I-93
Strokovni prispevek/Professional article
UGOTAVLJANJE IN SPREMLJANJE KLONA PNH
Z DOLOČANJEM CD55 IN CD59
NA NEVTROFILCIH
DETECTION AND FOLLOW UP OF PNH CLONE BY MEASURING CD55 AND CD59
EXPRESSION ON NEUTROPHILS
Uroš Mlakar, Darja Žontar
Klinični oddelek za hematologijo, Klinični center, Zaloška 7, 1525 Ljubljana
Prispelo 2004-02-13, sprejeto 2004-03-05; ZDRAV VESTN 2004; 73: Suppl. I: 93–6
Ključne besede: paroksizmalna nočna hemoglobinurija;
aplastična anemija; pretočna citometrija
Izvleček – Izhodišča. Paroksizmalna nočna hemoglobinuri-
ja (PNH) je pridobljena klonska bolezen krvotvornih matič-
nih celic. Zanjo je značilna intravaskularna hemoliza, odpo-
ved kostnega mozga in nagnjenost k trombozam. Nastane
zaradi somatske mutacije gena PIG-A. Ta je odgovoren za
nastanek encima, ki sodeluje pri sintezi glikozilfosfatidilino-
zitola (GPI). Tako nastane klon krvnih celic, ki na površini
nima tistih beljakovin, katerih vezavo omogoča GPI. Vrsto let
se je za ugotavljanje PNH uporabljal Hamov preizkus, ki te-
melji na povečani dovzetnosti eritrocitov za litični učinek
komplementa po dodatku kisline. Danes ugotavljamo PNH s
pretočno citometrijo, kjer s protitelesi ugotavljamo pomanj-
kanje beljakovin, odvisnih od GPI. Prikazujemo naše izkuš-
nje z uporabo tribarvne citometrije za ugotavljanje in oceno
količine CD55/59 negativnih nevtrofilcev.
Bolniki in metode. Obravnavali smo devet bolnikov, ki
smo jim že ugotovili PNH ali aplastično anemijo (6 s PNH
in 3 z aplastično anemijo). Bolnikom smo v obdobju treh
let merili velikost klona PNH z določanjem deleža CD55/59
negativnih nevtrofilcev. Velikost klona smo določali s tribarv-
no pretočno citometrijo, pri tem smo za ugotavljanje nevtro-
filcev uporabili monoklonska protitelesa anti-DC15-PC5, za
ugotavljanje beljakovin, odvisnih od GPI, pa anti-CD59-FITC
in anti-CD55-PE.
Rezultati. Bolniki s hemolitično obliko PNH so imeli več kot
50% CD59/CD55 negativnih nevtrofilcev. Bolnik z največjim
klonom je imel najbolj aktivno bolezen s pogostimi hudimi
napadi hemolize. V triletnem obdobju smo pri dveh bolnikih
opazovali postopno večanje klona PNH. Pri dveh bolnikih z
remisijo PNH nismo ugotovili napake PNH. Trije bolniki z
aplastično anemijo (hipoplastična PNH) so imeli < 40% CD55/
59 negativnih nevtrofilcev. Pri enem bolniku je prišlo do po-
rasta klona PNH.
Zaključki. Tribarvna citometrija, pri kateri uporabljamo pro-
titelesa anti-CD15/55/59, je primerna preiskava za ugotav-
ljanje in oceno velikosti klona PNH. Ocena velikosti klona
PNH ima klinično in prognostično vrednost. Od velikosti klo-
na je odvisno tveganje za trombotične zaplete. Spremljanje
Key words: paroxysmal nocturnal haemoglobinuria;
aplastic anaemia; flow cytometry
Abstract – Background. Paroxysmal nocturnal haemoglobi-
nuria (PNH) is an acquired clonal haematopoietic stem cell
disorder characterised by intravascular haemolysis, bone
marrow failure and increased tendency to thrombosis. It is
caused by a somatic mutation in the PIG-A gene, which
encodes an enzyme essential for the synthesis of glycosyl-
phosphatidylinositol (GPI) anchors. The PIG-A mutation
results in a clone of blood cells with total or partial deficiency
of membrane proteins anchored to the cell surface through
GPI anchor. For many years, an increased susceptibility of
the PNH red cells to complement lysis in acidified serum
(Ham’s test) has been essential for diagnosis of the PNH.
