MOŽNOSTI UPORABE OSTANKOV PROIZVODNJE V OLJKARSTVU POROČILO CILJNORAZISKOVALNEGA PROJEKTA »CRP V4-1621« MOŽNOSTI UPORABE OSTANKOV PROIZVODNJE V OLJKARSTVU Poročilo ciljnoraziskovalnega projekta »CRP V4-1621« Naročnik: Ministrstvo za kmetijstvo, gozdarstvo in prehrano Dunajska 22 1000 Ljubljana Javna agencija za raziskovalno dejavnost Republike Slovenije Bleiweisova cesta 30 1000 Ljubljana Sodelujoče raziskovalne organizacije: • Inštitut za oljkarstvo, Znanstveno-raziskovalno središče Koper, Garibaldijeva 1, 6000 Koper, • Oddelek za živilstvo, Biotehniška Fakulteta, Univerza v Ljubljani, Jamnikarjeva 101, 1000 Ljubljana, • Oddelek za zootehniko, Biotehniška Fakulteta, Univerza v Ljubljani, Groblje 3, 1230 Domžale. Koper, oktober 2019 Obrazec ARRS-RPROJ-CRP-HRANA-VP-2014 Stran 1 od 42 MOŽNOSTI UPORABE OSTANKOV PROIZVODNJE V OLJKARSTVU Poročilo o ciljnoraziskovalnem projektu »CRP V4-1621« Avtorji besedila in vsebin: Maja Podgornik, Milena Bučar-Miklavčič, Alenka Levart, Janez Salobir, Vida Rezar, Nataša Poklar Ulrih, Mihaela Skrt, Bojan Butinar Vodja projekta: Bojan Butinar Tehnična urednica: Maja Podgornik Lektorirala: Nina Novak Kerbler Oblikovanje naslovnice: Alenka Obid Založnik: Znanstveno-raziskovalno središče Koper, Annales ZRS Za založnika: Rado Pišot Spletna izdaja, dostopno na: https://www.zrs-kp.si/index.php/research-2/zalozba/monografije/ Publikacija je nastala v okviru projekta CRP V4-1621 Možnosti uporabe ostankov proizvodnje v oljkarstvu, ki ga sofinancirata Ministrstvo za kmetijstvo, gozdarstvo in prehrano in Javna agencija za raziskovalno dejavnost Republike Slovenije iz državnega proračuna. Kataložni zapis o publikaciji (CIP) pripravili v Narodni in univerzitetni knjižnici v Ljubljani COBISS.SI-ID=304820736 ISBN 978-961-7058-30-7 (pdf) Obrazec ARRS-RPROJ-CRP-HRANA-VP-2014 Stran 2 od 42 VSEBINA DS1 POPIS STANJA IN PRIPRAVA PRIPOROČIL ZA KORISTNO UPORABO OSTANKOV PROIZVODNJE V OLJKARSTVU .................................................................................................................................................... 5 DS.1.1 PREGLED IN SINTEZA DO ZDAJ ZNANIH PODATKOV IN RAZISKAV S PODROČJA ............................................................. 5 DS.1.2 POPIS STANJA OSTANKOV V SLOVENSKEM OLJKARSTVU ....................................................................................... 11 DS.1.3 SPREMLJANJE UPORABE TROPIN IN RASTLINSKE VODE NA KMETIJSKIH ZEMLJIŠČIH ..................................................... 12 DS2 PREHRANSKA VREDNOST IN KRMLJENJE ŽIVALI ..................................................................................... 18 DS2.1 PREGLED IN SINTEZA DO ZDAJ ZNANIH PODATKOV IN RAZISKAV ............................................................................. 18 DS2.2 ANALIZA IN MERITVE HRANILNE VREDNOSTI OLJČNIH LISTOV IN TROPIN ................................................................... 18 DS2.2.1 Analiza osnovnih parametrov hranilne vrednosti ........................................................................... 18 DS2.2.2 Meritve prebavljivosti oz. presnovljivosti energije in hranil pri prašičih in perutnini ...................... 19 DS2.3 IN VITRO RAZISKAVE PREHRANSKE VREDNOSTI ZA PREŽVEKOVALCE ......................................................................... 23 DS2.4 OCENA MOŽNOSTI UPORABE OLJČNIH LISTOV IN TROPIN ZA SILIRANJE ..................................................................... 29 DS3 PRIPRAVA EKSTRAKTOV, BOGATIH S FENOLNIMI SPOJINAMI, ZA PRIPRAVO PREHRANSKIH DOPOLNIL 33 DS3.1 PREGLED IN SINTEZA DOSEDANJIH ZNANIH PODATKOV IN RAZISKAV ........................................................................ 33 DS3.2 PRIPRAVA IN ANALIZA ETANOLNIH EKSTRAKTOV OLJČNIH LISTOV IN TROPIN.............................................................. 33 DS3.3 KAPSULACIJA S PROLIPOSOMI IN KARAKTERIZACIJA ............................................................................................. 34 DS3.4 PRIPRAVA ALGINATNIH/HITOZANSKIH KAPSUL IN KARAKTERIZACIJA IZ EKSTRAKTA OLJČNIH LISTOV ................................ 34 DS3.5 PRIPRAVA EKSTRAKTA ZA UPORABO V ŽIVILSKIH IZDELKIH Z METODO SUŠENJA Z RAZPRŠEVANJEM ................................. 34 DS3.6 TESTIRANJE STABILNOSTI EKSTRAKTOV V PREHRANSKEM DOPOLNILU ...................................................................... 36 DS 4 IZDELAVA SMERNIC ZA TRAJNOSTNO UPORABO OSTANKOV PROIZVODNJE V OLJKARSTVU ................ 38 DS 5 KOMUNIKACIJA IN DISEMINACIJA ......................................................................................................... 39 ZAHVALA ....................................................................................................................................................... 42 Obrazec ARRS-RPROJ-CRP-HRANA-VP-2014 Stran 3 od 42 Obrazec ARRS-RPROJ-CRP-HRANA-VP-2014 Stran 4 od 42 DS1 POPIS STANJA IN PRIPRAVA PRIPOROČIL ZA KORISTNO UPORABO OSTANKOV PROIZVODNJE V OLJKARSTVU DS.1.1 Pregled in sinteza do zdaj znanih podatkov in raziskav s področja 1 Načini predelave oljk in ostanki proizvodnje Oljke prispejo v predelavo v različnih zabojih ali vrečah, kjer v katerih so lahko poleg prisotni tudi listje, veje, kamni, zemlja in pripomočki za obiranje oljk, ki pomotoma zaidejo mednje. Nečistoče lahko negativno vplivajo na kakovost olja in poškodujejo opremo pri predelavi. Zato se večje mehanske nečistoče odstranijo z rešetko, listje pa z vpihovanjem zraka (ventilatorjem). Zemlja in druge nečistoče z oljk pa se odstranijo s pranjem. Oprane oljke se zmeljejo v oljčno drozgo. Za mletje se najpogosteje uporabljajo drobilniki (s kladivi, noži ali vrtljivimi valji) ali mlinski kamni. Oljčna drozga se mesi v posodah za mesenje ali se preša. Pri tem se iz oljčne drozge izloča oljčno olje. Obstajata dva osnovna tehnološka postopka za izločanje oljčnega olja: 1. prešanje oljčne drozge (tradicionalna predelava oljk) – izloča se oljčno olje, pri tem ostanejo oljčne tropine (z majhnim deležem vode) in rastlinska voda, ki je pomešana z vodo, dodano v različnih fazah predelave. 2. mesenje in centrifugiranje oljčne drozge (tehnologija kontinuirne predelave oljk z uporabo dekanterjev) – s pomočjo centrifugalne sile se loči oljčno olje od trdnih delcev in vode. V ta namen se uporabljajo 3- ali 2-fazni dekanterji. Za izločanje oljčnega olja iz oljčne drozge so se tradicionalno uporabljale preše. Za zagotavljanje gospodarsko upravičene predelave oljk in kakovostnega oljčnega olja je bila v 70. letih prejšnjega stoletja razvita nova tehnologija izločanja olja z uporabo 3-faznih dekanterjev. Pri 3-faznem dekanterju dobimo proizvod oljčno olje (1. faza), pri tem ostanejo oljčne tropine (2. faza) in rastlinska voda ter voda, dodana v različnih fazah predelave (3. faza). Zaradi velike količine vode, dodane v različnih fazah predelave s 3-faznimi dekanterji, so bili ostanki iz predelave oljk problematičen odpadek. Zato so (Alburquerque in sod., 2004; Roig in sod., 2006) v začetku devetdesetih let prejšnjega stoletja razvili sistem predelave oljk z 2-faznim dekanterjem. Ta sistem imenujejo tudi »ekološki sistem«, saj poleg tega, da močno zmanjša količine vode, dodane v različnih fazah predelave, zmanjša tudi izpiranje fenolnih spojin iz oljčnega olja (Dermeche in sod., 2013). Pri 2-faznem dekanterju dobimo oljčno olje (1. faza) in oljčne tropine z visoko vsebnostjo vode (2. faza). Količina vode vključuje rastlinsko vodo in vodo, uporabljeno v različnih fazah predelave – pri mesenju, centrifugiranju, separatorju. Pri tej tehnologiji se voda dodaja le izjemoma (suhe oljke, prezreli plodovi), zato je količina rastlinske vode bistveno manjša v primerjavi s 3-faznim dekanterjem. Večina novih oljarn iz oljčnih tropin z visoko vsebnostjo vode tudi ločuje koščice, ki se uporabljajo kot gorivo. V preglednici 1 so opisane vrste ostankov pri predelavi oljčnega olja, ki jih je ob upoštevanju krožnega gospodarstva mogoče ponovno uporabiti. Ti ostanki se po trenutno veljavni slovenski zakonodaji uvrščajo med odpadke (Uredba o odpadkih, Uradni list RS, št. 37/15 in 69/15). Obrazec ARRS-RPROJ-CRP-HRANA-VP-2014 Stran 5 od 42 Preglednica 1: Ostanki proizvodnje oljk in mogoča uporaba. Ostanki proizvodnje oljk Slovenski izraz Italijanski izraz Španski izraz Angleški izraz Možnost uporabe oljčne tropine oljčna pogača sansa vergine di oliva orujo olive cake • proizvodnja električne energije preša olive pomace • ekstrakcija ostankov olja (vsebnost vode 25–28 %) • ekstrakcija organskih spojin (pektin, antioksidanti) • prehrana živali vlažne tropine sansa vergine di oliva di orujo húmedo olive cake • ekstrakcija ostankov olja 3-fazni sistem centrifugazioni a 3 fasi olive pomace • proizvodnja električne energije (vsebnost vode 48–52 %) zelo vlažne tropine sansa vergine di oliva di alpeorujo two-phase • kompost 2-fazni sistem centrifugazioni a 2 fasi olive-mill waste • ponovno centrifugiranje (vsebnost vode 55–70 %) olive wet pomace (repaso) olive wet cake voda odpadna voda aqua di lavaggio delle alpechín (agua de olive mill wastewater • za namakanje (voda za pranje oljk in olive vegetación junto • za gnojenje čiščenje naprav za predelavo con el agua de oljk) proceso) rastlinska voda aqua di vegetazione (rastlinska voda in voda, dodana v različnih fazah predelave) oljčni listi oljčni listi foglie hojas olive leaves • organski substrat za kompostiranje • prehrana živali • direkten nanos na zemljišče • ekstrakcija fenolnih spojin • ekstrakcija sladkornega alkohola manitola oljčne koščice oljčne koščice nocciolo di oliva hueso olive stones, olive pit ogrevanje Obrazec ARRS-RPROJ-CRP-HRANA-VP-2014 Stran 6 od 42 Med ostanki proizvodnje, ki jih je mogoče ponovno uporabiti, pomeni največje ekološko tveganje rastlinska voda z vodo, dodano v različnih fazah predelave (v nadaljevanju rastlinska voda), ki nastane v večjih količinah pri tehnologiji kontinuirane predelave oljk z uporabo 3-faznih dekanterjev in tradicionalnih preš (Roig in sod., 2006). Zrnčević (2018) v preglednem članku o vrednotenju odpadnih voda iz predelave oljk povzema, da pri predelavi 1000 kg oljk s prešo nastane 400–600 litrov rastlinske vode oz. odpadne vode, pri predelavi s 3-faznim dekanterjem pa 800–1000 litrov rastlinske oz. odpadne vode. Poudarja, da pri dvofaznem sistemu ne nastaja odpadna voda, temveč poltrdi proizvod. Rastlinska voda ima lahko toksične učinke ob nenadzorovani in neustrezni uporabi, saj vsebuje organske kisline, lipide, alkohole in fenolne spojine in ima nizek pH (Dermeche in sod., 2013). Problematika toksičnosti rastlinskih voda je bila v različnih sredozemskih državah, pridelovalkah oljčnega olja, obravnavana različno (Giovacchino, 2010). Uvedene so bile te rešitve: • Uvedba tehnologije kontinuirane predelave oljk z uporabo 2-faznih dekanterjev, pri kateri ne nastane rastlinska voda. • Shranjevanje in odparevanje rastlinske vode v velikih zajetjih. • Čiščenje rastlinske vode s fizikalno-kemijskimi ali biotehnološkimi postopki. • Ekstrakcija organskih spojin iz rastlinske vode. • Nadzorovan neposreden nanos rastlinske vode in oljčnih tropin na kmetijske površine kot gnojilo ali sredstvo za izboljšavo tal (Giovacchino, 2010; Roig in sod., 2006). Italijanska zakonodaja (zakon št. 574 z dne 11. 11. 1996) omejuje vnos rastlinske vode in oljčnih tropin glede na tehnološki postopek predelave: − pri tradicionalnem postopku je dovoljena letna količine raztrosa ostankov do 50 m³/ha površine; − pri kontinuiranem postopku je dovoljena letna količine raztrosa ostankov do 80 m³/ha površine. Hkrati italijanska zakonodaja predvideva še dodatna določila glede obveščanja župana o vnosu ostankov, načina vnosa, shranjevanja ostankov predelave, sankcijah in nadzoru. 