lahko zmožnost regeneracije kot odziv na zmanjšanje populacije celic. Hitrost regeneracije se med tkivi razlikuje. Nekatera normalna tkiva v obdobju običajnih šest ted- nov trajanja radioterapije ne kažejo opazne delitvene dejavnosti, kar vodi v omejeno depopulacijo  in  omejeno  repopulacijo. Druga tkiva, ki se običajno stalno delijo, pa v obdobju terapije kažejo depopulacijo in kompenzacijsko repopulacijo. Če se rege- neracija začne zgodaj in je hitra, je uspeh radioterapije manjši (73, 78). Že desetletja se predpostavlja, da depo- pulacija določenih hierarhično normalnih tkiv,  kot  je  tanko  črevo,  z  ionizirajočim sevanjem sproži prehod matičnih celic iz asi- metričnega načina delitve celic, pri katerem nastaneta matična celica in celica, usmerjena v diferenciacijo, v simetrični način delitve celic, ki vodi v nastanek dveh proliferativ- nih hčerinskih matičnih celic. Izguba celic iz proliferativnega predelka normalnih tkiv se zdi znižana, dokler ni regeneracija kon- čana. Podoben mehanizem je bil predlagan tudi za tumorje in vodi v pospešeno repo- pulacijo,  pri  čemer  hitrost  repopulacije tumorja  po  zdravljenju  s  subletalnimi odmerki sevanja preseže  rast nezdravlje- nega tumorja (78). prosti radikali na DNA DNA je kemijsko popravljena prosti radikali ionizirajoče sevanje H O2 an ok sij a oksija H O2 nepopravljive in na popravilo odporne lezije DNA so fiksirane z nastajanjem DNA–O •2 Slika 6. Shematski prikaz hipoteze o fiksaciji kisika. Ko so celice obsevane, nastanejo reaktivne kisikove zvrsti. Ti zelo reaktivni prosti radikali medsebojno delujejo z DNA, kar vodi v nastanek prostih radikalov na DNA. V odsotnosti O2 je te visoko nestabilne radikale DNA mogoče kemično obnoviti z oksidacijo sulfhidrilnih spojin (R-SH) ali z drugimi reducirajočimi molekulami. V oksičnih pogojih O2 medsebojno deluje z radikali DNA in jih kemično pretvori v nepopravljive oksidirane derivate, kot da so te lezije DNA »fiksirane« (83). mr23_3_Mr10_2.qxd 26.9.2023 9:26 Page 333 Radiosenzitivnost različnih celičnih tipov Celice različnih vrst tumorjev se bistveno razlikujejo v svoji prirojeni radiosenzitiv- nosti, tj. v strmini krivulje preživetja celic. Celice, izolirane iz klinično manj agresiv- nih  tumorjev,  so  imele  pomembno  bolj strmo začetno krivuljo kot celice iz agre- sivnejših tumorjev. Raziskave so potrdile, da  bi  lahko  različne  krivulje  preživetja pojasnile  klinično  opažene  odzive  razli- čnih tumorjev na zdravljenje. Dodatno je mogoče opaziti, da so razlike v strminah kri- vulj pri nižjih odmerkih znatnejše (74, 87). Izraz radiosenzitivnost lahko torej ima več pomenov.  Najbolj  neposreden  pomen  je strmina  krivulje  akutnega  preživetja  po obsevanju,  klinično  bistven  pomen  ima krivulja  preživetja  pri  nizkih  odmerkih sevanja, tretji pomen pa bi lahko bil občut- ljivost na začetno vzbuditev poškodb (74). Celice lahko postanejo radiorezistentne, saj ionizirajoče sevanje vodi tudi v prila- goditvene  celične  spremembe  v  rakavih celicah.  To  lahko  vodi  v  odpornost  proti zdravljenju, saj se lahko aktivirajo signal- ne poti, ki rakavim celicam zagotavljajo pro- liferativno prednost. Tumorji lahko posta- nejo  radiorezistentni  zaradi  od  liganda neodvisne  aktivacije  signalnih  poti,  npr. tistih, ki so uravnane z membransko veza- nimi receptorskimi tirozin kinazami (RTK). Pogosto so spremenjene tudi poti, v kate- rih so vključeni receptorji za epidermalni rastni dejavnik (angl. epidermal growth fac- tor receptor, EGFR), PI3K, protein kinaza B (PKB oz. Akt-kinaza), mTOR-kinaza (angl. mammalian/mechanistic target of rapamycin kinase), STAT (angl. signal transducer and activator of transcription) in z mitogenom aktivirana  proteinska  kinaza  (angl. mito- gen-activated protein kinase, MAPK). Te poti so povezane z najpomembnejšimi značil- nostmi  (angl.  hallmarks)  raka,  vključno s celičnim ciklom, preživetjem, presnovo, invazijo, angiogenezo in genomsko nesta- bilnostjo (1). KLINIČNI vIDIK RaDIOTERaPIJE Radioterapijo se uporablja v približno polo- vici primerov na kateri koli točki zdravlje- nja rakavih obolenj. Gre za lokalno zdrav- ljenje,  ki  deluje  na  točno  določen predel telesa.  Obsevanje  na  ostale  dele  telesa praktično nima učinka (razen v redkih pri- merih, ko pride do daljnotarčnega učinka, glej zgoraj). Glede na lokacijo vira sevanja delimo radioterapijo na teleradioterapijo oz. zunanje obsevanje – ko je vir ionizirajoče- ga sevanja  izven bolnika, kar predstavlja večino radioterapevtskega zdravljenja; ter brahiterapijo, kjer vir sevanja (izotop) dosta- vimo neposredno v ali ob rakasto tkivo in lahko tako do določenega tkiva dostavimo zelo visoke odmerke, ne da bi prekomerno prizadeli  okolno  zdravo  tkivo.  Glede  na namen ločimo več vrst obsevanja: radikal- no, kjer je cilj ozdravitev; pooperativno, ki je namenjeno zmanjšanju verjetnosti pono- vitve bolezni; ter paliativno obsevanje, ki je  usmerjeno  v  lajšanje  oz.  zaustavitev simptomov in znakov. Najpogosteje se upo- rablja frakcija odmerka 2 Gy enkrat dnevno. Vsak rak ima svojo zahtevano raven odmer- ka, ki jo je treba doseči z radioterapijo, da se tumor uniči. Pri radikalnem zdravljenju je ta raven odmerka običajno med 60 in 76 Gy, medtem ko je pri pooperativnem obse- vanju dovolj 60 Gy. Pri paliativnem obse- vanju so dnevni odmerki običajno višji in celokupno prejet odmerek nižji. ZaKLJUČKI V  članku  so  bile  predstavljene  različne plati bioloških zakonitosti, ki sodelujejo pri povzročitvi  in  popravilu  znotrajceličnih poškodb po radioterapevtskem zdravljenju z  ionizirajočim sevanjem. Uporabi  se pri visokem odstotku bolnikov, ki so zboleli za rakom. Biološke osnove so čedalje bolje razi- skane,  kar  je  pomembno  za  prepoznavo morebitnih  terapevtskih  tarč.  Radiotera- pevtsko  zdravljenje  se  pogosto  združuje z zdravili, ki šibijo popravljalne mehaniz- me v ciljanih celicah. 334 Sašo Mravljak, Petra Hudler, Blaž Grošelj Biološke osnove zdravljenja z ionizirajočim sevanjem mr23_3_Mr10_2.qxd 26.9.2023 9:26 Page 334 LITERaTURa 1. Baskar R, Dai J, Wenlong N, et al. Biological response of cancer cells to radiation treatment. Front Mol Biosci. 2014; 1: 24. 2. Zupanič Slavec Z. Zgodovina zdravstva in medicine na slovenskem, infektologija, nevrologija, onkologija, dermatovenerologija, zobozdravstvo, strokovnodicine in the slovene lands, infectiology, neurology, oncology, dermatovenereology, dentistry, professional health sciences, preužba; Društvo Mohorjeva družba; 2022. 3. Zakariya NI, Kahn M. Benefits and biological effects of ionizing radiation. Scholars academic journal of biosciences. 2014; 2 (9): 583–91. 4. Termania: Slovenski medicinski slovar [internet]. Univerza v Ljubljani, Medicinska fakulteta, c2012–2023. Dosegljivo na: https://www.termania.net/slovarji/95/slovenski-medicinski-slovar 5. ISO I. 21348: 2007—space environment (natural and artificial)—process for determining solar irradiances. International Organization for Standardization: Geneva, Switzerland. 2007: 12. 6. Ball DW. The electromagnetic spectrum: A history. Spectroscopy. 2007; 22 (3): 14. 