Current flow cytometric assays for PNH rely on the use of
labeled antibodies to detect deficiencies of the specific GPI
anchor proteins on blood cells. We evaluated a three-colour
flow cytometry method for detection and quantification of
CD55/59 negative netrophils.
Patients and methods. Nine patients (6 with PNH and 3 with
aplastic anaemia) who were previously diagnosed as having
PNH or aplastic anaemia were evaluated. In the period of
three years the patients were serially evaluated for the extent
of PNH clone by quantification of CD55/59 negative neutro-
phils. Three-colour flow cytometry method was used for
quantification of the CD55/CD59 negative neutrophils. We
used directly conjugated monoclonal antibodies anti-DC15-
PC5 for identification of neutrophils and anti-CD59-FITC
and anti-CD55-PE for the GPI-linked antigens.
Results. Patients with haemolytic PNH had > 50% CD59/CD55
negative granulocytes. The proportion of the PNH granulo-
cytes was higher in the patient with frequent and serious
haemolytic attacks. Over the period of three years slow growth
of the PNH clone was seen in two cases. Two patients with
PNH diagnosed 19 years ago and in remission at the time of
flow cytometric analysis was devoid of the PNH clone. Three
patients with aplastic anaemia (hypoplastic PNH) had the
proportion of CD59/CD55 negative granulocytes < 40%. In
one of them PNH clone increased.
ZDRAV VESTN 2004; 73: I-93–6
I-94 ZDRAV VESTN 2004; 73: SUPPL I
velikosti klona omogoča pri nekaterih bolnikih napoved re-
misije, pri drugih pa napoved prehoda iz hipoplastične v he-
molitično obliko PNH.
Conclusions. Three colour flow cytometry of granulocytes
using combination of anti-CD15/55/59 provides the
accurate technique for detection and quantification of the
PNH clone. Monitoring the PNH clone size has clinical and
prognostic value. The size of the PNH clone is an important
determinant for thrombotic risk. Serial studies allow pre-
diction of remission in some cases or progress from hypo-
plastic to hemolytic PNH in others.
Uvod
Značilnosti paroksizmalne nočne hemoglobinurije (PNH) so in-
travaskularna hemoliza, nagnjenost k trombozam in različne
stopnje citopenije v krvni sliki. Bolezen je posledica pridoblje-
ne napake krvotvornih matičnih celic zaradi somatske mutacije
gena PIG-A na kromosomu X. Gen je odgovoren za nastanek ene
od štirih podenot encima (fosfatidilinozitol-acetilglukozaminil
transferaza), ki je potreben za prvo stopnjo sinteze glikozilfos-
fatidilinozitola (GPI). S pomočjo GPI so na celično membrano
krvnih celic pritrjene različne beljakovine, med drugimi tudi za-
viralca aktivacije komplementa – CD55 (zaviralec konvertaze
C3 in C5) in CD 59 (zaviralec zadnje stopnje aktivacije komple-
menta) (1). Zaradi pomanjkanja teh beljakovin pride do pove-
čane dovzetnosti eritrocitov za litični učinek komplementa. Od
vrste mutacije je odvisno, ali gre za popolno ali delno inaktivaci-
jo beljakovine, ki jo proizvaja PIG-A. Na ta način si razložimo na-
stanek eritrocitov z večjo (PNH3) ali manjšo (PNH2) dovzetnostjo
za litični učinek komplementa. Ker mutacija prizadene krvot-
vorno matično celico, nastane klon krvnih celic, ki na površini
nima ali ima manj beljakovin, odvisnih od GPI. V krvi bolnikov s
PNH tako ugotovimo poleg normalnih tudi klon prizadetih celic
(eritrocitov, trombocitov, granulocitov, monocitov in limfocitov).
Pri nekaterih bolnikih sta prisotna dva klona eritrocitov (PNH2
in PNH3). Pogosto prisotnost večje ali manjše odpovedi kostne-
ga mozga in povezavo PNH z aplastično anemijo si razlagamo s
prisotnostjo dodatnega dejavnika, ki deluje bolj zavirajoče na
normalne matične celice kot na klon PNH, s tem pa omogoči nje-
gov razrast (2, 3).