2 Vplivi rastlinske vode in oljčnih tropin na okolje Ob nenadzorovanem neposrednem nanosu velikih količin rastlinske vode in oljčnih tropin v tla lahko le zaradi vsebnosti fenolnih spojin negativno vplivajo na rast rastlin in razvoj mikroorganizmov. Fenolne spojine lahko zaradi toksičnega vpliva na mikroorganizme in velike sposobnosti vezave beljakovin omejujejo proces mineralizacije dušika v tleh (De Neve in sod. 2004). Poleg tega lahko pri neprimerni uporabi zavirajo tudi arbuskularno mikorizo (simbioza med glivami iz debla Glomeromycota in večino družin kopenskih rastlin) (Martin in sod., 2002) in toksično delujejo na rastline (naravni herbicid ali zaviralec kalitve semen). Poleg tega se lahko v času delovanja oljarn (oktobra in novembra) ob nenadzorovanih velikih količinah nanosa rastlinske vode in oljčnih tropin po tleh fenolne spojine izpirajo v podtalnico. Vendar so najnovejše raziskave pokazale, da se fitotoksičnost fenolnih spojin v tleh v ugodnih okoljskih pogojih za razgradnjo hitro zmanjša (Barbera in sod., 2013 in Buchmann in sod., 2015). Barbera in sod. (2013) poročajo, da je najprimernejši čas nanosa oljčnih tropin na kmetijska zemljišča takrat, ko ugodne temperaturne in vlažne razmere v tleh spodbujajo biološko aktivnost in razgradnjo fenolnih spojin. Avtorji so ugotovili, da se fenoli v tropinah, ki so nanesene po zemljišču, zelo hitro razgradljivi – proces razgradnje traja od enega do treh mesecev. Vsekakor pa Piotrowska in sod. (2011) ter Dermeche in sod. (2013) poudarjajo, da je pufrska sposobnost tal za nevtralizacijo vnosa rastlinske vode in oljčnih tropin močno odvisna od značilnosti in tipa tal. Pri neustreznih in velikih količinah nanosa na površino tal lahko tudi emulgirane maščobe (razpršene manjše kapljice maščob) v oljčnih tropinah ustvarijo pogoje, ki niso ugodni za ohranjanje dobre strukture tal (zlasti glinenih). Na površini tal lahko nastane nepropusten sloj, ki omeji izmenjavo plinov med tlemi in atmosfero in kroženje zraka v aktivni plasti tal, kar negativno vpliva na dihanje korenin in talnih organizmov (Nieto, 2016). Obrazec ARRS-RPROJ-CRP-HRANA-VP-2014 Stran 7 od 42 Hkrati pa primeren nanos oljčnih tropin poveča organsko snov v tleh, ki je vir rastlinskih hranil, sodeluje pri tvorbi strukturnih agregatov, poveča kationsko izmenjalno kapaciteto tal, ki se odraža v večji sorpcijski sposobnosti za vezavo rastlinskih hranil (zmanjšanje izpiranja rastlinskih hranil v podtalnico), izboljša sposobnost tal za zadrževanje vode in je vir ogljika za številne talne organizme, ki so aktiven in zelo pomemben del tal. V sredozemskih tleh, v katerih je vsebnost organske snovi nizka, je gnojenje z oljčnimi tropinami priporočljiv ukrep za povečanje organske snovi (López - Piñeiro in sod. 2008, 2011). Na območjih, kjer v Sloveniji uspevajo oljke, so tla v prvem (zgornjem) horizontu slabo humozna (1–2 %) do srednje humozna (2–4 %) (slika 1 – Pedološka karta – Center za pedologijo in varstvo okolja). Optimalna vsebnost organske snovi oz. humusa v tleh se razlikuje glede na vrsto kulture (priporočena vrednost za tla oljčnih nasadov je vsaj 4 % organske snovi). Oljčne tropine in rastlinska voda imajo rahlo nizek pH (4,3–5,5) in bi lahko ob neustrezni uporabi povzročile zakisanje tal. Na srečo ima velik del Slovenije tla, razvita na matičnih podlagah z veliko Ca-in Mg-kationov in karbonatov (ARSO, 2019). Pufrna sposobnost takih tal je velika, zato ni bojazni, da bi pri zmerni uporabi oljčnih tropin prišlo do zakisanja tal. Hkrati so zgornji horizonti tal na karbonatnem flišu obalnega in priobalnega območja in plitvih (skeletnih) tleh na apnencu nevtralni ali celo šibko bazični pH > 7,2. 3 Fenolne spojine Fenolne spojine (naravni fenoli), ki so prisotne v rastlinski vodi in oljčnih tropinah, so sekundarni metaboliti (so eni izmed najbolj zastopanih sekundarnih metabolitov v rastlinah), zato so tudi močno zastopani mikronutrienti v človeški prehrani. Njihovih značilnosti pa ne smemo zamenjati s t. i. »industrijskimi fenoli«, ki spadajo med enostavne fenole, so hlapni in toksični. Uporabljajo se kot osnovna surovina za vrsto industrijskih izdelkov – kot so fenol-formaldehidne smole. »Industrijski fenoli« so industrijsko proizvedeni iz nafte (premoga) in so uvrščeni med nevarne snovi za tla. Za hlapne »industrijske fenole« so predpisane mejne, opozorilne in kritične vrednosti v Uredbi o mejnih, opozorilnih in kritičnih imisijskih vrednostih nevarnih snovi v tleh (Uradni list RS, št. 68/96). Osnovna kemijska značilnost fenolnih spojin (»industrijskih« in »naravnih« fenolov) je aromatski obroč in nanj vezana ena ali več hidroksilnih skupin (slika 1). Slika 1: Aromatski obroč z eno hidroksilno skupino. Industrijske fenolne spojine so enostavni fenoli z enim aromatskim obročem in nanj vezano eno ali več hidroksilnih skupin. Fenolne spojine, ki vsebujejo dva in več aromatskih obročev s hidroksilnimi skupinami, se uvrščajo v skupino polifenolov. Izraz polifenoli se je udomačil predvsem za rastlinske metabolite. Tukaj prihaja do zmede na področju izrazoslovja, saj so med rastlinskimi polifenoli tudi nekatere spojine, ki imajo samo en aromatski obroč in eno hidroksilno skupino (na primer tirozol). Kljub temu jih uvrščamo k polifenolom, saj nastanejo po podobnih metabolnih poteh in imajo podobne značilnosti ter vlogo v rastlinah. Številni rastlinski polifenoli so učinkoviti antioksidanti. Obrazec ARRS-RPROJ-CRP-HRANA-VP-2014 Stran 8 od 42 tirozol hidroksitirozol Slika 2: Fenolne spojine, ki imajo samo en aromatski obroč in eno hidroksilno skupino na aromatskem obroču (tirozol) oziroma dve (hidroksitirozol). V rastlinskem svetu je poleg enostavnih polifenolov, kot sta tirozol in hidroksitirozol, še veliko kompleksnih fenolnih spojin, ki so zgrajene iz več enot osnovnega gradnika (fenola) in drugih bioloških gradnikov, kot so npr. sladkorji ali karboksilne kisline. To so po navadi zelo kompleksne spojine, ki so zelo odvisne od vrste rastlin, zato njihove kemijske in toksične značilnosti niso primerljive ne med seboj ne z industrijsko pridobljenimi fenolnimi spojinami. V oljkah prevladujejo sekoiridoidne fenolne spojine, ki jih najdemo izključno v družini 'Oleaceae'. V skupino sekoiridoidov se uvrščajo sekoiridoidni glukozidi (npr. olevropein, ligstrozid) in njihovi pretvorbeni produkti, kot sta tirozol in hidroksitirozol. Večinoma so sekoiridoidni glukozidi v izvorni oziroma pretvorbeni obliki (aglikoni) prisotni v vseh stopnjah predelave oljk – torej tudi v olju, tropinah in vodah iz oljarn – pač glede na stopnjo predelave in stopnjo kemijske pretvorbe. Obrazec ARRS-RPROJ-CRP-HRANA-VP-2014 Stran 9 od 42 Slika 3: Sekoiridoidne fenolne spojine (olevropein, ligstrozid). Ob sekoiridoidih je v oljkah in zato tudi v oljčnih tropinah še nekaj drugih fenolnih spojin, kot so flavonoidi (apigenin, luteolin in njuni glukozidi) ter verbaskozid in lignani. Zaradi vseh opisanih značilnosti se je na področju raziskav, ki se ukvarjajo z oljkami, udomačil izraz biofenoli (poenostavljeno za oljčne bioaktivne fenolne spojine). V skladu s splošno terminologijo se lahko uporabljajo različni izrazi, npr. oljčni biofenoli, biofenoli, oljčni polifenoli, polifenoli in fenolne spojine. Polifenoli (biofenoli) v oljčnem olju in oljčnih tropinah niso zdravju nevarne snovi, saj je zanje znanstveno ugotovljeno, da ugodno vplivajo na zdravje, zato se za oljčno olje na podlagi uredbe Komisije (EU) št. 432/2012 o seznamu dovoljenih zdravstvenih trditev na živilih, razen trditev, ki se nanašajo na zmanjšanje tveganja za nastanek bolezni ter na razvoj in zdravje otrok, lahko uporablja zdravstvena trditev: »Polifenoli v oljčnem olju prispevajo k zaščiti lipidov v krvi pred oksidativnim stresom. Trditev se lahko uporablja le za oljčno olje, ki vsebuje vsaj 5 mg hidroksitirozola in njegovih derivatov (npr. kompleks olevropeina in tirozol) na 20 g oljčnega olja. Za navedbo trditve je potrošnike treba obvestiti, da se koristni učinek doseže z dnevnim vnosom 20 g oljčnega olja.« Obrazec ARRS-RPROJ-CRP-HRANA-VP-2014 Stran 10 od 42 DS.1.2 Popis stanja ostankov v slovenskem oljkarstvu Leta 2005 smo v Sloveniji imeli skupno 31 oljarn, od tega je bilo 20 takih, ki še niso bile registrirane v registru obratov, ki ga vodi Uprava Republike Slovenije za varno hrano, veterinarstvo in varstvo rastlin (Bandelj in sod. 2008). Danes je v register obratov vpisanih 39 oljarn, ocenjujemo pa, da jih je v slovenskem prostoru veliko več (okoli 60 oljarn). V okviru projekta CRP V4-1621 je bilo popisanih 27 oljarn. Ugotovljeno je bilo, da se v Sloveniji za predelavo oljk pretežno uporablja tehnologija kontinuirane predelave z uporabo 2-faznih dekanterjev (81 %) (slika 4). Slika 4: Tehnologije predelave oljk, uporabljene v Sloveniji. V Sloveniji imamo po podatkih iz dejanske rabe (2019) 2.356 ha oljčnikov, v katerih se po ocenah pridela od 1.944 do 6.649 ton oljk. Pridelana količina oljk močno niha med posameznim leti, kar vpliva tudi na količino ostankov proizvodnje oljk. V preglednici 2 so navedene ocene ostankov proizvodnje oljk, saj je v register kmetijskih gospodarstev vpisanih le 60 % oljkarjev, registra ostankov proizvodnje oljk pa v Sloveniji nimamo. Ocenjena količina dobre letine je 1.000 t olja in okoli 7.000 ton oljk. Če bi v Sloveniji imeli samo tehnologijo pridelave 3-faznih dekanterjev, bi po podatkih (Zrnčević, 2018) iz 7.000 ton oljk pridelali 1.000 t olja, 7.000 m3 rastlinske oz. odpadne vode in okoli 3.000 ton suhih tropin, kar bi skupaj znašalo 10.000 m3 ostankov proizvodnje oljk. Če bi na celotno površino oljčnikov 2.356 ha neposredno nanesli 10.000 m3 ostankov proizvodnje oljk, bi na površino maksimalno nanesli 4,3 m3 ostankov proizvodnje oljk/ha, kar je znatno manj od dovoljene letne količine raztrosa ostankov, priporočene v italijanski zakonodaji za kontinuirani postopek predelave (do 80 m³/ha površine). Vendarle pa je treba poudariti, da je samo 11 % oljk v Sloveniji predelanih s tehnologijo kontinuirane predelave z uporabo 3-faznih dekanterjev. Obrazec ARRS-RPROJ-CRP-HRANA-VP-2014 Stran 11 od 42 Preglednica 2: Ocenjena količina ostankov proizvodnje oljk v slovenski Istri. dobra letina povprečna slaba letina Parameter letina površina oljčnikov – dejanska raba 2.356 2.356 2.356 (ha) število dreves (200/ha) 471.200 471.200 471.200 ocena količine oljk (t) 6.649 3.989 1.944 količina olja (t) 1.000 600 300 količina oljčnih tropin (t) – skupaj (m3) 4.500 2.699 1.315 preša (m3) 324 194 95 2-fazni dekanter (m3) 3.716 2.229 1.086 3-fazni dekanter (m3) 460 276 134 količina rastlinske vode in vode, 717 430 209 dodane v različnih fazah predelave (t) – skupaj (m3) preša (m3) 279 167 81 2-fazni dekanter (m3) / / / 3-fazni dekanter (m3) 438 263 128 DS.1.3 Spremljanje uporabe tropin in rastlinske vode na kmetijskih zemljiščih V okviru projekta CRP V4-1621 so bile ugotovljene značilnosti oljčnih tropin pri različnih tehnologijah predelave oljk (preglednica 3). Značilnosti oljčnih tropin smo spremljali v letih 2016 in 2017. Skupno je bilo odvzeto 24 vzorcev (štirje vzorci – preša, osem vzorcev – 3-fazni dekanter, 14 vzorcev – 2-fazni dekanter). Oljčne tropine, pridobljene v sistemu predelave z 2-faznim dekanterjem, imajo v primerjavi z oljčnimi tropinami iz sistema predelave s prešami (tradicionalni sistem) in 3-faznim dekanterjem drugačne značilnosti. Preglednica 3: Primerjalna preglednica