7. Reisz JA, Bansal N, Qian J, et al. Effects of ionizing radiation on biological molecules–mechanisms of damage and emerging methods of detection. Antioxid Redox Signal. 2014; 21 (2): 260–92. 8. Dunne-Daly CF, ed. Principles of radiotherapy and radiobiology. Seminars in oncology nursing; 1999: Elsevier. 9. Sgouros G. Alpha particles for targeted therapy. Advanced drug delivery reviews. 2008; 60 (12): 1402–6. 10. Fendler WP, Cutler C. More α than β for prostate cancer? Journal of Nuclear Medicine. 2017; 58 (11): 1709–10. 11. Hashempour M, Ghorbani M, Amato E, et al. Effect of beta particles spectrum on absorbed fraction in internal radiotherapy. Asia Oceania Journal of Nuclear Medicine and Biology. 2019; 7 (1): 71. 12. Allen JY, Dainiak N, Wingard JR, et al. Clinical manifestations, evaluation, and diagnosis of acute radiation exposure [internet]. Danzl DF, Chao NJ Editörler Up To Date; c2023–2023 [citirano 2023 Jul 11]. Dosegljivo na: https://www.uptodate.com/contents/clinical-manifestations-evaluation-and-diagnosis-of-acute-radia- tion-exposure 13. Choudhary S. Deterministic and stochastic effects of radiation. Cancer Therapy & Oncology International Journal. 2018; 12 (2): 31–2. 14. Zhang M, Qureshi AA, Geller AC, et al. Use of tanning beds and incidence of skin cancer. Journal of Clinical Oncology. 2012; 30 (14): 1588. 15. Karagas MR, Stannard VA, Mott LA, et al. Use of tanning devices and risk of basal cell and squamous cell skin cancers. Journal of the National Cancer Institute. 2002; 94 (3): 224–6. 16. Kim W, Lee S, Seo D, et al. Cellular stress responses in radiotherapy. Cells. 2019; 8 (9): 1105. 17. Michalowski A. Effects of radiation on normal tissues: Hypothetical mechanisms and limitations of in situ assays of clonogenicity. Radiation and environmental biophysics. 1981; 19 (3): 157–72. 18. Wheldon T, Michalowski A, Kirk J. The effect of irradiation on function in self-renewing normal tissues with differing proliferative organisation. The British journal of radiology. 1982; 55 (658): 759–66. 19. Obrador E, Salvador R, Villaescusa JI, et al. Radioprotection and radiomitigation: From the bench to clinical practice. Biomedicines. 2020; 8 (11): 461. 20. Barcellos-Hoff MH, Park C, Wright EG. Radiation and the microenvironment–tumorigenesis and therapy. Nature Reviews Cancer. 2005; 5 (11): 867–75. 21. Desouky O, Ding N, Zhou G. Targeted and non-targeted effects of ionizing radiation. Journal of Radiation Research and Applied Sciences. 2015; 8 (2): 247–54. 22. Lieberman M, Marks AD, Peet A. Marks’ basic medical biochemistry: A clinical approach. 4th ed. Philadelphia [etc.]: Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins; 2013. 23. Nagasawa H, Little JB. Induction of sister chromatid exchanges by extremely low doses of α-particles. Cancer research. 1992; 52 (22): 6394–6. 24. Marín A, Martín M, Liñán O, et al. Bystander effects and radiotherapy. reports of Practical Oncology and radiotherapy. 2015; 20 (1): 12–21. 25. Le M, Fernandez-Palomo C, McNeill FE, et al. Exosomes are released by bystander cells exposed to radia- tion-induced biophoton signals: Reconciling the mechanisms mediating the bystander effect. PloS one. 2017; 12 (3): e0173685. 26. Smolarz M, Skoczylas Ł, Gawin M, et al. Radiation-induced bystander effect mediated by exosomes involves the replication stress in recipient cells. International Journal of Molecular Sciences. 2022; 23 (8): 4169. 335Med Razgl. 2023; 62 (3): mr23_3_Mr10_2.qxd 26.9.2023 9:26 Page 335 27. Kumar Jella K, Rani S, O’driscoll L, et al. Exosomes are involved in mediating radiation induced bystander signaling in human keratinocyte cells. Radiation research. 