Do uvedbe pretočne citometrije se je PNH ugotavljala z dve-
ma preizkusoma. Sukrozno hemolitični preizkus se je uporab-
ljal kot presejalni preizkus, Hamov preizkus pa za potrditev
PNH. Zaradi večje občutljivosti in specifičnosti se danes name-
sto omenjenih preizkusov uporablja pretočna citometrija, s
katero ugotavljamo odsotnost beljakovin, odvisnih od GPI na
površini celic.
Prikazujemo naše izkušnje s tribarvno pretočno citometrijo
pri ugotavljanju celic (klona) PNH pri bolnikih s PNH in pri
bolnikih z aplastično anemijo.
Bolniki in metode dela
Bolniki
Bolnikom s PNH in aplastično anemijo smo v obdobju treh let
nekajkrat določili delež nevtrofilcev z napako PNH. V raziskavo
smo vključili devet bolnikov, šest s PNH in tri z aplastično anemi-
jo. Bolnikom s PNH smo bolezen ugotovili v obdobju od 1980. do
1999. leta. Pri dveh bolnikih bolezen v času naše preiskave ni
bila več prisotna. Hamov test je bil negativen in ni bilo več zna-
kov za intravaskularno hemolizo (remisija PNH). Pri bolnikih z
aplastčno anemijo so bolezen ugotovili v obdobju 1994 do
2002. Pri enem bolniku (bolnik 9) je bila aprila 2002 opravljena
alogenična transplantacija krvotvornih matičnih celic.
GPI-pomanjkljive nevtrofilce smo ugotavljali s tribarvno pre-
točno citometrijo. Nevtrofilce smo identificirali kot celice, ki
so CD15 pozitivne (od GPI neodvisna beljakovina na zrelih
nevtrofilcih) in pri katerih je prisotno močno bočno sipanje
svetlobe (light side scatter), kar je znak granulocitov. Na tako
izbrani populaciji celic smo izmerili delež tistih, ki niso imele
na površini CD55 in CD59 (beljakovini, odvisni od GPI) (Sl. 1).
Sl. 1. Način ugotavljanja nevtrofilcev (A) in ocena na GPI
vezanih antigenov (B).
Figure 1. Gating strategy (A) and analysis of GPI-linked anti-
gen expression on neutrophils (B).
Za raziskavo smo uporabili vensko kri bolnika, ki ji je dodan
antikoagulans (heparin ali EDTA). Kri zdravega dajalca smo
uporabili za pozitivno kontrolo. Za pozitivno notranjo kontro-
lo lahko v večini primerov koristimo preostalo populacijo nor-
malnih nevtrofilcev. Predstavlja referenčno populacijo, s kate-
ro primerjamo klon PNH in reaktivnost monoklonskih protite-
les. V dve označeni epruveti smo odpipetirali 100 µl krvi, doda-
li 2 ml raztopine amonijevega klorida in pustili stati pripravek
10 minut na sobni temperaturi, da je prišlo do lize eritrocitov.
Po centrifugiranju in odstranitvi supernatanta smo levkocite
dvakrat sprali s puferirano fiziološko raztopino. Nato smo v
prvo epruveto dodali 20 µl izotipskih kontrol, v drugo pa 20 µl
monoklonskih protiteles. Uporabili smo monoklonska proti-
telesa anti-CD15-PC5, CD55-PE in CD59-FITC (Immunotech,
France), ki so bila označena s tremi različnimi fluorescenčnimi
barvili: CD15 s fikoeritrin-cianinom 5,1 (PC5), CD55 s fikoeri-
trinom (PE) in CD59 s fluorescein-izotiocianatom (FITC). Po
končani 15-minutni inkubaciji s protitelesi smo odčitali vre-
dnosti na pretočnem citometru.
Rezultati
Bolniki s PNH so imeli več kot 50% nevtroficev z napako PNH
(CD 55/59 negativni). Bolnik z največjim klonom (bolnik 1) je
I-95
imel najbolj aktivno bolezen s številnimi hudimi napadi hemo-
lize in pogostimi hospitalizacijami. Pri dveh bolnikih v remisiji
nismo ugotovili napake PNH ali pa je bil delež teh celic mini-
malen (3%). Pri bolniku 1 in 2 smo v triletnem obdobju opazo-
vali postopno večanje klona PNH.