značilnosti oljčnih tropin pri različnih tehnologijah predelave oljk v slovenski Istri za letnika 2016 in 2017. Parameter (na suho snov) preša 2-fazni dekanter 3-fazni dekanter vsebnost vlage (% na svež vzorec) 32,5 68,7 55,7 skupni N (g/kg) 11,9 10,2 8,7 P (g/kg) 0,6 1,4 1,1 K (g/kg) 5,5 17,8 12,3 Ca (g/kg) 1,7 2,2 1,94 Fe (mg/kg) 107,89 168,0 132,50 Cu (mg/kg) 14,95 14,5 13,75 beljakovine (g/kg) 74,5 62,1 54,6 maščobe (g/kg) 144,5 155,7 152,7 Ker se danes v slovenski Istri pretežno uporablja tehnologija kontinuirane predelave z uporabo 2-faznih dekanterjev (81-odstotni delež) (slika 4), smo v projektu CRP V4-1621 proučili uporabo tropin, pridobljenih z novo tehnologijo predelave z 2-faznimi dekanterji. Oljčne tropine iz sistema predelave z 2-faznim dekanterjem (preglednica 4), ki je prevladujoča tehnologija predelave oljk v Sloveniji, so bogate s kalijem (K: 4,79–23,72 g/kg suhe snovi), vendar zelo slabo založene s kalcijem (Ca: 1,41–5,16 g/kg suhe snovi) in fosforjem (P: 0,41–2,02 g/kg suhe snovi). V ostankih predelave oljk z 2-faznimi dekanterji je 7,5 od 14,4 g/kg suhe snovi skupnega dušika (N), ki pa je pretežno v organski obliki, zato rastlinam ni dostopen. Poleg tega je v oljčnih tropinah v primerjavi Obrazec ARRS-RPROJ-CRP-HRANA-VP-2014 Stran 12 od 42 z drugimi gnojili zelo malo dušika. Zaradi močne imobilizacije dušika v tropinah, pridobljenih s tehnologijo predelave z uporabo 2-faznih dekanterjev, ostanki predelave oljk niso primerni za gnojenje kmetijskih rastlin, ki potrebujejo za razvoj visoko količino dušika v prvih tednih rasti. Gnojenje z oljčnimi tropinami je zato priporočljivo v trajnih nasadih, kot so oljčniki in vinogradi (De Neve in sod. 2004). Glavno mikrohranilo v oljčnih tropinah je železo (Fe: 60,3–992,5 mg/kg suhe snovi). Druga mikrohranila, kot so baker (Cu), mangan (Mn) in cink (Zn), so v oljčnih tropinah prisotna v zelo majhnih količinah. Preglednica 4: Značilnosti oljčnih tropin pri sistemu predelave z 2-faznim dekanterjem v slovenski Istri za letnika 2016 in 2017. Parameter (na suho snov) povprečje interval KV (%)* vsebnost vlage (%, na svež vzorec) 68,7 52,06–77,32 13,26 skupni N (g/kg) 10,2 7,52–14,43 22,23 P (g/kg) 1,4 0,41–2,02 41,56 K (g/kg) 17,8 4,79–23,72 44,46 Ca (g/kg) 2,2 1,41–5,16 42,62 Fe (mg/kg) 168,0 60,3–992,51 142,31 Cu (mg/kg) 14,5 8,20–21,39 22,44 beljakovine (g/kg) 62,1 47,00–90,20 21,01 maščobe (g/kg) 155,7 105,50–229,11 24,67 *KV% – koeficient variabilnosti Sestava in vsebnost fenolnih spojin v oljčnih tropinah sta odvisni od sorte oljk, porekla, podnebnih razmer, zorenja plodov, tehnologije pridelave in postopka predelave oljk (Obied in sod., 2008). V okviru projekta CRP V4-1621 je bila ugotovljena fenolna sestava pri različnih tehnologijah predelave oljk (preglednica 5). Skupno je bilo odvzeto 24 vzorcev (štirje vzorci – preša, osem vzorcev – 3-fazni dekanter, 14 vzorcev – 2-fazni dekanter). Obrazec ARRS-RPROJ-CRP-HRANA-VP-2014 Stran 13 od 42 Preglednica 5: Primerjalna preglednica značilnosti oljčnih tropin pri različnih tehnologijah predelave oljk v slovenski Istri za letnika 2016 in 2017 (CS – spojine, potrjene na osnovi standarda, MS – spojine, potrjene na osnovi masnega spektra). Povprečje (mg/kg) Parameter (na suho snov) 2-fazni 3-fazni preša dekanter dekanter Asignirane fenilni alkoholi hidroksitirozol 855 438 557 (znane) glukozid (MS) fenolne hidroksitirozol 5.686 3.203 2.596 spojine) (CS, MS) tirozol glukozid (MS) 751 314 442 tirozol (CS, MS) 751 532 574 feniletanoidni verbaskozid (CS, MS) 1.264 2.434 1.510 glukozidi flavonoidi luteolin-7-O- glukozid 249 338 329 (CS, MS) luteolin (CS, MS) 835 710 536 apigenin (CS, MS) 105 107 86 Skupne asignirane (znane) fenolne spojine 10.077 6.769 6.353 Skupne neasignirane (neidentificirane) fenolne spojine, 7.271 12.523 10.917 izražene kot tirozol Skupne fenolne spojine 17.349 17.600 17.271 V okviru projekta CRP V4-1621 je bilo ugotovljeno, da v oljčnih tropinah iz sistema predelave z 2-faznim dekanterjem med fenolnimi spojinami prevladujeta hidroksitirozol (148–8505 mg/kg) in verbaskozid (preglednica 5). V oljčnih tropinah iz sistema predelave z 2-faznim dekanterjem so bile določene tudi druge fenolne spojine, kot so hidroksitirozol glukozid, tirozol glukozid, tirozol, luteolin-7-O-glukozid, luteolin in apigenin, vendar v znatno manjših koncentracijah. Rezultati raziskave so delno primerljivi s številnimi raziskavami (Japón-Luján & Luque de Castro, 2007; Rubio-Senent in sod., 2012), v katerih avtorji ugotavljajo, da je hidroksitirozol (1624 in 2872 mg/kg) glavna fenolna spojina v oljčnih tropinah. Oljčne tropine iz slovenske Istre se v primerjavi z oljčnimi tropinami iz drugih raziskav razlikujejo po višji vsebnosti verbaskozida, kar je najverjetneje izhaja iz stopnje (ne)zrelosti predelanih oljk in različne vsebnosti rastlinske vode v oljčnih tropinah. V okviru raziskave CRP V4-1621 smo preverili tudi vsebnost fenolnih spojin v tleh po aplikaciji oljčnih tropin iz sistema predelave z 2-faznim dekanterjem na kmetijsko zemljišče. Upoštevaje izsledke (Blagodatskaya & Kuzaykov, 2008), da se kemijska in mikrobiološka sestava tal najbolj spremenita v prvem tednu po nanosu sredstev za izboljšavo tal, so bile fenolne spojine v tleh določene teden dni po aplikaciji oljčnih tropin. Ugotovljeno je bilo, da je bila skupna vsebnost fenolnih spojin v oljčnih tropinah znatno večja (5.409–36.073 mg/kg) kot v tleh, na katera je bilo dodano 80 m3 oljčnih tropin iz sistema predelave z 2-faznim dekanterjem (156–767 mg/kg) (preglednica 6). Razlike so bile opazne tudi v sestavi fenolnih spojin. V oljčnih tropinah iz sistema predelave z 2-faznim dekanterjem sta med fenolnimi spojinami prevladovala hidroksitirozol in verbaskozid, medtem ko sta v tleh z nanosom oljčnih tropin prevladovala apigenin in hidroksitirozol. Nastale razlike najverjetneje izhajajo iz okoljskih pogojev v tleh (pH tal, temperatura, kisik …), ki vplivajo na razgradnjo fenolnih spojin. Sinsabaugh (2010) je ugotovil, da obstaja pozitivna korelacija med aktivnostjo zunajceličnih encimov gliv (e. g. Basidomycetes in Ascomycetes) in bakterij (npr. Pseudomonas), ki razgrajujejo fenolne spojine, in pH-vrednostjo tal. Obrazec ARRS-RPROJ-CRP-HRANA-VP-2014 Stran 14 od 42 Preglednica 6: Primerjalna preglednica vsebnosti fenolnih snovi v oljčnih tropinah iz sistema predelave z 2-faznim dekanterjem in tleh, na katera je bilo dodano 80 m3 oljčnih tropin iz sistema predelave z 2-faznim dekanterjem (CS – potrjene na osnovi standarda, MS – potrjene na osnovi masnega spektra). Oljčne tropine 2-fazni dekanter Tla z dodanimi oljčnimi tropinami (80 m3/ha) e e kg) val kg) kg) val kg) g/ g/ )* g/ g/ )* povprečj (m inter (m KV (% povprečj (m inter (m KV (% Asignirane fenilni hidroksitirozol 438 135–973 0,72 0,00 0,00 0,00 (znane) alkoholi glukozid (MS) fenolne spojine) hidroksitirozol 3.203 148–8.505 0,87 1,25 0,00–4,00 1,51 (CS, MS) tirozol glukozid 314 205–466 0,36 0,75 0,00–2,00 1,28 (MS) tirozol (CS, MS) 532 176–963 0,59 0,25 0,00–1,00 2,00 feniletanoidni verbaskozid (CS, 2.434 84–8.370 1,16 0,25 0,00–1,00 2,00 glukozidi MS) flavonoidi luteolin-7-O-glu 338 93–901 0,73 0,00 0,00 0,00 kozid (CS, MS) luteolin (CS, 710 310–1.368 0,48 0,00 0,00 0,00 MS) apigenin (CS, 107 55–184 0,36 3,25 3,00–4,00 0,15 MS) Skupne asignirane (znane) fenolne spojine 6.769 1.388–12.399 0,68 5,50 3,00–8,00 0,43 Skupne neasignirane (neidentificirane) fenolne 12.523 3.327–25.393 0,52 404 148–760 0,66 spojine, izražene kot tirozol Skupne fenolne spojine 17.600 5.409–36.073 0,61 459 156–767 0,66 *KV% – koeficient variabilnosti Tla z dodanimi oljčnimi tropinami se uvrščajo med rjava evtrična tla, za katera je značilna velika nasičenost z bazičnimi kationi (K+, Ca2+ in Mg2+). Ntougias in sod. (2006) navajajo, da dodajanje Ca(OH)2 oljčnim tropinam iz sistema predelave z 2-faznim dekanterjem ugodno vpliva na razvoj bakterij, ki lahko za vir energije in ogljika (izgradnja celične biomase) učinkovito uporabijo fenolne spojine. Glede na to, da imajo na razgradnjo organskih snovi v tleh velik vpliv tudi podnebne razmere, kot so temperatura, segrevanje in suša, je pri neposrednem nanosu oljčnih tropin na kmetijsko površino treba upoštevati tudi značilnosti tal in okoljske parametre. Predhodne raziskave so pokazale, da je zaradi nizke vsebnosti dušika v oljčnih tropinah iz sistema predelave z 2-faznim dekanterjem pri nanosu teh na kmetijsko površino treba dodati N. Tako smo v okviru projekta CRP V4-1621 izvedli poljski poskus, kjer smo na štirih lokacijah v slovenski Istri v treh različnih datumih (21. marec 2017, 9. november 2017 in 30. marec 2018) spremljali vpliv dodanih oljčnih tropin na pH-vrednost, organski ogljik (C), skupni dušik (N), razmerje ogljika in dušika (C/N) in kalij (K). Na podlagi rezultatov je bilo ugotovljeno, da uporaba oljčnih tropin iz sistema predelave z 2-faznim dekanterjem vpliva na značilnosti tal. Prve razlike med tlemi, gnojenimi z mineralnim gnojilom (300 kg/ha – NPK 15 : 15 : 15) (KONTROLA), in tlemi, gnojenimi z mineralnim gnojilom (300 kg/ha – NPK 15 : 15 : 15) in oljčnimi tropinami iz sistema predelave z 2-faznim dekanterjem (80 m3/ha) (TROPINE + NPK) smo opazili po drugi sezoni nanosa (30. marec 2018), in sicer v vsebnosti organskega ogljika (C) ter razmerja med ogljikom in dušikom (C/N) (preglednica 7). Pridobljeni rezultati so v skladu z rezultati predhodne raziskave, ki je pokazala, da aplikacija oljčnih tropin iz Obrazec ARRS-RPROJ-CRP-HRANA-VP-2014 Stran 15 od 42 sistema predelave z 2-faznim dekanterjem na kmetijskih površinah poveča vsebnost organske snovi in tako ugodno vpliva na strukturo tal ter izboljša sposobnost za zadrževanje vode v njih (Lopez-Piñeiro in sod., 2008; Cucci in sod., 2008). Preglednica 7: Primerjava različnih parametrov med tlemi, gnojenimi z mineralnim gnojilom (300 kg/ha – NPK 15 : 15 : 15) in dodanimi oljčnimi tropinami iz sistema predelave z 2-faznim dekanterjem (80 m3/ha) (TROPINE + NPK), in tlemi, gnojenimi z mineralnim gnojilom (300 kg/ha – NPK 15 : 15 : 15) (KONTROLA). TROPINE + NPK KONTROLA skupni C (%) 21. 3. 2017 3,1 ± 0,84ab 2,0 ± 0,42c 9. 11. 2017 2,4 ± 0,42bc 2,3 ± 0,39bc 30. 3. 2018 3,6 ± 1,02a 2,5 ± 0,26bc skupni N (%) 21. 3. 2017 0,29 ± 0,12a 0,19 ± 0,04a 9. 11. 2017 0,23 ± 0,04a 0,21 ± 0,04a 30. 3. 2018 0,28 ± 0,09a 0,23 ± 0,02a C/N 21. 3. 2017 11,5 ± 1,73ab 11,0 ± 0,82 b 9. 11. 2017 10,7 ± 0,50b 10,7 ± 0,96 b 30. 3. 2018 13,0 ± 0,82a 10,2 ± 1,26 b pH 21. 3. 2017 7,3 ± 0,1a 7,4 ± 0,05a 9. 11. 2017 7,1 ± 0,19b 7,3 ± 0,06ab 30. 3. 2018 7,1 ± 0,07b 7,2 ± 0,13b K2O5 21. 3. 2017 61,0 ± 25,06a 30,1 ± 5,78b 9. 11. 2017 49,1 ± 24,11ab 26,8 ± 3,33b 30. 3. 2018 72,9 ± 23,96a 33,5 ± 13,92b *Vrednosti z isto črko znotraj parametra tal se statistično ne razlikujejo (P ˃ 0,05). V tleh, gnojenih z mineralnim gnojilom, in v tleh, gnojenih z mineralnim gnojilom in oljčnimi tropinami iz sistema predelave z 2-faznim dekanterjem, nismo zaznali razlik v vsebnosti skupnega dušika. Rezultati kažejo nizko vsebnost dušika v oljčnih tropinah iz sistema predelave z 2-faznim dekanterjem. Lopez-Piñeiro in sod. (2008) sicer navajajo, da se je skupna vsebnost dušika v tleh po dveh letih nanosa oljčnih tropin iz sistema predelave z 2-faznim dekanterjem linearno povečala, Gómez-Muñoz in sod. (2011) pa ugotavljajo, da je organski dušik močno imobiliziran v tropinah, zato v vodi ni topen in rastlinam ni dostopen. Pomembne razlike med tlemi, gnojenimi z mineralnim gnojilom, in tlemi, gnojenimi z mineralnim gnojilom in oljčnimi tropinami iz sistema predelave z 2-faznim dekanterjem, so se pokazale pri primerjavi vsebnosti kalija (kot K2O5). Vrednost pH tal se je v času poskusa nekoliko povečala, vendar to ni bila posledica nanosa oljčnih tropin iz sistema predelave z 2-faznim dekanterjem na kmetijske površine, saj ni bilo mogoče opaziti statistično značilnih razlik med tlemi, gnojenimi z mineralnim gnojilom, in tlemi, gnojenimi z mineralnim gnojilom in oljčnimi tropinami iz sistema predelave z 2-faznim dekanterjem. Obrazec ARRS-RPROJ-CRP-HRANA-VP-2014 Stran 16 od 42 Literatura Alburquerque, J. A., Gonzálvez, J., Garcıa, D., Cegarra, J., 2004: Agrochemical characterisation of “alperujo”, a solid by-product of the two-phase centrifugation method for olive oil extraction. Bioresource technology. 