2014; 181 (2): 138–45. 28. Al-Mayah AH, Irons SL, Pink RC, et al. Possible role of exosomes containing rna in mediating nontargeted effect of ionizing radiation. Radiation research. 2012; 177 (5): 539–45. 29. Mutschelknaus L, Peters C, Winkler K, et al. Exosomes derived from squamous head and neck cancer promote cell survival after ionizing radiation. PloS one. 2016; 11 (3): e0152213. 30. Craig DJ, Nanavaty NS, Devanaboyina M, et al. The abscopal effect of radiation therapy. Future Oncology. 2021; 17 (13): 1683–94. 31. Mole R. Whole body irradiation—radiobiology or medicine? The British journal of radiology. 1953; 26 (305): 234–41. 32. Nabrinsky E, Macklis J, Bitran J. A review of the abscopal effect in the era of immunotherapy. Cureus. 2022; 14 (9). 33. Ngwa W, Irabor OC, Schoenfeld JD, et al. Using immunotherapy to boost the abscopal effect. Nature Reviews Cancer. 2018; 18 (5): 313–22. 34. Khalil DN, Budhu S, Gasmi B, et al. The new era of cancer immunotherapy: Manipulating t-cell activity to overcome malignancy. Advances in cancer research. 2015; 128: 1–68. 35. Seiwert TY, Kiess AP. Time to debunk an urban myth? The »abscopal effect« with radiation and anti–pd-1. Journal. 2021; 39 (Issue): 1–3. 36. McBride S, Sherman E, Tsai CJ, et al. Randomized phase ii trial of nivolumab with stereotactic body radiotherapy versus nivolumab alone in metastatic head and neck squamous cell carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 2021; 39 (1): 30. 37. Smith H MA, Bell D, et al. Acute radiation syndrome. Journal. 2018; (Issue). 38. Donnelly EH, Nemhauser JB, Smith JM, et al. Acute radiation syndrome: Assessment and management. Southern medical journal. 2010; 103 (6): 541. 39. Jones J CR, Murphy A, et al. Stochastic effects [internet]. Radiopaedia.org, c2008–2023 [citirano 2023 Jul 9]. Dosegljivo na: https://radiopaedia.org/articles/5099 40. Seong KM, Seo S, Lee D, et al. Is the linear no-threshold dose-response paradigm still necessary for the asses- sment of health effects of low dose radiation? Journal of Korean medical science. 2016; 31 (Suppl 1): S10–S23. 41. Calabrese EJ, O’Connor MK. Estimating risk of low radiation doses - a critical review of the beir vii report and its use of the linear no-threshold (lnt) hypothesis. Radiat Res. 2014; 182 (5): 463–74. 42. Lall R, Ganapathy S, Yang M, et al. Low-dose radiation exposure induces a hif-1-mediated adaptive and protective metabolic response. Cell Death & Differentiation. 2014; 21 (5): 836–44. 43. Sancar A, Lindsey-Boltz LA, Unsal-Kaçmaz K, et al. Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints. Annu Rev Biochem. 2004; 73: 39–85. 44. Luckey T. Abundant health from radioactive waste. International Journal of Low Radiation. 2008; 5 (1): 71–82. 45. Vaiserman AM. Radiation hormesis: Historical perspective and implications for low-dose cancer risk assessment. Dose Response. 2010; 8 (2): 172–91. 46. Cohen BL. Test of the linear-no threshold theory of radiation carcinogenesis for inhaled radon decay products. Health Physics. 1995; 68 (2): 157–74. 47. Luckey T, ed. Radiation hormesis: Biopositive effect of radiations. Signals and Images: Selected Papers from the 7th and 8th GIRI Meeting, held in Montpellier, France, November 20–21, 1993, and Jerusalem, Israel, December 10–11, 1994; 1993: Springer. 48. Puskin J. Smoking as a confounder in ecologic correlations of cancer mortality rates with average county radon levels. Health Physics. 