Do povečanje klona PNH je prišlo tudi pri bolniku 7 z aplastič-
no anemijo (hipoplastična PNH). Bolnika 9 smo zdravili z alo-
genično presaditvijo krvotvornih matičnih celic. Po presaditvi
nismo več ugotovili celic z napako PNH.
Razpravljanje
Občutljivost eritrocitov na litični učinek komplementa se je
vrsto let uporabljala kot posredni kazalec za napako PNH. Pre-
točna citometrija omogoča, z uporabo monoklonskih protite-
les proti antigenom, ki so z GPI pritrjeni na celično membra-
no, bolj specifično ugotavljanje celic z napako PNH. Najpogo-
steje določamo antigena CD55 in CD59, ker sta normalno pri-
sotna na levkocitih, eritrocitih in trombocitih v sorazmerno
veliki količini. Za potrditev PNH je potrebno ugotoviti sočasno
pomanjkanje vsaj dveh antigenov (npr. CD55 in CD59). Na ta
način se izognemo laboratorijskim napakam in možnosti za-
menjave za prirojeno pomanjkanje samo enega antigena. Obi-
čajno se določa napaka PNH na eritrocitih ali granulocitih. Pri-
poročajo, da se za ugotavljanje PNH uporabijo obe vrsti celic
(4). V redkih primerih je v krvi prisoten klon PNH samo pri
granulocitih. Po hudi hemolizi in številnih transfuzijah se lahko
število PNH eritrocitov zmanjša pod mejo zaznavanja. Na dru-
gi strani pa je lahko pri bolnikih s hudo aplazijo število granulo-
citov premajhno za oceno. Preiskava eri-
trocitov omogoča razlikovanje med ce-
licami z napako PNH3 in PNH2 (5, 6).
To razlikovanje je pri granulocitih težje.
Določanje deleža granulocitov z napa-
ko PNH je primerna preiskava za oce-
no velikosti klona (7). Za razliko od eri-
trocitov napaka PNH ne skrajša življenj-
ske dobe granulocitov. Identifikacija gra-
nulocitov samo na osnovi njihovih fizi-
kalnih značilnosti (sprednje in bočno si-
panje svetlobe) v določenih primerih ni
točna. Pri mielodisplastičnih sindromih
je v krvi znaten delež agranularnih ne-
vtrofilcev. Temu se izognemo z upora-
bo tribarvne pretočne citometrije, kjer
ugotavljamo nevtrofilce s pomočjo boč-
nega sipanja svetlobe in monoklonskih
protitels proti antigenu CD15. Preosta-
la dva fluorescenčna kanala uporabimo
za oceno dveh na GPI vezanih antige-
nov (CD55 in CD59). Pomemben je tu-
di način priprave vzorca. Metoda, pri
kateri najprej liziramo eritrocite in šele
nato z monoklonskimi protitelesi ozna-
čimo celice, je boljša od metode, kjer
naprej označimo celice in nato liziramo
eritrocite, ker omogoča uporabo opti-
malnega titra protiteles (8). Pri drugi
metodi je to oteženo, ker se protitelesa
vežejo tudi na eritrocite in trombocite.
Preiskavo granulocitov je potrebno na-
praviti znotraj prvih nekaj ur. Ko se gra-
nulociti in vitro starajo, naraščata nespe-
cifična vezava protiteles in avtofluore-
scenca. Nedavno so razvili nov način do-
ločanja celic PNH z neaktivnim toksinom
aerolizinom, ki je označen s fluorescent-
nim barvilom. Ta označevalec je boljši
kot katero koli protitelo proti beljakovinam, ki so vezane na
GPI. Veže se namreč neposredno na sidro GPI (9, 10).