91(2): 195–200. Barbera, A. C., Maucieria, C., Cavallarob, V., Ioppoloa, A., Spagna, G., 2013: Effects of spreading olive mill wastewater on soil properties and crops, a review. Agricultural Water Management. 119: 43–53. Blagodatskaya, E., Kuzaykov, Y., 2008: Mechanisms of real and apparent priming effects and their dependence on soil microbial biomass and community structure: Critical review. Biology and Fertility of Soils. 45(2): 115–131. Buchmann, C., Felten, A., Peikert, B., Muñoz, K., Bandow, N., Dag, A., Schaumann, G. E., 2015: Development of phytotoxicity and composition of a soil treated with olive mill wastewater (OMW): An incubation study. Plant Soil. 386 (1): 99–112. Cucci, G., Lacolla, G., Caranfa, L., 2008: Improvement of soil properties by application of olive oil waste. Agronomy for Sustainable Devevelopment. 28(4): 521–526. De Neve, S., Sáez, S. G., Chaves Daguilar, B., Sleutel, S., Hofman, G., 2004: Manipulating N mineralization from high N crop residues using on- and off-farm organic materials. Soil Biology and Biochemistry. 36: 127–134. Dermeche, S., Nadour, M., Larroche, C., Moulti-Mati, F., Michaud, P., 2013: Olive mill wastes: Biochemical characterizations and valorization strategies. Process Biochemistry 48: 1532– 1552. Di Giovacchino, 2010: Tecnologie di lavorazione delle olive in frantoio. Rese di estrazione e qualità dell'olio. Tecniche nuove. 272. Japón-Luján, R., Luque de Castro, M. D., 2007: Static-dynamic superheated liquid extraction of hydroxytyrosol and other biophenols from alperujo (a semisolid residue of the olive oil industry). Journal of Agricultural and Food Chemistry. 55: 3629–3634. López-Piñeiro, A., Albarrán, A., Rato Nunes, J. M., Barreto, C., 2008: Short and medium-term effects of two- phase olive mill waste application on olive grove production and soil properties under semiarid Mediterranean conditions. Bioresource Technology. 99: 7982–7987. López-Piñeiro, A., Albarrán, A., Rato Nunes, J. M., Peña, D., Cabrera, D., 2011: Cumulative and residual effects of two-phase olive mill waste on olive grove production and soil properties. Soil Science Society of America Journal. 75: 1061–1069. Martin, J., Sampedro, I., Garcia-Romera, I., Garcia-Garrido, J. M., Ocampo, J. A., 2002: Arbuscular mycorrhizal colonization and growth of soybean (Glycine max) and lettuce (Lactuc sativa) and phytotoxic effects of olive mill residues Soil Biology & Biochemistry. 34: 1769–1775. Nieto, L. M., 2016: Universidad de Jaen. La industria del aceite de oliva y el medio ambiente. Obied, H. K., Bedgood, D., Mailer, R., Prenzler, P. D., Robards, K., 2008: Impact of cultivar, harvesting time, and seasonal variation on the content of biophenols in olive mill waste. Journal of Agricultural and Food Chemistry 56: 8851–8858. Piotrowska, A., Rao, M. A., Scotti, R., Gianfreda, L., 2011: Changes in soil chemical and biochemical properties following amendment with crude and dephenolized olive mill waste (OMW). Geoderma 161: 8–1. Roig, A., Cayuela, M. L., Sánchez-Monedero, M. A., 2006: An overview on olive mill wastes and their valorisation methods. Waste Management. 26: 960–969. Rubio-Senent, F., Rodríguez-Gutíerrez, G., Lama-Muñoz, A., Fernández-Bolaños, J., 2012: New phenolic compounds hydrothermally extracted from the olive oil byproduct alperujo and their antioxidative activities. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 60: 1175–1186. Sinsabaugh, R. L., 2010. Phenol oxidase, peroxidase and organic matter dynamics of soil. Soil Biology and Biochemistry 42 (3): 391–404. Thompson, R. B., Nogales, R., 1999: Nitrogen and carbon mineralization in soil of vermi-composted and unprocessed dry olive cake (‘‘orujo seco’’) produced from two-stage centrifugation for olive oil extraction. Journal of Environmental Science and Health Part B. 34: 917–928. Zrnčević, S., 2018: Valorizacija otpadnih voda prerade maslina. Hrvatske vode 26 (104) 75–90. Obrazec ARRS-RPROJ-CRP-HRANA-VP-2014 Stran 17 od 42 DS2 PREHRANSKA VREDNOST IN KRMLJENJE ŽIVALI DS2.1 Pregled in sinteza do zdaj znanih podatkov in raziskav Če želimo oljčne liste in tropine uporabljati kot krmila v živalski proizvodnji, moramo natančno poznati njihovo kemijsko sestavo, prehransko vrednost in njihov vpliv na izkoristljivost drugih hranil pri različnih živalskih vrstah. Avtorji do zdaj opravljenih raziskav poročajo o visoki variabilnosti sestave hranljivih snovi v različnih stanskih proizvodih pridelave in predelave oljk. Listi in tropine vsebujejo tudi antinutritivne snovi (lignin, tanini, baker, polifenoli – kadar so v prevelikih količinah), zato jih v krmne obroke lahko dodajamo le v omejenih količinah. Raziskovalci priporočajo, naj se v prehrani prežvekovalcev uporabljajo sveži oljčni listi, oljčne tropine pa naj se konzervirajo, silirajo ali posušijo in peletirajo skupaj z drugimi komponentami. Najbolj raziskana je njihova uporaba v prehrani prežvekovalcev (Molina-Alcaide in sod., 2008), kot vir vlaknine se uporabljajo v prehrani kuncev (De Blas in sod., 2015). Medtem ko višja vsebnost maščob v oljčnih tropinah omejuje njihovo vključevanje v krmne obroke prežvekovalcev, jih lahko kot vir energije izkoristimo v prehrani prašičev in piščancev (Joven in sod., 2008; Al-Harthi, 2017). V tem primeru omejitev za vključevanje v obrok predstavlja visoka vsebnost slabo razgradljivih strukturnih ogljikovih hidratov. Pri vključevanju oljčnih tropin v obrok prežvekovalcev (Molina-Alcaide, 2008) moramo biti pozorni tudi na vsebnost in kakovost (oksidacija) maščob v krmnem obroku, ki negativno vpliva na mikrobno populacijo v vampu. Paziti moramo tudi na vsebnost bakra, predvsem v oljčnih listih, ki lahko omejuje delež tega stranskega produkta v obroku prežvekovalcev. Raziskovalci poročajo tudi o ugodnih učinkih na maščobnokislinsko sestavo mleka, saj se poveča delež enkrat nenasičenih maščobnih kislin in zmanjša delež nasičenih maščobnih kislin. Paiva-Martins in sod. (2009) so proučevali vpliv dodatka oljčnih listov (5 ali 10 %) v krmo pri rastočih prašičih in ugotovili, da dodatek oljčnih listov v primerjavi s komercialno krmno mešanico zniža dnevne priraste in zauživanje krme, predvsem zaradi višje vsebnosti vlaknine, sočasno pa se izboljša tudi kakovost mesa. Pri oljčnih tropinah obstaja omejitev za vključevanje v obrok pri prašičih zaradi visoke vsebnost lignina. V obrok prašičev je mogoče vključiti do 100 g tropin/kg krme in ob tem celo nekoliko izboljšati nekatere proizvodne značilnosti (Joven in sod., 2004). Ugotovili so tudi ugodne učinke na kakovost klavnih trupov in maščobnokislinsko sestavo maščob. Raziskave tudi kažejo, da je oljčne pogače mogoče vključiti v obroke rastočih piščancev do 7,5 % (Abo Omar in sod., 2005), pri višjem deležu (10 %) se zmanjša prirast, uživanje in konverzija krme (Rabayaa in sod, 2001). DS2.2 Analiza in meritve hranilne vrednosti oljčnih listov in tropin DS2.2.1 Analiza osnovnih parametrov hranilne vrednosti Zbiranje vzorcev in kemijske analize glavnih lastnosti oljčnih tropin glede na prehransko vrednost za krmljenje živali so potekale v letih 2016 in 2017. Skupaj smo zbrali in analizirali 39 vzorcev tropin iz različnih sistemov predelave oljk. Z weendsko analizo smo določili osnovno sestavo (suha snov – SS, surove beljakovine – SB, surove maščobe – SM, surovi pepel – SP, surova vlaknina – SV, v nevtralnem detergentu netopna vlaknina – NDV, v kislem detergentu netopna vlaknina – KDV), vsebnosti izbranih mineralov z atomsko absorpcijsko spektrometrijo (AAS) in bruto energijo z uporabo kalorimetrije (preglednica 8). Rezultati so pokazali, da vsebnost sušine v zbranih vzorcih oljčnih tropin zelo variira in je odvisna od tehnologije predelave. Oljčne tropine so v kilogramu suhe snovi v povprečju vsebovale 60,3 ± 13,6 g surovih beljakovin. Oljčne tropine po stiskanju olja v Sloveniji v nasprotju s tropinami po stiskanju olja iz nekaterih drugih držav vsebujejo visok delež surovih maščob (161 ± 40 g surovih maščob, ker slovenski oljarji tropin ne ekstrahirajo z organskimi topili. V tem primeru so maščobe najpomembnejši vir energije za živali. Olje vsebuje visok delež oleinske kisline, kar lahko ugodno vpliva Obrazec ARRS-RPROJ-CRP-HRANA-VP-2014 Stran 18 od 42 tudi na prehransko vrednost in tehnološko kakovost živalskih proizvodov. Vsebnost surove vlaknine je znašala 407 ± 101 g/kg SS. Tropine so v kg sušine v povprečju vsebovale 37,6 ± 23 g surovega pepela. Podatkov o vsebnosti mineralov v oljčnih tropinah je zelo malo, tudi tu avtorji poročajo o visoki variabilnosti (Heuze in sod., 2015; Al-Rabadi, 2017), kar smo potrdili tudi v svoji raziskavi, v kateri je povprečni koeficient variabilnosti (KV) za vsebnost mineralov znašal 32 %. Povprečne vsebnosti fosforja v tropinah iz slovenskih oljčnikov so znašale 1,30 g/kg SS in so nekoliko višje od vsebnosti v dostopni literaturi (0,6–0,8 g/kg). V nasprotju z vsebnostjo fosforja smo v tropinah izmerili nižje vsebnosti kalcija (povprečje 2,07 g/kg SS), kar je manj kot za oljčne tropine navajajo drugi avtorji (3,0– 7,3 g/kg SS). V najvišjih koncentracijah je bil v oljčnih tropinah prisoten kalij (18,4 ± 7,3 g/kg SS), ki ga tropine iz slovenskih oljčnikov vsebujejo več, kot je navedeno v rezultatih drugih avtorjev. Preglednica 8: Povprečna sestava ter vsebnost nekaterih mineralov in bruto energije v oljčnih tropinah iz slovenskih oljčnikov v letih 2016 (N = 19) in 2017 (N = 20). Povprečna vsebnost STD1 RSD1 MIN1 MAX1 Sestava suha snov (SS), g/kg 378 137,2 36 214 736 surove beljakovine, g/kg SS 60,3 13,6 23 33,7 99,6 surove maščobe, g/kg SS 161,1 40,4 25 105,5 264,5 surova vlaknina, g/kg SS 407,1 100,9 25 253,4 574,5 NDV2, g/kg SS 545,3 99,5 18 380,5 748,8 KDV2, g/kg SS 403,5 76,3 19 281,4 574,0 BDI2, g/kg SS 336,3 63,9 19 166,4 454,1 surovi pepel, g/kg SS 37,6 23,0 61 7,2 145,0 Minerali fosfor (P), g/kg SS 1,30 0,63 49 0,29 2,94 kalcij (Ca), g/kg SS 2,07 0,63 30 1,41 5,16 železo (Fe), mg/kg SS 118 50 42 60 262 baker (Cu), mg/kg SS 15,2 3,6 24 8,2 27,2 kalij (K), mg/kg SS 18,4 7,3 40 4,8 26,6 Bruto energija bruto energija, MJ/kg SS 23,1 1,0 4,5 19,8 25,6 1 STD – standardni odklon, RSD – relativni standardni odklon (%), MIN – minimum, MAX – maksimum. 