2003; 84 (4): 526–32. 49. Li L-Y, Guan Y-d, Chen X-S, et al. DNA repair pathways in cancer therapy and resistance. Frontiers in pharmacology. 2021; 11: 629266. 50. Huang R, Zhou P-K. DNA damage repair: Historical perspectives, mechanistic pathways and clinical translation for targeted cancer therapy. Signal Transduction and Targeted Therapy. 2021; 6 (1): 254. 51. Lomax M, Folkes L, O’neill P. Biological consequences of radiation-induced DNA damage: Relevance to radiotherapy. Clinical oncology. 2013; 25 (10): 578–85. 52. O’Neill LMFL. P. Biological consequences of radiation-induced DNA damage: Relevance to radiotherapy. Clin Oncol (R Coll Radiol). 2013; 25 (10): 578–85. 53. Biau J, Chautard E, Verrelle P, et al. Altering DNA repair to improve radiation therapy: Specific and multiple pathway targeting. Frontiers in Oncology. 2019; 9: 1009. 336 Sašo Mravljak, Petra Hudler, Blaž Grošelj Biološke osnove zdravljenja z ionizirajočim sevanjem mr23_3_Mr10_2.qxd 26.9.2023 9:26 Page 336 54. Schiewer MJ, Mandigo AC, Gordon N, et al. Parp-1 regulates DNA repair factor availability. EMBO molecular medicine. 2018; 10 (12): e8816. 55. Angira D, Shaik A, Thiruvenkatam V. Structural and strategic landscape of pikk protein family and their inhibitors: An overview. Frontiers in Bioscience-Landmark. 2020; 25 (8): 1538–67. 56. Cortez D, Glick G, Elledge SJ. Minichromosome maintenance proteins are direct targets of the atm and atr checkpoint kinases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2004; 101 (27): 10078–83. 57. Shibata A, Jeggo PA. Atm’s role in the repair of DNA double-strand breaks. Genes. 2021; 12 (9): 1370. 58. Van Der Burg M, IJspeert H, Verkaik NS, et al. A DNA-pkcs mutation in a radiosensitive t–b–scid patient inhibits artemis activation and nonhomologous end-joining. The Journal of clinical investigation. 2009; 119 (1): 91–8. 59. Couch FB, Bansbach CE, Driscoll R, et al. Atr phosphorylates smarcal1 to prevent replication fork collapse. Genes & development. 2013; 27 (14): 1610–23. 60. Bozzella M, Seluanov A, Gorbunova V. DNA repair by nonhomologous end joining and homologous recombination during cell cycle in human cells au-mao, zhiyong. Cell Cycle. 2008; 7: 2902–6. 61. Jan H. Hj genome maintence mechanisms for preventig cancer. Nature. 2001; 411 (6835): 366–74. 62. Haince J-F, McDonald D, Rodrigue A, et al. Parp1-dependent kinetics of recruitment of mre11 and nbs1 proteins to multiple DNA damage sites. Journal of Biological Chemistry. 2008; 283 (2): 1197–208. 63. Hussain SS, Majumdar R, Moore GM, et al. Measuring nonhomologous end-joining, homologous recombination and alternative end-joining simultaneously at an endogenous locus in any transfectable human cell. Nucleic Acids Research. 2021; 49 (13): e74–e. 64. Kostyushev D, Kostyusheva A, Brezgin S, et al. Suppressing the nhej pathway by DNA-pkcs inhibitor nu7026 prevents degradation of hbv cccdna cleaved by crispr/cas9. Scientific reports. 2019; 9 (1): 1847. 65. Manjunath M, Choudhary B, Raghavan SC. Scr7, a  potent cancer therapeutic agent and a  biochemical inhibitor of nonhomologous DNA end-joining. Cancer Reports. 2021; 4 (3): e1341. 66. Niazi M, Mok G, Heravi M, et al. Effects of dna-line n87. Current Oncology. 2014; 21 (2): 91–6. 67. Toh M, Ngeow J. Homologous recombination deficiency: Cancer predispositions and treatment implications. The oncologist. 2021; 26 (9): e1526–e37. 68. Lilley DM. Holliday junction-resolving enzymes—structures and mechanisms. FEBS letters. 2017; 591 (8): 1073–82. 