Možnost, da s pretočno citometrijo odkrijemo majhne klone
pri bolnikih z aplastično anemijo, kjer je Hamov preizkus ne-
gativen, je omogočila, da razlikujemo dve vrsti PNH: hemoli-
tično in hipoplastično PNH. Med zadnjo sodi aplastična anemi-
ja s klonom PNH. Ocenjujejo, da je ob ugotovitvi aplastične
anemije prisoten klon PNH pri tretjini bolnikov (11). Značilno-
sti hemolitične PNH sta intravaskularna hemolitična anemija in
nagnjenost k venskim trombozam. Slednje so tudi glavni vzrok
povečane umrljivosti. Pri hipoplastični PNH ni očitne hemoli-
ze, pač pa je v ospredju anemija, trombocitopenija in levkope-
nija. Bolniki s hemolitično PNH imajo več kot 10% eritrocitov z
napako PNH3. Pri hipoplastični PNH je navadno prisoten sa-
mo klon PNH2. Glavna razlika med hemolitično in hipoplastčno
PNH je v velikosti klona PNH. Delež nevtrofilcev z napako
PNH pri hemolitični obliki je več kot 50%. Pri hipoplastični
PNH je klon navadno manjši od 20% (12). Velikost klona PNH
je premosorazmerna s stopnjo anemije (7). Tudi pri naših bol-
nikih smo opazovali omenjene značilnosti. Pri dveh bolnikih s
spontano remisijo smo le-to potrdili z odsotnostjo klona PNH
ali z deležem celic PNH pod 5%. Remisija bolezni pri PNH ni
redka. Do nje pride v približno 15% (13). S spremljanjem ve-
likosti klona lahko ugotovimo, kateri bolnik je na poti v remisi-
jo. Ocena velikosti klona je pomembna tudi za oceno tveganja
za trombotične zaplete. Ugotovili so, da je 10-letno tveganje
za trombozo pri bolnikih z velikim klonom (> 50%) 44%, pri
bolnikih z majhnim klonom pa 5,8% (14). Trombotične zaple-
te lahko preprečimo s preventivnim dajanjem antikoagulacij-
skih zdravil (marivarin).
Razpr. 1. Laboratorijski izsledki pri bolnikih s PNH in AA.
Table 1. Laboratory data in patients with PNH and AA.
Bolnik
Dg
Mesec/leto Hamov test* NG NG Hb Ret Tr
Patient Month/year Ham’s test* 109/L CD55/59– g/L 109/L 109/L
1 PNH 11. 2000 5,7 72% 145 190
02. 2001 73% 8,7 70% 131 47 154
04. 2001 5,9 82% 94 109
08. 2001 2,4 98% 85 107
10. 2001 0,7 78% 75 67
10. 2002 1,7 99% 92 146 122
03. 2003 2,3 98% 115 188
11. 2003 2,3 99% 128 162
2 PNH 11. 2000 2,6 46% 92 213
05. 2001 24% 2,7 55% 62 125 166
02. 2004 5,0 64% 75 209 199
3 PNH 11. 2000 37% 1,9 62%
05. 2001 54% 1,8 74% 84 113 291
02. 2004 1,7 63% 82 163 280
4 PNH 11. 2000 10% 6,0 62% 98 404
09. 2002 3,1 89% 109 166 355
02. 2004 3,8 73% 96 231 426
5 PNH 11. 2000 0% 1,4 0%
remisija 03. 2001 1,0 0% 93 52 28
09. 2001 0,7 0% 77 11 25
6 PNH 02. 2001 0% 6,1 0% 132 430
remisija 09. 2001 7,5 3% 126 55 415
7 AA 05. 2001 0,6 37% 70 39
02. 2002 0,4 39% 68 47
02. 2004 2,4 70% 86 61 84
8 AA 03. 2002 0,5 21% 70 20
02. 2004 1,5 17% 136 59 131
9 AA 03. 2002 0,2 7% 68 18
po TKMC 04. 2002 2,6 10% 119 88
02. 2004 1,2 0% 135 33 237
Dg – diagnoza, PNH – paroksizmalna nočna hemoglobinurija; AA – aplastična anemija, NG – nevtrofilci, NG
CD55/59– – CD55/59 negativni nevtrofilci, Hb – hemoglobin, Ret – retikulociti, Tr – trombociti, TKMC – trans-
plantacija krvotvornih matičnih celic, * – hemoliza
Dg – diagnosis, PNH – paroxysmal nocturnal haemoglobinuria, AA – aplastic anaemia, NG – neutrophils, NG
CD55/59– – CD55/59 negative neutrophils, Hb – haemoglobin, Ret – reticulocytes, Tr – platelets, TKMC – trans-
plantation of haematopoietic stem cells, * – haemolysis