2 NDV – v nevtralnem detergentu netopna vlaknina, KDV – v kislem detergentu netopna vlaknina, BDI – brezdušični izvleček. Ugotovimo lahko, da je sestava hranilnih snovi in mineralov oljčnih tropin iz slovenskih oljčnikov variabilna, za uporabo kot krmilo, predvsem v reji visokoproduktivnih živali, bodo potrebne periodične analize. Pred uporabo je treba tropine posušiti, kar pomeni dodaten strošek. Ker je sezona obiranja oljk in stiskanja olja kratka, bo treba tropine, če bi jih v krmne obroke vključevati vse leto, konzervirati. Poleg vlaknine vsebujejo oljčne tropine tudi relativno visok delež maščob, ki se lahko v prehrani neprežvekovalcev koristno uporabijo kot vir energije. DS2.2.2 Meritve prebavljivosti oz. presnovljivosti energije in hranil pri prašičih in perutnini V okviru projekta smo izvedli bilančna poskusa na pitovnih piščancih (N = 36) in pujskih (N = 24), ki smo jih individualno vhlevili v ustrezne metabolne kletke, ki omogočajo spremljanje uživanja krme in zbiranje izločkov pri piščancih ter ločeno zbiranje blata in urina pri prašičih. Obrazec ARRS-RPROJ-CRP-HRANA-VP-2014 Stran 19 od 42 1. Pitovni piščanci Pitovne piščance provenience ross 308 smo pri starosti 21 dni (ko so prebavila že bolj razvita) individualno vhlevili v metabolne kletke in jih razdelili v pet skupin: kontrolno skupino (KONT), ki ni dobivala dodatka ter po dve skupini z dodatkom oljčnih listov (OLi) ali tropin (OTr), ki smo jim na kilogram osnovne krme primešali 50 ali 100 g oljčnih listov (OLi 50, OLi 100) oziroma oljčnih tropin (OTr 50, OTr 100). Pri pripravi osnovne krmne mešanice (sestavljene iz koruze, pšeničnih otrobov, dehidrirane lucerne, rastlinskega olja, soli, apnenca, monokalcijevega fosfata, lizina, metionina, treonina in premiksa) smo upoštevali normative za pitovne piščance ross 308, ki smo jih zmanjšali za 20 %. Po štirih dneh prilagajanja smo bilančni poskus (spremljanje uživanja krme in zbiranje izločkov) izvajali pet dni. V vzorcih krme in izločkov smo analizirali vsebnost suhe snovi, surovih beljakovin, surovih maščob, surove vlaknine, v nevtralnem (NDV) in kislem (KDV) detergentu netopne vlaknine, surovega pepela, vsebnosti mineralov kalcija, fosforja, kalija, magnezija, mangana, železa, bakra in cinka ter izmerili vsebnost bruto energije in izračunali vsebnosti organske snovi. Izkoristljivost hranilnih snovi (HS) podajamo kot odstotek absorbiranih hranil ((zaužita HS – izločena HS)/zaužita HS*100 %) iz krmnih mešanic (preglednica 9). Izkoristljivost hranilnih snovi in energije oljčnih listov in tropin smo določili tudi z diferenčno metodo (preglednica 10). Preglednica 9: Vpliv oljčnih listov in tropin na izkoristljivost (%) hranilnih snovi, mineralov in energije in navidezna presnovljiva energija (MJ/kg SS) pri pitovnih piščancih. KONT OLi 50 OLi OTr OTr100 SEM1 p 100 50 Hranilne snovi suha snov 74,62a 71,38bc 69,07c 72,76ab 70,45bc 0,57 < 0,0001 organska snov 76,53a 73,30bc 71,36c 74,72ab 72,39c 0,53 < 0,0001 surove beljakovine 64,31a 62,92ab 59,86bc 63,63a 59,42c 0,74 < 0,0001 surove maščobe 81,93a 81,98a 81,27a 85,76b 87,41b 0,80 < 0,0001 surova vlaknina 9,56 6,84 7,46 9,02 10,52 1,46 0,3777 NDV 24,98ab 29,46a 26,46ab 20,04b 23,61ab 1,53 0,0033 KDV 6,84 6,95 4,92 0,75 –0,22 2,08 0,0507 surovi pepel 33,40 30,02 28,93 31,27 29,81 1,18 0,0847 Minerali kalcij (Ca) 40,27 31,60 30,65 40,45 34,91 2,40 0,0144 fosfor (P) 35,92 33,67 34,13 35,83 32,88 1,28 0,3772 magnezij (Mg) 14,09 13,24 10,66 14,36 12,58 1,54 0,4763 železo (Fe) 2,14 1,82 2,29 4,86 2,67 2,04 0,8289 cink (Zn) 11,51 14,68 10,55 12,04 10,48 1,59 0,3242 mangan (Mn) 0,46 –1,26 2,60 –1,41 –0,84 1,82 0,5193 baker (Cu) 25,82a 23,17ab 20,33ab 27,23a 13,82b 2,53 0,0074 Energija energija 76,32a 72,98bc 70,10d 74,51ab 72,01cd 0,56 < 0,0001 AMEn2 (MJ/kg SS) 13,90a 13,49ab 13,02c 13,74ab 13,38bc 0,10 < 0,0001 1SEM – standardna napaka srednje vrednosti abc – skupine, označene z različnimi črkami, se med seboj razlikujejo (p ≤ 0,05). 2AMEn – navidezna presnovljiva energija, korigirana na ničelno nalaganje dušika. Obrazec ARRS-RPROJ-CRP-HRANA-VP-2014 Stran 20 od 42 Preglednica 10: Izkoristljivost hranil in energije iz oljčnih listov in tropin (diferenčna metoda) pri pitovnih piščancih (v % oz. MJ ME/kg SS). OLi 50 OLi 100 OTr 50 OTr 100 SEM1 p Hranilne snovi suha snov 8,22a 17,73ab 38,61b 32,19ab 7,22 0,0281 organska snov 10,01a 19,19ab 40,78b 33,90ab 7,13 0,0237 surove beljakovine 31,75ab –1,66b 48,95a –5,70b 0,45 0,0070 surove maščobe 85,20 68,89 104,47 100,00 17,46 0,4846 surova vlaknina –5,87 2,33 –0,53 12,02 6,26 0,2579 NDV 45,72a 29,64a –9,49b 19,61ab 8,18 0,0008 KDV 6,98 1,02 –18,94 –13,5 7,23 0,0662 Energija AMEN-kor 5,777a 5,035a 12,566b 9,079ab 3,95 0,0139 1SEM – standardna napaka srednje vrednosti. abc – skupine, označene z različnimi črkami, se med seboj razlikujejo (p ≤ 0,05). Pri prirastu, začetni in končni masi piščancev v bilančnem poskusu nismo ugotovili statistično značilnih razlik. Treba pa je poudariti, da so bili piščancem listi in tropine v krmo dodani po 21. dnevu starosti, ko so prebavila že bolj razvita, in da je bilančni poskus potekal le devet dni, zato bi bilo treba izvesti dodaten pitovni poskus. Nekateri avtorji, ki so poročali o negativnih vplivih stranskih proizvodov oljkarstva na proizvodne značilnosti piščancev (Shafey in sod., 2013), te pripisujejo višjemu deležu vlaknine v krmi, kar poslabša njeno izkoriščanje predvsem v prvi fazi pitanja, pozneje pa lahko živali zaradi bolj razvitih prebavil bolje izkoriščajo krmo, tudi če ta vsebuje višje deleže vlaknine. Ugotovili smo, da pri živali, ki so dobivale krmne mešanice z dodatkom oljčnih listov in tropin, v primerjavi s kontrolno skupino ni bilo negativnih vplivov na izkoriščanje surove vlaknine, surovega pepela in mineralov (razen bakra). Živali, ki so dobivale krmne mešanice z dodatkom oljčnih listov, so v obeh dodanih koncentracijah slabše izkoriščale suho in organsko snov, v višji koncentraciji pa tudi surove beljakovine. Živali, ki smo jih krmili s krmnimi mešanicami z dodatkom oljčnih tropin, so pri višji koncentraciji dodatka slabše izkoriščale suho in organsko snov ter surove beljakovine. Živali, ki smo jih krmili s krmno mešanico z dodatkom oljčnih tropin, so bolje izkoriščale maščobe, kar je posledica spremenjene maščobnokislinske sestave krme. Znano je, da se absorpcija nasičenih maščobnih kislin (SFA) ob prisotnosti nenasičenih maščobnih kislin v prebavilih izboljša, saj se SFA v tem primeru učinkoviteje vgrajujejo v micele. Dodajanje oljčnih listov v obeh koncentracijah in tropin v višji koncentraciji v krmne mešanice zmanjša izkoristljivost energije. Z diferenčno metodo smo ovrednotili vpliv obeh dodatkov, oljčnih listov in tropin na izkoristljivost nekaterih hranilnih snovi in energije. Ugotovili smo, da se iz oljčnih listov izkoristi le manjši delež suhe in organske snovi ter surovih beljakovin, pri višji koncentraciji listov pa se izkoristljivosti hranilnih snovi pogosto zmanjšujejo. Izkoristljivost maščob in oljčnih tropin je visoka, z naraščanjem koncentracije pa se poslabšuje izkoristljivost suhe in organske snovi ter surovih beljakovin. Energijska in hranilna vrednost listov pri pitovnih piščancih je majhna, saj vsebujejo pri 5-odstotni koncentraciji v krmni mešanici le 5,8 MJ ME/kg SS (podobno kot slama), ki pa se pri 10-odstotni koncentraciji zmanjša za okoli 15 %. Energijska vrednost oljčnih tropin pri pitovnih piščancih je bistveno boljša, saj vsebujejo pri 5-odstotni koncentraciji v krmni mešanici 12,6 MJ ME/kg SS, ki pa se pri 10-odstotni koncentraciji zmanjša za okoli 18 % na 9,1 MJ ME/kg SS. Zaradi tako velike energijske vrednosti so tropine pri pitovnih piščancih bistveno bolj uporabne, predvsem v manjših koncentracijah, saj večje koncentracije očitno negativno vplivajo na izkoristljivost hranil (razen maščob) in energije celotnega obroka. 2. Pujski V bilančni poskus smo vključili 24 rastočih prašičev (tekačev) s povprečno telesno maso 11,00 ± 0,10 kg, ki smo jih vhlevili individualno v metabolne kletke, ki omogočajo spremljanje uživanja krme ter ločeno zbiranje blata in urina. Živali smo razdelili v tri skupine, kontrolno skupino (KONT), ki ni Obrazec ARRS-RPROJ-CRP-HRANA-VP-2014 Stran 21 od 42 dobivala dodatka, in skupini, ki smo jima v krmo primešali 7,5 % oljčnih listov (OLi) ali oljčnih tropin (OTr). Živali smo krmili restriktivno (2,5-kratno kritje vzdrževalnih potreb po energiji). Krmne mešanice smo sestavili po priporočilih NRC (2012), pri čemer smo zaradi merjenja izkoristljivosti za 20 % zmanjšali količino energije, prebavljivih beljakovin, aminokislin in mineralov. Z bilančnim poskusom (zbiranje blata in urina, pet dni) smo začeli po petdnevnem obdobju prilagajanja. V krmnih mešanicah in blatu smo analizirali suho snov, surove beljakovine, surove maščobe, v nevtralnem (NDV) in kislem (KDV) detergentu netopno vlaknino, minerale in bruto energijo. Prebavljivost hranilnih snovi (HS) navajamo kot odstotek absorbiranih hranil ((zaužita HS – izločena HS)/zaužita HS*100 %) iz krmnih mešanic (preglednica 11). Prebavljivost hranilnih snovi in energije oljčnih listov in tropin smo določili tudi z diferenčno metodo (preglednica 12). Preglednica 11: Vpliv oljčnih listov in tropin na prebavljivost (%) hranil, mineralov in energije pri pujskih. KONT OLi OTr SEM p Hranilne snovi suha snov 88,33a 83,71b 84,88b 1,383 < 0,001 organska snov 89,32a 84,71b 85,75b 1,341 < 0,001 surove beljakovine 84,65a 77,51b 78,53b 0,975 0,0001 surove maščobe 85,87a 79,49b 87,46a 0,735 < 0,0001 NDV 63,50a 59,61ab 55,77b 1,527 0,0077 KDV 50,40a 44,38ab 37,60b 2,288 0,0033 surovi pepel 66,57 62,74 65,51 1,222 0,0980 Minerali kalcij (Ca) 44,85 42,69 48,99 1,985 0,0903 fosfor (P) 61,76 56,96 61,65 1,575 0,0673 magnezij (Mg) 42,29 33,41 42,80 2,694 0,0359 železo (Fe) 30,73 25,70 33,78 2,762 0,1282 cink (Zn) 37,41 29,66 35,08 2,494 0,1039 mangan (Mn) 18,06 14,99 17,66 2,894 0,7172 baker (Cu) 47,11a 27,43b 26,53b 2,442 < 0,0001 Energija energija 87,31a 81,56b 83,24b 1,605 < 0,001 Preglednica 12: Prebavljivost (%) hranil in energije iz oljčnih listov in tropin ter njihova energijska vrednost (diferenčna metoda) pri pujskih in metabolna energija (MJ/kg). Listi Tropine Suha snov 28,6 ± 20,3 45,3 ± 18,6 Organska snov 28,4 ± 20,1 45,0 ± 18,7 Surove beljakovine –103,1 ± 79,7 –135,2 ± 112,8 Surove maščobe –10,2 ± 49,2 91,4 ± 12,0 Bruto energija 23,6 ± 19,9 45,6 ± 18,5 Prebavljiva energija (MJ/kg SS) 4,78 ± 4,0 10,1 ± 4,1 1SEM – standardna napaka srednje vrednosti. abc – skupine, označene z različnimi črkami, se med seboj razlikujejo (p ≤ 0,05). Pujski, ki smo jim v krmne mešanice dodali oljčne liste, so v primerjavi s kontrolno skupino slabše prebavljali suho in organsko snov, surove beljakovine in surove maščobe. Krmne mešanice z dodatkom Obrazec ARRS-RPROJ-CRP-HRANA-VP-2014 Stran 22 od 42 oljčnih listov niso vplivale na prebavljivost mineralov (razen bakra). Krmljenje z mešanico z dodatkom oljčnih listov je poslabšalo prebavljivost energije. Pujski, ki smo jim v krmne mešanice dodali oljčne tropine, so v primerjavi s kontrolno skupino slabše prebavljali suho in organsko snov, surove beljakovine, v nevtralnem in kislem detergentu netopno vlaknino, ni pa bilo vpliva na prebavljivost surovih maščob in večine mineralov. Prebavljivosti hranilnih snovi so pri tropinah pričakovano višje v primerjavi z oljčnimi listi. Oljčni listi in tropine izrazito negativno vplivajo na prebavljivost beljakovin. Medtem ko so maščobe iz oljčnih listov zelo slabo prebavljive, za oljčne tropine velja ravno nasprotno . Nenasičene maščobne kisline, ki jih vsebuje olje v tropinah, se zelo učinkovito prebavijo. Ugotovimo lahko tudi, da je prebavljivost energije iz tropin boljša v primerjavi z listi. Meritve vsebnosti prebavljive energije (PE) pri pujskih kažejo, da je energijska vrednost listov za pujske nizka, saj vsebujejo le okoli 4,8 MJ PE/kg SS, energijska vrednost tropin pa je okoli 10 MJ PE/kg SS. Vsaj pri pujskih se listi z vidika krmljenja prašičev kot vir energije kažejo kot neuporabni, tropine pa bi v krmne mešanice lahko vključevali, toda le v majhnih količinah (nekaj %). Ker imajo pitanci drugačna, bolj