69. Lazzari G, Buono G, Zannino B, et al. Breast cancer adjuvant radiotherapy in brca1/2, tp53, atm genes mutations: Are there solved issues? Breast Cancer: Targets and Therapy. 2021: 299–310. 70. Pijpe A, Andrieu N, Easton DF, et al. Exposure to diagnostic radiation and risk of breast cancer among carriers of brca1/2 mutations: Retrospective cohort study (gene-rad-risk). Bmj. 2012; 345. 71. Chapman BV, Liu D, Shen Y, et al. Outcomes after breast radiation therapy in a diverse patient cohort with a germline brca1/2 mutation. International Journal of Radiation Oncology* Biology* Physics. 2022; 112 (2): 426–36. 72. Schlosser S, Rabinovitch R, Shatz Z, et al. Radiation-associated secondary malignancies in brca mutation carriers treated for breast cancer. International Journal of Radiation Oncology* Biology* Physics. 2020; 107 (2): 353–9. 73. Withers HR. The four r’s of radiotherapy. Advances in radiation biology. 5: Elsevier; 1975. p. 241–71. 74. Steel GG, McMillan TJ, Peacock J. The 5rs of radiobiology. International journal of radiation biology. 1989; 56 (6): 1045–8. 75. Montero A, Alvarez B. The 5rs dilemma of radiotherapy for non-malignant diseases: 5rs to darken or 5rs to shine. reports of Practical Oncology and radiotherapy. 2023; 28 (1): 74–8. 76. Boustani J, Grapin M, Laurent PA, et al. The 6th r of radiobiology: Reactivation of anti-tumor immune response. Cancers (Basel). 2019; 11 (6). 77. Marcu LGu. Contemporary issues in head and neck cancer management. InTech; 2015. Dosegljivo na: http://dx.doi.org/10.5772/58653 78. Pajonk F, Vlashi E, McBride WH. Radiation resistance of cancer stem cells: The 4 r’s of radiobiology revisited. Stem cells. 2010; 28 (4): 639–48. 79. Chargari C, Clemenson C, Martins I, et al. Understanding the functions of tumor stroma in resistance to ionizing radiation: Emerging targets for pharmacological modulation. Drug Resistance Updates. 2013; 16 (1-2): 10–21. 80. Kamochi N, Nakashima M, Aoki S, et al. Irradiated fibroblast-induced bystander effects on invasive growth of squamous cell carcinoma under cancer–stromal cell interaction. Cancer science. 2008; 99 (12): 2417–27. 81. Krisnawan VE, Stanley JA, Schwarz JK, et al. Tumor microenvironment as a regulator of radiation therapy: New insights into stromal-mediated radioresistance. Cancers. 2020; 12 (10): 2916. 337Med Razgl. 2023; 62 (3): mr23_3_Mr10_2.qxd 26.9.2023 9:26 Page 337 82. Weichselbaum RR, Liang H, Deng L, et al. Radiotherapy and immunotherapy: A beneficial liaison? Nature reviews Clinical oncology. 2017; 14 (6): 365–79. 83. Liu C, Lin Q, Yun Z. Cellular and molecular mechanisms underlying oxygen-dependent radiosensitivity. Radiation research. 2015; 183 (5): 487–96. 84. Grimes DR, Partridge M. A mechanistic investigation of the oxygen fixation hypothesis and oxygen enhancement ratio. Biomedical physics & engineering express. 2015; 1 (4): 045209. 85. Herskind C, Ma L, Liu Q, et al. Biology of high single doses of iort: Rbe, 5 r’s, and other biological aspects. Radiation Oncology. 2017; 12: 1–14. 86. Lonati L, Barbieri S, Guardamagna I, et al. Radiation induced cell cycle perturbations: A computational tool validated with flow cytometry data. Scientific reports. 2021; 11 (1): 925. 87. Todorović V, Prevc A, Nikšić Žakelj M, et al. Induction of radioresistance and cisplatin resistance in hnscc cell line after ionizing radiation. Journal of cancer metastasis and treatment. 2016; 2 (1): 18–9. Prispelo 19. 7. 2023 338 Sašo Mravljak, Petra Hudler, Blaž Grošelj Biološke osnove zdravljenja z ionizirajočim sevanjem mr23_3_Mr10_2.qxd 26.9.2023 9:26 Page 338