MLAKAR U, ŽONTAR D. UGOTAVLJANJE IN SPREMLJANJE KLONA PNH Z DOLOČANJEM CD55 IN CD59 NA NEVTROFILCIH
I-96 ZDRAV VESTN 2004; 73: SUPPL I
Zaključki
Ugotavljanje deleža nevtrofilcev z napako PNH nima le dia-
gnostičnega pomena. To potrjujejo naše izkušnje in podatki iz
literature. Omogoča dokaj dobro oceno velikosti klona PNH in
s tem tudi spremljanje njegove dinamike. Ti podatki so po-
membni tudi pri odločanju za zdravljenje. Pri bolnikih z veli-
kim klonom se bomo zaradi povečanega tveganja za trombo-
zo odločili za preventivno zdravljenje z marivarinom. Če ugo-
tovimo postopno zmanjševanje velikosti klona, je verjetnost,
da bo prišlo do remisije, znatna. V tem primeru bomo odsveto-
vali zdravljenje s presaditvijo krvotvornih matičnih celic.
Literatura
1. Rosse WF. Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. In: Hoffman R, Benz EJ,
Shattil SJ, Furie B, Cohen HJ, Silberstein LE eds. Hematology: basic principles
and practice. 3rd ed. New York: Churchill Livingstone, 2000: 331–42.
2. Luzzato L. Pathophysiology of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Ha-
ematologica 2000; 84: 203–9.
3. Schrezenmeier H, Hildebrand A, Rojewski M. Paroxysmal nocturnal hemo-
globinuriaa replacement of haemapoetic tissue. Acta Haematol 2000; 103;
41–8.
4. Richards SJ, Rawstron AC, Hillmen P. Application of flow cytometry to the
diagnosis of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Cytometry 2000; 42:
223–33.
5. Borowitz MJ. Flow cytometry testing in PNH. How much is enough? Cytome-
try 2000; 42: 221–2.
6. Hall SE, Rosse WF. The use of monoclonal antibodies and flow cytometry in
the diagnosis of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Blood 1996; 87:
5332–40.
7. Piedras J, Lopez-Karpovitch X. Flow cytometric analysis of glycosylphospha-
tidyl-inositol-anchored proteins to assess paroxysmal nocturnal hemoglo-
binuria clone size. Cytometry 2000; 42: 234–8.
8. Hernandez-Campo PM, Martin-Ayuso M, Almeida J, Lopez A, Orfao A. Compa-
rative analysis of different flow cytometry-based immunophenotypic met-
hods for the analysis of CD59 and CD55 expression on major peripheral
blood cell subsets. Cytometry 2002; 50: 191–201.
9. Brodsky RA, Mukhina GL, Li S, Nelson KL, Chiurazzi PL, Buckley JT, Borowitz
MJ. Improved detection and characterization of paroxysmal nocturnal he-
moglobinuria using fluorescent aerolysin. Am J Clin Pathol 2000; 114: 459–66.
10. Krauss JS. Laboratory diagnosis of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria.
Ann Clin Lab Sci 2003; 33: 401–6.
11. Maciejewski JP, Rivera C, Kook H, Dunn D, Young NS. Relationship between
bone marrow failure syndromes and the presence of glycophosphatidyl
inositol-anchored protein-deficient clones. Br J Haematol 2001; 115: 1015–
22.
12. Hillmen P, Richards SJ. Implication of recent insights into the pathophysi-
ology of paroxysmal nocturnal haemoglobinuria. Br J Haematol 2000; 108:
470–9.
13. Hillmen P, Lewis SM, Bessler M, Luzzatto L, Dacie JV. Natural history of paroxy-
smal nocturnal hemoglobinuria. N Engl J Med 1995; 333: 1253–8.
14. Hall C, Richards S, Hillmen P. Primary prophylaxis with warfarin prevents
thrombosis in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH). Blood 2003;
102: 3587–91.