razvita prebavila, je lahko uporabnost tropin, morda tudi listov, pri njih večja. Vendar bi bilo to potrebno proučiti. DS2.3 In vitro raziskave prehranske vrednosti za prežvekovalce In vitro navidezno in pravo razgradljivost suhe snovi (ivNRSS in ivPRSS) smo določili tako, da smo iz fistuliranih ovnov odvzeti vampov sok prefiltrirali skozi štiri pasti bombažne gaze in ga razredčili z raztopino pufra v razmerju 1: 2 (v/v). Okoli 300 mg zmletega substrata (obroki z dodatkom oljčnih listov ali tropin oz. obroki, v katerih je bil del obroka nadomeščen z oljčnimi listi in tropinami) smo zatehtali v filtrske vrečke ANKOM F57 (ANKOM Technology, Macedon, NY, ZDA) in jih toplotno zavarili. Za vsak substrat smo pripravili dve vrečki in jih vstavili v inkubacijsko posodo (dve vrečki/posodo). V vsako posodo smo vstavili 24 vrečk F57 (dve vrečki/substrat + dve prazni vrečki (slepi vzorec)) in dodali dva litra puferiranega vampovega soka, ki smo ga predhodno prepihovali z ogljikovim dioksidom. Posode smo vstavili v inkubator na 39 °C za 24 ur. V času inkubacije je bilo zagotovljeno mešanje puferiranega vampovega soka v inkubacijskih posodah. Po končani inkubaciji smo vrečke intenzivno sprali pod tekočo vodo, posušili na 103 °C, stehtali in izračunali ivNRSS. Vrečke smo v nadaljevanju tretirali še eno uro v raztopini nevtralnega detergenta pri 100 °C v aparaturi ANKOM220 fibre analyser (ANKOM Technology, Macedon, NY, ZDA), jih sprali v vodi, posušili in stehtali ter izračunali in vitro pravo razgradljivost suhe snovi (ivPRSS) in vitro razgradljivost v nevtralnem detergent netopne vlaknine (ivNDV). Inokulum za izvedbo plinskega testa smo pripravili na enak način kot inokulum za določanje in vitro razgradljivosti in prebavljivosti. Okoli 200 mg substrata smo inkubirali v anaerobnih pogojih pri 39 °C v 100-mililitrskih steklenih brizgalkah, ki so vsebovale 30 ml puferiranega vampovega soka (inokuluma). Količino sproščenega plina smo odčitali po 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 36, 48, 72 in 96 urah. Po 24 urah smo tekočino dveh od štirih brizgalk prenesli v 50-mililitrske centrifugirne epruvete in jih do analize hlapnih maščobnih kislin (HMK) zamrznili na −20 °C. V vsaki seriji smo inkubirali tri brizgalke s slepim vzorcem (vsebovale so samo inokulum brez substrata) in tri brizgalke s standardnim vzorcem. Ekstrakte za analizo HMK smo pripravili iz puferiranega vampovega soka po 24 urah inkubacije po modificirani metodi Holdeman in sod. (1977). HMK smo določili s plinskim kromatografom Hewlett Packard 5890 A (Hewlett Packard, Bellefonte, Pensilvanija, ZDA), opremljenim s split/splitless injektorjem in FID-detektorjem. Za ločevanje HMK smo uporabili 30 m NUKOL TM, FUSED SILICA kapilarno kolono (SUPELCO, Bellefonte, Pensilvanija, ZDA). Dobljene rezultate ivNPRSS, ivPRSS in količine plina smo korigirali na 1 g suhe snovi substrata. Prostornine plina smo korigirali tudi na količino plina, sproščenega iz slepega vzorca. Kazalnike plinskega testa smo za vsak substrat ocenili s pomočjo Gompertzove enačbe (Lavrenčič in sod., 1997): Yt = B × exp(–C × exp(–D × t)), kjer je Yt količina sproščenega plina (ml/g DM) v času ‘t’, ‘B’ največja Obrazec ARRS-RPROJ-CRP-HRANA-VP-2014 Stran 23 od 42 količina sproščenega plina (skupna potencialna količina plina; (ml/g SS)); ‘C’ specifična hitrost sproščanja plina, na katero vpliva konstantni faktor ‘D’, s katerim opisujemo zmanjševanje specifične hitrosti sproščanja plina (ki je posledica zmanjševanja hitrosti rasti mikroorganizmov in zmanjševanja količine fermentabilnega substrata) in ‘t’ čas v urah. Za oceno kazalnikov smo uporabili statistični paket SAS (PROC NLIN; SAS, 2015). Poleg kazalnikov produkcije plina smo izračunali tudi količine plina, sproščene po 24 urah inkubacije, s pomočjo prvega in drugega odvoda Gompertzove enačbe po času pa še največjo hitrost produkcije plina (MFR) in čas, v katerem je bila dosežena največja hitrost produkcije plina (TMFR; Lavrenčič in sod., 1997). Neto količino HMK, sproščeno v 24 urah inkubacije, smo izračunali tako, da smo od bruto količine posameznih HMK odšteli posamezne HMK, ki so se sprostile v tem času v slepem vzorcu. Dobljene količine smo nato korigirali na 1 g inkubirane suhe snovi substrata. Rezultate smo nato analizirali z one-way analizo variance s proceduro splošnega linearnega modela (GLM) statističnega paketa SAS/STAT različica 9.4 (SAS, 2015). Primerjali smo razlike med substrati. Rezultate predstavljamo kot povprečne vrednosti najmanjših kvadratov (least square means). Kot statistično značilne smo sprejeli razlike pri P ≤ 0,05, medtem ko smo kot trende obravnavali razlike pri 0,05 < P < 0,10. 1. Uporaba oljčnih listov in tropin kot dodatka v obroke za krave molznice – govedo V tem poskusu smo oljčne liste in tropine vključili v obrok kot dodatek. Pri tem smo ugotavljali, kakšen je vpliv dodatka oljčnih listov in tropin v primerih, da bi govedu s telesno maso 650 kg v obrok (TMR) dodali še 25 g (L25 in T25), 50 (L50 in T50) oz. 100 g oljčnih listov in tropin dnevno (L100 in T100). Dobljeni rezultati so prikazani v preglednicah 13 in 14. Preglednica 13: In vitro navidezna (IVNRSS) in prava razgradljivost suhe snovi (IVPRSS) ter in vitro razgradljivost NDV (IVRNDV), TMR in TMR z dodanimi oljčnimi listi in tropinami v različnih koncentracijah. Substrat IVNRSS IVPRSS IVRNDV (g/kg SS) (g/kg SS) (ml/g DM) TMR 555 719 270 L25 547 724 283 L50 529 710 247 L100 581 734 310 T25 582 737 319 T50 555 719 270 T100 540 719 269 TMR = popoln krmni obrok za 30 kg mleka dnevno; L25 = dodatek listov v obrok (TMR) v količini 25 g/žival na dan; L50 = dodatek listov v obrok (TMR) v količini 50 g/žival na dan; L100 = dodatek listov v obrok (TMR) v količini 100 g/žival na dan; T25 = dodatek tropin v obrok (TMR) v količini 50 g/žival na dan; T50 = dodatek tropin v obrok (TMR) v količini 25 g/žival na dan; T100 = dodatek tropin v obrok (TMR) v količini 100 g/žival na dan. Dodatek oljčnih listov in tropin v količinah od 25 do 100 g na žival na dan ne vpliva na razgradljivost in prebavljivost suhe snovi in razgradljivost NDV. Obrazec ARRS-RPROJ-CRP-HRANA-VP-2014 Stran 24 od 42 Preglednica 14: Ocenjeni kazalniki in vitro produkcije plina, nastalega ob inkubaciji TMR in TMR z dodatkom oljčnih listov in tropin v različnih koncentracijah. Substrat B‡ C‡ D‡ (ml/g DM) TMR 307 2,36b 0,144 L25 303 2,65a 0,152 L50 303 2,53ab 0,143 L100 318 2,53ab 0,143 T25 299 2,54ab 0,148 T50 290 2,57ab 0,157 T100 311 2,54ab 0,145 ‡B = skupna potencialna produkcija plina; C = specifična hitrost produkcije plina, na katero vpliva čas (t), in konstantni faktor D (zmanjšanje specifične hitrosti sproščanja plina, ki je posledica zmanjšanja hitrosti rasti mikroorganizmov in zmanjšanja količine fermentabilnega substrata). TMR = popoln krmni obrok za 30 kg mleka dnevno; L25 = dodatek listov v obrok (TMR) v količini 25 g/žival na dan; L50 = dodatek listov v obrok (TMR) v količini 50 g/žival na dan; L100 = dodatek listov v obrok (TMR) v količini 100 g/žival na dan; T25 = dodatek tropin v obrok (TMR) v količini 50 g/žival na dan; T50 = dodatek tropin v obrok (TMR) v količini 25 g/žival na dan; T100 = dodatek tropin v obrok (TMR) v količini 100 g/žival na dan. Preglednica 15: Izračunani kazalniki in vitro produkcije plina, nastalega ob inkubaciji TMR in TMR z dodatkom oljčnih listov in tropin v različnih koncentracijah. Substrat TMFR‡ MFR‡ Gas24‡ (h) (ml/h) (ml/g DM) TMR 6,01 16,27 284 L25 6,42 16,94 282 L50 6,48 16,28 279 L100 6,51 16,75 293 T25 6,29 16,29 277 T50 6,25 16,65 269 T100 6,49 16,54 286 ‡ TMFR = čas, v katerem je hitrost fermentacije največja; MFR = največja hitrost fermentacije; Gas24 = količina plina, nastala po 24 urah fermentacije. TMR = popoln krmni obrok za 30 kg mleka dnevno; L25 = dodatek listov v obrok (TMR) v količini 25 g/žival na dan; L50 = dodatek listov v obrok (TMR) v količini 50 g/žival na dan; L100 = dodatek listov v obrok (TMR) v količini 100 g/žival na dan; T25 = dodatek tropin v obrok (TMR) v količini 50 g/žival na dan; T50 = dodatek tropin v obrok (TMR) v količini 25 g/žival na dan; T100 = dodatek tropin v obrok (TMR) v količini 100 g/žival na dan. Iz rezultatov, prikazanih v preglednicah 14 in 15, lahko ugotovimo, da dodatek 25, 50 in 100 g oljčnih listov in tropin v obrok za govedo s telesno maso 650 kg ne vpliva na ocenjene in izračunane kazalnike fermentacije v predželodcih prežvekovalcev. Ugotovili smo, da se kazalnika »C« TMR (kontrola) in L25 razlikujeta, vendar menimo, da je do tega prišlo naključno, razlika pa nima večjega vpliva na potek sproščanja plina (slika 5). Obrazec ARRS-RPROJ-CRP-HRANA-VP-2014 Stran 25 od 42 Slika 5: Potek sproščanja plina ob fermentaciji substratov z dodatnimi oljčnimi listi in tropinami. Preglednica 16: Sproščanje hlapnih maščobnih kislin (HMK) in njihovi deleži, nastali po 24 urah inkubacije TMR in TMR z dodanimi oljčnimi listi in tropinami v različnih koncentracijah. Substrat HMK Ocetna kislina Propionska kislina Maslena kislina (mmol/g SS) (mol/mol HMK) (mol/mol HMK) (mol/mol HMK) TMR 11,29 0,786a 0,107b 0,090 L25 11,66 0,773ab 0,112ab 0,096 L50 10,88 0,755b 0,124ab 0,102 L100 11,81 0,767ab 0,118ab 0,097 T25 9,74 0,761ab 0,120ab 0,100 T50 9,06 0,760ab 0,124ab 0,100 T100 9,88 0,759ab 0,129a 0,097 TMR = popoln krmni obrok za 30 kg mleka dnevno; L25 = dodatek listov v obrok (TMR) v količini 25 g/žival na dan; L50 = dodatek listov v obrok (TMR) v količini 50 g/žival na dan; L100 = dodatek listov v obrok (TMR) v količini 100 g/žival na dan; T25 = dodatek tropin v obrok (TMR) v količini 50 g/žival na dan; T50 = dodatek tropin v obrok (TMR) v količini 25 g/žival na dan; T100 = dodatek tropin v obrok (TMR) v količini 100 g/žival na dan. Dodatek oljčnih listov in tropin ne vpliva (P > 0,05) na sintezo HMK, čeprav so količine, sproščene iz substratov s tropinami, numerično nekoliko manjše. Opazili smo, da so razlike v deležu ocetne in propionske kisline razlikujejo (P < 0,05) med TMR in L50 oz. med TMR in T100, vendar menimo, da je do tega prišlo naključno ter da ne gre za sistematski vpliv dodatka oljčnih listov in tropin. 2. Uporaba oljčnih listov in tropin kot sestavin obroka za krave molznice – govedo V tem delu raziskave smo poskušali ugotoviti, kako se spremenita prebavljivost in fermentabilnost obroka (TMR), če ga v določenem deležu nadomestimo z oljčnimi listi in tropinami. Obrazec ARRS-RPROJ-CRP-HRANA-VP-2014 Stran 26 od 42 Preglednica 17: In vitro navidezna (IVNRSS) in prava razgradljivost suhe snovi (IVPRSS) ter in vitro razgradljivost NDV (IVRNDV) TMR in TMR, kjer je z oljčnimi listi in tropinami nadomeščen del TMR. Substrat IVNRSS IVPRSS IVRNDV (g/kg SS) (g/kg SS) (ml/g DM) TMR 721a 856b 625ab L5 % 657bcd 898a 514bcd L10 % 646d 890a 368efg L25 % 654cd 799c 493cd L50 % 596e 756d 401def L75 % 522fg 708ef 302fgh L100 % 466h 674f 239hi P5 % 654cd 893a 476cde P10 % 688abcd 903a 508cd P25 % 666bcd 804c 515bcd P50 % 555ef 732de 367efg P75 % 476gh 685f 286gh P100 % 384i 609g 151i TMR = popoln krmni obrok za 30 kg mleka dnevno; L5 % = 5 % listov v obroku (TMR); L10 % = 10 % listov v obroku (TMR); L25 % = 25 % listov v obroku (TMR); L50 % = 50 % listov v obroku (TMR); L75 % = 75 % listov v obroku (TMR); L100 % = 100 % listov v obroku (TMR); T5 % = 5 % tropin v obroku (TMR); T10 % = 10 % tropin v obroku (TMR); T25 % = 25 % tropin v obroku (TMR); T50 % = 50 % tropin v obroku (TMR); T75 % = 75 % tropin v obroku (TMR); T100 % = 100 % tropin v obroku (TMR). Rezultati (preglednica 18) kažejo, da nadomestitev 25 % obroka z oljčnimi listi in tropinami ne vpliva na in vitro navidezno in pravo razgradljivost suhe snovi ter in vitro razgradljivost NDV. Še pri večji koncentraciji oljčnih listov in tropin v obroku (TMR) se začnejo prebavljivosti in razgradljivost linearno zmanjševati. Obrazec ARRS-RPROJ-CRP-HRANA-VP-2014 Stran 27 od 42 Preglednica 18: Ocenjeni kazalniki in vitro produkcije plina, nastalega ob inkubaciji TMR in TMR, kjer je z oljčnimi listi in tropinami nadomeščen del TMR. Substrat B‡ C‡ D‡ (ml/g DM) TMR 291abc 2,38dfe 0,149cde L5 % 300ab 2,55c 0,115de L10 % 301ab 2,75ab 0,114e L25 % 256bcd 2,34gfe 0,137de L50 % 239cde 2,18ih 0,122de L75 % 198ef 2,08i 0,120de L100 % 169gf 2,07i 0,115de T5 % 310a 2,61bc 0,113e T10 % 290abc 2,84a 0,137de T25 % 252bcd 2,21gih 0,142de T50 % 176gf 2,35gfe 0,201ab T75 % 136g 2,29gfh 0,192abc T100 % 86h 2,28gfh 0,230a ‡B = skupna potencialna produkcija plina; C = specifična hitrost produkcije plina, na katero vpliva čas (t), in konstantni faktor D (zmanjšanje specifične hitrosti sproščanja plina, ki je posledica zmanjšanja hitrosti rasti mikroorganizmov in zmanjšanja količine fermentabilnega substrata). TMR, L5 %, L10 %, L25 %, L50 %, L75 %, L100 %, T5 %, T10 %, T25 %, T50 %, T75 %, T100 % = glej razlago pri preglednici 13. Preglednica 19: Izračunani kazalniki in vitro produkcije plina, nastalega ob inkubaciji TMR in TMR, kjer je z oljčnimi listi in tropinami nadomeščen del TMR. Substrat TMFR‡ MFR‡ Gas24‡ (h) (ml/h) (ml/g DM) TMR 5,79cd 15,99a 272a L5 % 8,41a 12,61bcd 252abc L10 % 8,86a 12,61bcd 252abc L25 % 6,18bc 12,95bc 235bcde L50 % 6,35bc 10,75de 213e L75 % 6,12c 8,74fg 176f L100 % 6,30bc 7,20g 149gh P5 % 8,52a 12,86bc 260ab P10 % 7,96ab 13,98b 251abc P25 % 5,69cd 13,00bc 232cde P50 % 4,34de 12,88bc 171fg P75 % 4,31de 9,60ef 133h P100 % 3,63e 7,29g 86i ‡TMFR = čas, ko je hitrost fermentacije največja; MFR = največja hitrost fermentacije; Gas24 = količina plina, nastala po 24 urah fermentacije. TMR, L5 %, L10 %, L25 %, L50 %, L75 %, L100 %, T5 %, T10 %, T25 %, T50 %, T75 %, T100 % = glej razlago pri preglednici 13. Obrazec ARRS-RPROJ-CRP-HRANA-VP-2014 Stran 28 od 42 Podobno kot smo ugotovili za IVNRSS, IVPRSS in IVRNDV (preglednica 20), velja tudi za sproščanje plina med fermentacijo v pogojih vampa. Šele količina oljčnih listov in tropin, s katero nadomestimo več kot 25 % obroka, statistično značilno vpliva na ocenjene in izračunane kazalnike in vitro fermentacije v vampu. Preglednica 20: Sproščanje kratkoverižnih maščobnih kislin (HMK) in njihovi deleži, nastali ob inkubaciji TMR in TMR, kjer je z oljčnimi listi in tropinami nadomeščen del TMR. Substrat HMK Ocetna kislina Propionska kislina Maslena kislina (mmol/g SS) (mol/mol HMK) (mol/mol HMK) (mol/mol HMK) TMR 9,95ab 0,790bcd 0,111a 0,090bc L5 % 9,57ab 0,761de 0,107abc 0,115ab L10 % 8,42ab 0,760de 0,101abcd 0,126a L25 % 5,67bc 0,910a 0,066e 0,022de L50 % 3,33cd 0,893a 0,073e 0,033d L75 % / / / / L100 % / / / / P5 % 9,09ab 0,763de 0,106abcd 0,114ab P10 % 9,65ab 0,772cde 0,100abcd 0,115ab P25 % 10,59a 0,873b 0,095d 0,072c P50 % 8,61ab 0,873b 0,097cd 0,071c P75 % 5,80bc 0,807bc 0,107abc 0,081c P100 % 1,75c 0,901a 0,096cd 0,003e ‡ B = skupna potencialna produkcija plina; C = specifična hitrost produkcije plina, na katero vpliva čas (t), in konstantni faktor D (zmanjšanje specifične hitrosti produkcije plina). TMR, L5 %, L10 %, L25 %, L50 %, L75 %, L100 %, T5 %, T10 %, T25 %, T50 %, T75 %, T100 % = glej razlago pri preglednici 13. Tudi za sintezo HMK velja, da nanjo vplivajo predvsem količine oljčnih listov in tropin, s katerimi nadomestimo več kot 25 % obroka (TMR). Če je obrok sestavljen samo iz oljčnih listov (L100 %) ali je teh v obroku 75 % (L75 %), smo ugotovili, da listi popolnoma onemogočijo tvorbo HMK, saj so bile korigirane količine nastalih HMK negativne. DS2.4 Ocena možnosti uporabe oljčnih listov in tropin za siliranje 1. Oljčni listi in tropine kot silirni dodatki – travna silaža, pripravljena z dodatkom oljčnih listov in tropin Travno silažo smo pripravili iz trave naravnega travnika. Travo smo pokosili jeseni (oktobra) in jo takoj po prevozu v laboratorij silirali v pilotne silose (kozarci prostornine 2,5 litra), jih ustrezno potlačili in pustili na sobni temperaturi okoli 30 dni. Po 30 dneh smo kozarce odprli, odstranili zgornjo plast (okoli 3 cm), vsebino pa pretresli na pladnje, na katerih smo jo najprej premešali, nato pa odvzeli del vzorca za določanje pH, HMK, amonijaka in maščobnih kislin. Preostali del vzorca smo posušili in uporabili za določanje kemijske sestave silaž. Obrazec ARRS-RPROJ-CRP-HRANA-VP-2014 Stran 29 od 42 Preglednica 21: Kemijska sestava silaž (g/kg SS), pripravljenih z dodatkom oljčnih listov in tropin. TS TS + oljčni listi TS + oljčne tropine (kontrola) 10 g/kg 40 g/kg 10 g/kg 40 g/kg SS (g/kg) 283 292 305 298 312 SB 186 183 177 180 173 SM 36 36 36 39 50 SV 230 237 224 234 231 SP 148 138 133 135 143 BDI 400 406 429 412 402 NDV 417 399 406 400 412 TS = travna silaža. SS = suha snov; SB = surove beljakovine; SM = surova maščoba; SV = surova vlaknina; SP = surovi pepel; BDI = brezdušični izvleček; NDV = vlaknina, netopna v nevtralnem detergentu. Kemijska sestava silaž se ni bistveno razlikovala od kontrole (preglednica 22). Nekoliko večja vsebnost suhe snovi v silažah z dodatkom listov in tropin je posledica večje vsebnosti suhe snovi v listih in tropinah, kakor je tudi manjša vsebnost SB posledica majhne vsebnosti SB v oljčnih listih in tropinah. Dodatek tropin poveča vsebnost SM v silažah. Preglednica 22: Vsebnost hlapnih maščobnih kislin in amonijaka (g/kg SS), pH-vrednosti in peroksidno število v silažah, pripravljenih z dodatkom oljčnih listov in tropin. TS TS + oljčni listi TS + oljčne tropine (kontrola) 10 g/kg 40 g/kg 10 g/kg 40 g/kg Ocetna kislina 9,12 9,13 8,68 9,38 13,24 Propionska kislina 1,52 0,85 0,48 0,56 0,86 Maslena kislina 34,23 22,54 19,91 13,78 16,52 Amonijak 1,90 1,58 1,39 1,38 1,56 pH 4,6 4,6 4,6 4,4 4,4 Peroksidno število 6,99 1,60 1,93 3,31 1,19 TS = travna silaža. Siliranje neovele trave z dodatkom oljčnih listov ni imelo velike vpliva na pH-vrednost silaž. Vsebnost ocetne kisline se je ob uporabi oljčnih listov zmanjšala, ob dodatku tropin pa povečala. Oba dodatka pa sta zmanjšala vsebnosti propionske in maslene kisline ter vsebnost amonijaka, iz česar bi lahko sklepali, da oljčni listi in tropine zmanjšajo delovanje saharolitičnih in proteolitičnih klostridijev ter drugih v silažah nezaželenih mikroorganizmov. Ob dodatku listov in tropin se je zmanjšalo tudi peroksidno število, kar pomeni da je bila krma (silaža) v tem primeru manj podvržena oksidaciji. Obrazec ARRS-RPROJ-CRP-HRANA-VP-2014 Stran 30 od 42 Preglednica 23: Maščobnokislinska sestava silaž (g/kg SS silaže), pripravljenih z dodatkom oljčnih listov in tropin. TS TS + oljčni listi TS + oljčne tropine (kontrola) 10 g/kg 40 g/kg 10 g/kg 40 g/kg C16:0 4,57 4,67 4,66 4,73 5,86 ƩC16:1 2,17 2,16 2,02 2,02 1,97 C18:0 0,45 0,46 0,46 0,53 0,83 ƩC18:1 0,82 1,01 1,27 4,13 12,90 C18:2 n-6 4,29 4,30 4,28 4,20 4,81 C18:3 n-3 12,51 12,18 12,30 11,61 10,27 C20:0 0,31 0,31 0,28 0,37 0,34 C22:0 0,52 0,56 0,49 0,55 0,48 C23:0 0,10 0,11 0,10 0,09 0,09 C24:0 0,38 0,41 0,38 0,47 0,42 SFA 8,88 8,78 8,59 8,93 9,90 MUFA 3,20 3,40 3,48 6,38 15,17 PUFA 16,89 16,63 16,69 15,95 15,16 n-6 PUFA 4,29 4,34 4,28 4,25 4,82 n-3 PUFA 12,54 12,21 12,33 11,64 10,28 n-6/n-3 PUFA 0,34 0,36 0,35 0,37 0,47 TS = travna silaža. SS = suha snov; SB = surove beljakovine; SM = surova maščoba; SV = surova vlaknina; SP = surovi pepel; BDI = brezdušični izvleček; NDV = vlaknina, netopna v nevtralnem detergentu. Dodatek tropin poveča vsebnost SM v silažah. Z uporabo oljčnih tropin se močno poveča vsebnost oleinske kisline, medtem ko se vsebnost linolenske kisline nekoliko zmanjša, zaradi česar se nekoliko razširi razmerje med n-6- in n-3-maščobnimi kislinami. Dodatka oljčnih listov in tropin nista imela drugih večjih vplivov na kakovost travne silaže. 1. Priporočila za uporabo oljčnih listov in tropin kot silirnih dodatkov Za postavitev priporočil o uporabi oljčnih listov in tropin kot silirnih dodatkov bi morali opraviti še dodatne raziskave o vplivih teh dveh dodatkov na vsebnost mlečne kisline. Do trdnejših ugotovitev bi prišli tudi tako, da bi siliranje ponovili in ali potrdili ali ovrgli dobljene rezultate. Vendar pa naši rezultati kažejo, da bi bili oljčni listi in tropine primerni za uporabo pri siliranju v omenjenih količinah. Primerni bi bili predvsem, če bi želeli zmanjšati oksidacijo maščobnih kislin oz. če bi želeli preprečiti klostridijsko kvarjenje silaž. Obrazec ARRS-RPROJ-CRP-HRANA-VP-2014 Stran 31 od 42 Literatura: Heuze, V., Tran, G., Gomez Cabarera, A., Lebas, F., 2015: Olive oil cake and by-products. Feedipedia, a programme by INRA, CIRAD, AFZ and FAO. http.//www.feedipedia.org/node/32.Last updated on may 11, 2015, 14:32 (dostop: 18. 2. 2016). Joven, M., Pintos, E., Lattore, M. A., Suarez-Belloch, J., Guada, J. A., Fondevila, M., 2008: Effect of replacing barley by increasing levels of olive cake in the diet of finishing pigs: Growth performances, digestibility, carcass, meat and fat quality. Animal Feed Science and Technology. 197: 185–193. Molina-Alcaide, E., Yáñez-Ruiz, D. R., 2008: Potential use of olive by-products in ruminant feeding: A review. Animal Feed Science and technology. 147: 247–264. Paiva-Martins, F., Barbosa, S., Pinheiro, V., Mourao, H. L., Outor-Monteiro, D., 2008: The effect of olive leaves supplementation on the feed digestibility, growth performances of pigs and quality of pork meat. Meta Science. 82: 438–443. Rabayaa, E., Abo Omar, J. M., Othman, R. A., 2001: Utilization of olive pulp in broiler rations. An-Najah University Journal for Research. 15: 133–144. Obrazec ARRS-RPROJ-CRP-HRANA-VP-2014 Stran 32 od 42 DS3 PRIPRAVA EKSTRAKTOV, BOGATIH S FENOLNIMI SPOJINAMI, ZA PRIPRAVO PREHRANSKIH DOPOLNIL DS3.1 Pregled in sinteza dosedanjih znanih podatkov in raziskav Na svetovnem trgu se tržijo prehranska dopolnila iz ekstraktov oljčnih listov, ki pa se razlikujejo v vsebnosti ključne fenolne spojine, olevropeina in drugih dodanih učinkovin v prehranskem dopolnilu. Prehranska dopolnila v obliki kapsul vsebujejo po navadi 6, 10, 18 ali 20 % olevropeina/kapsulo, v kateri je vsebnost ekstrakta iz oljčnih listov različna, od 500 do 750 mg. Prodajana prehranska dopolnila z ekstraktom oljčnih listov vsebujejo poleg ekstrakta iz oljčnih listov po navadi še deklarirane spojine, kot so celuloza, magnezijev stearat in silika. Nekatera prehranska dopolnila vsebujejo še ameriški slamnik in selen. Prehranska dopolnila z ekstraktom oljčnih listov se po navadi reklamirajo kot prehranska dopolnila z veliko vsebnostjo antioksidantov ter protibakterijskim, protimikotičnim in protivirusnim učinkovanjem. Druga prodajna oblika ekstrakta oljčnih listov je v obliki tinkture, ki je pripravljena s 65-odstotnim alkoholom oz. je razmerje suhega ekstrakta oljčnih listov in alkohola 1 : 3. Prodajajo se lahko v 30-mililitrskih temnih dozirnih stekleničkah in imajo rok uporabe dve let. Natančnejša sestava tinktur ni navedena. Oljčni listi so lahko poceni vir za zelo pomembno polifenolno spojino olevropein, za katerega vse več znanstvenih raziskav potrjuje, da ima antioksidativne, protivnetne, protimikrobne, hipoglikemične in protivirusne učinke ter druge pozitivne učinke na zdravje človeka (Omar, 2010). Leta 2019 je bila objavljena raziskava o pozitivnem vplivu olevropeina iz ekstrakta oljčnih listov na sistemski eritematozni lupus, kronično avtoimunsko bolezen vezivnega tkiva, ki lahko prizadene različne celice, tkiva in organe (Castejon in sod., 2019). Na primeru miši so je bilo dokazano, da so testni primerki, ki so uživali olevropein kot dodatek k prehrani z veliko vsebnostjo maščob, precej manj pridobili na teži kot kontrolni primerki, ki so uživali le prehrano z visoko vsebnostjo maščob (van der Stelt in sod., 2015). Uporaba ekstrakta oljčnih listov v živilih pa je še vedno na raziskovalni ravni. Največ raziskav vključuje razvoj inovativnih filmov z vsebnostjo ekstraktov oljčnih listov za pakiranje živil (Licciardello et al. 2015, Moudache et al., 2016, Moudache et al., 2017), metode za kapsulacijo ekstrakta oljčnih listov z namenom vključevanja kapsuliranega ekstrakta za daljšo obstojnost živila, večjo oksidativno stabilnost. DS3.2 Priprava in analiza etanolnih ekstraktov oljčnih listov in tropin Vsebnost fenolnih spojin v ekstraktih iz nerazmaščenih tropin se med letnikoma 2015 in 2016 ni bistveno razlikovala in je dosegla vrednost okoli 70 µg GA/mL. Vsebnost fenolnih spojin v ekstraktih iz razmaščenih tropin pa se je med letnikoma pomembno razlikovala in je bila pri letniku 2016 okoli 230 µg GA/mL večja kot pri letniku 2015. V obeh primerih je bila vsebnost fenolnih spojin, izražena kot ekvivalent galne kisline, le nekoliko večja v primerjavi z ekvivalentom kavne kisline. Čas ekstrakcije v UZ-kopeli ni bistveno vplival na učinkovitost ekstrakcije fenolnih snovi. Antioksidativni potencial je bil v ekstraktih iz razmaščenih tropin večji v primerjavi z ekstrakti iz nerazmaščenih tropin in je dosegal vrednosti okoli 125 µg GA/mL za letnik 2015 in 150 µg GA/mL za letnik 2016, pri ekstraktih iz nerazmaščenih vzorcev pa okoli 24 µg GA/mL za letnik 2015 in 35 µg GA/mL za letnik 2016. Čas ekstrakcije v UZ-kopeli ni bistveno vplival na učinkovitost ekstrakcije fenolnih snovi. Obrazec ARRS-RPROJ-CRP-HRANA-VP-2014 Stran 33 od 42 DS3.3 Kapsulacija s proliposomi in karakterizacija Proliposomi s kapsuliranim ekstraktom oljčnih listov so bili pripravljeni po metodi, ki jo opisujejo Perret in sod. (1991), in sicer z mešanico sojinega lecitina Phospholipon 90 G, etanola, ekstrakta oljčnih listov oz. čistega olevropeina in vode. Mešanica je vsebovala 0,5 mg/mL ekstrakta oljčnih listov oz. čistega olevropeina. Učinkovitost kapsulacije ekstrakta oljčnih listov je bila 83 %, v primeru kapsulacije čistega olevropeina pa 75 %. Rezultati testov stabilnosti pri različnih temperaturah in pH-vrednostih so pokazali, da je olevropein v obeh primerih v liposomih stabilen vsaj prvih 24 ur. Stabilnejši je olevropein v ekstraktu oljčnih listov kot čist olevropein v liposomih. Pri 25 °C in pH-vrednosti 2 se je v 24 urah sprostilo le 4,3 % olevropeina iz liposomov z ekstraktom iz oljčnih listov in 10,9 % olevropeina iz liposomov s čistim olevropeinom, pri 90 °C pa le 9,5 % iz liposomov z ekstraktom oljčnih listov in 28,8 % olevropeina iz liposomov s čistim olevropeinom. Glede na rezultate lahko sklepamo, da ima liposomski ovoj zaščitno vlogo pri preprečevanju hidrolize oz. zavira hidrolizo kapsuliranega olevropeina pri nizkih pH-vrednostih, ki so pomembne pri metabolizmu človeka. Iz tega lahko sklenemo, da bi bila proliposomska formulacija z ekstraktom oljčnih listov dovolj stabilna v želodčnem soku. DS3.4 Priprava alginatnih/hitozanskih kapsul in karakterizacija iz ekstrakta oljčnih listov Učinkovitost kapsulacije standardnega olevropeina ali olevropeina iz ekstrakta oljčnih listov je bila v alginatnih kapsulah zelo nizka, od 1,8 do 4,2 %. Da bi izboljšali učinkovitost kapsulacije, smo poleg parametrov mikrokapsulatorja preskušali tudi druge parametre, kot so koncentracija zamreževalne raztopine CaCl2 (2–10 %), pH-vrednost raztopine CaCl2 (2–6), vendar večje učinkovitosti nismo dosegli. Test stabilnosti alginatnih mikrokapsul z olevropeinom ali ekstraktom oljčnih listov pa je pokazal, da se je ves olevropein izločil iz mikrokapsul že v času testiranja. Kapsulacija čistega olevropeina ali ekstrakta iz oljčnih listov le v alginatne/hitozanske kapsule ni primerna, ker je učinkovitost kapsulacije zelo nizka, nestabilna in tako tudi neekonomična. DS3.5 Priprava ekstrakta za uporabo v živilskih izdelkih z metodo sušenja z razprševanjem V obdobju poročanja smo za pripravo novih funkcionalnih živil ponovno ovrednotili vsebnost olevropeina v zmletih oljčnih listih iz slovenske Istre, ki smo jih zbirali med projektom med letoma 2015 in 2016. Tokrat smo analizo nadgradili tudi z ovrednotenjem hidroksitirozola. V ta namen smo pripravili ekstrakte iz oljčnih listov, zbranih aprila 2015, maja 2016 in oktobra 2016. Za pripravo izdelkov z dodano vrednostjo smo izbrali tekoče jogurte proizvajalca Ljubljanske mlekarne z razponom vsebnosti maščob od 1,3 do 6,0 %. Za dodano vrednost smo izbrali dodatek v obliki zmletih oljčnih listov iz slovenske Istre, ki smo jih zbirali med projektom med letoma 2015 in 2016. Ves material za pripravo listov je bil že zmlet v fin prah. Ekstrakcija je bila izvedena po že objavljenem protokolu, v treh neodvisnih paralelkah, in ekstrakti so bili analizirani s HPLC-metodo. Vsebnost olevropeina je bila največja v ekstraktih iz listov iz aprila 2015 (37,2 ± 0,1 mg olevropeina/g suhih listov), nekoliko nižja je bila v ekstraktih iz listov iz oktobra 2016 (32,68 ± 0,08 mg olevropeina/g suhih listov) in najnižja v ekstraktih iz listov iz maja 2016 (20,42 ± 0,06 mg olevropeina/g suhih listov). Vrednosti hidroksitirozola pa so bile v obratnem sorazmerju s količino olevropeina. Najvišja vrednost je bila določena v ekstraktih z najnižjo vrednostjo olevropeina v razponu od 0,352 ± 0,004 do 0,837 ± 0,011 mg hidroksitirozola/g suhih listov. Obrazec ARRS-RPROJ-CRP-HRANA-VP-2014 Stran 34 od 42 Na osnovi vsebnosti olevropeina v ekstraktih smo se odločili, da bomo kot dodatek uporabili zmlet prah iz oljčnih listov iz aprila 2015. Za poskus smo izbrali tri dodatke zmletih oljčnih listov v vrednosti 0,5, 1 in 3 % neto mase tekočega/trdnega jogurta. Izbrali smo jogurte z različno vsebnostjo maščob (od 1,3 do 6,0 %). Jogurti so bili kupljeni v trgovini Ljubljanskih mlekarn in shranjeni v hladilniku do naslednjega dne. Ob odprtju smo dodali ustrezno količino zmletih oljčnih listov, pretresli in ocenili nekaj značilnosti. Izdelke je ocenjevala štiričlanska komisija. Vsak član je za izdelek dobil ocenjevalni list, na katerega je vnesel vrednosti ocenjenega izdelka. Ocenjevali smo videz, teksturo in okus. Značilnosti smo ocenjevali tudi z vrednostmi od 1 do 5, pri čemer je ocena 1 pomenila najnižjo vrednost in ocena 5 najvišjo vrednost. Člani komisije nismo akreditirani ocenjevalci in smo ocenjevali le s stališča potrošnika. Ocenjevalni listi so shranjeni v pisni obliki in dostopni za ogled. Štiričlanska komisija je od 18 pripravljenih izdelkov ocenila 18 izdelkov (glej preglednico 24). Neto masa izdelkov je bila 180, 250 in 500 g. Dodani zmleti oljčni listi v vseh izdelkih ustvarijo pridih lepe, od nežno zelene do intenzivnejše barve. Barve so naravne in prijetne. Dodani zmleti oljčni listi ne vplivajo na vonj jogurtov. Količina dodanih zmletih oljčnih listov vpliva na teksturo izdelka, ki pa ni moteča pri najnižji koncentraciji, pri višjih količinah pa je odvisno od vsebnosti maščob. Dodani zmleti oljčni listi najbolj vplivajo na okus jogurta. Ta je nekoliko grenek, vendar ni moteč ali pa se zakrije ob dodatku v 0,5 % oljčnih listov, pri dodatku 1 % je grenek priokus močnejši, vendar pri nekaterih jogurtih še sprejemljiv, pri dodatku 3 % oljčnih listov pa je grenek priokus zelo moteč, prevladujoč, predvsem v izdelkih z višjo vsebnostjo maščob (od 3,2 do 6,0 %), zato so bili ti izdelki tudi ocenjeni z najnižjo mogočo oceno, 0. Ocenjevalni rezultati so navedeni v preglednici 24. Preglednica 24: Ocenjevanje pripravljenih novih funkcionalnih izdelkov. vsebnost neto Ime izdelka maščob masa + 0,5 % listov na neto + 1 % listov na neto + 3 % listov na (%) (g) maso maso neto maso MU tekoči jogurt 1,3 1,3 500 4,5 4 3,75 4,1 3,75 2,75 3,5 2,6 1 MU KEFIR 1,5 1,5 250 4,7 4,4 4,25 4,2 4,2 4,1 4,1 3,1 1,5 MU jogurt, naravni brez laktoze 1,6 500 4,88 4,5 4.63 4,56 3,93 3,8 3,25 2,38 1,75 MU jogurt 3,2 3,2 500 4,5 4,2 4,55 4,05 4,08 3,98 0 0 0 Alpsko tekoči jogurt 4,0 500 4,55 4,58 4,58 4,18 4,08 3,5 0 0 0 Alpsko poln in kremast jogurt 6,0 180 4,67 4,33 4,67 4,17 3,5 3,5 0 0 0 Za nadaljnji razvoj so primerni vsi izdelki z 0,5-odstotnim dodatkom zmletih oljčnih listov, z 1-odstotnim dodatkom pa MU KEFIR, MU jogurt 3,2, in Alpsko tekoči jogurt 4,0. Za pripravo kapsuliranega olevropeina iz ekstrakta oljčnih listov z metodo sušenja z razprševanjem je bil uporabljen Nano Spray Dryer B-90 (Büchi). Za kapsulacijo z metodo z razprševanjem je bila uporabljena mešanica z 0,1-odstotno raztopino alginata in 0,5 mg/mL ekstrakta oljčnih listov v razmerju 1 : 1. Največja, 69,8-odstotna, učinkovitost kapsulacije olevropeina iz oljčnih listov v alginatne formulacije je bila dosežena v uri in 18 minutah razprševanja pri pretoku 13 L/min, tlaku 44 mbar in T glave 110 °C. Daljši čas razprševanja ni vplival na večjo učinkovitost kapsulacije. Mikroskopska SEM-analiza pridobljenih alginatnih formulacij s kapsuliranim ekstraktom oljčnih listov je pokazala, da je Obrazec ARRS-RPROJ-CRP-HRANA-VP-2014 Stran 35 od 42 velikost delcev zelo različna in v razponu od 200 nm do 10 µm, so nepravilnih oblik, medtem ko imajo prazni alginatni delci sferično obliko. Rezultati testov stabilnosti pri različnih T- in pH-vrednostih so pokazali, da se je v 24 urah pri 25 °C in pH-vrednosti 2 le 9 % olevropeina, pri 90 °C pa okoli 17 %. Iz rezultatov kapsuliranja ekstrakta oljčnih listov z metodo sušenja z razprševanjem lahko sklepamo, da je slabša učinkovitost kapsulacije olevropeina pri danih pogojih in nekoliko slabša stabilnost v primerjavi s kapsulacijo v proliposome. Za pripravo z večjimi kapacitetami pa bi priporočili uporabo robustnejšega tovrstnega instrumenta, kot je Mini Spray Dryer, ki bi bil tudi primernejši za kapsulacijo kompleksnejših matriksov oz. vzorcev. DS3.6 Testiranje stabilnosti ekstraktov v prehranskem dopolnilu Prehransko dopolnilo v obliki stisnjene tabletke je bilo pripravljeno iz zmletih suhih oljčnih listov in/ali z dodatkom maltodekstrina. Povprečna masa ene tabletke je 300 mg. Vse tabletke imajo premer 10 mm in so debele 4 mm. Vsebnost olevropeina v oljčnih listih je bila ponovno določena z ekstrakcijo in ovrednotena s HPLC-metodo. Vsebnosti olevropeina v prehranskih dopolnilih so navedene v preglednici 25. Preglednica 25: Vsebnosti olevropeina v prehranskih dopolnilih. Tabletke 300 mg iz zmletih suhih oljčnih z 20-odstotno vsebnostjo s 40-odstotno vsebnostjo listov maltodekstrina maltodekstrina Vsebnost olevropeina/300 mg 11,1 mg 8,9 mg 6,7 mg Prehransko dopolnilo je bilo pripravljeno v obliki tabletke tako, da smo zmlete suhe oljčne liste ali mešanico zmletih suhih oljčnih listov z 20- ali 40-odstotno vsebnostjo maltodekstrina stisnili z LFA-ročno tabletirko. Ugotovili smo, da se material pri stiskanju ne prijema na dele tabletirke, zato ni bilo treba dodajati Mg-stearata. Prav tako smo ugotovili, da se izbrane mešanice lepo stisnejo pri tabletiranju, zato ni bilo treba dodajati nobenih dodatkov za pripravo kompaktnih tabletk, kar je velika prednost. Test stabilnosti smo določili z merjenjem aktivnosti vode, aw-vrednosti, in vsebnosti olevropeina v tabletkah v treh mesecih. Vrednosti olevropeina se v tem času niso spremenile. Tabletke so bile v tem obdobju hranjene v zaprti plastični posodi v temnem prostoru pri temperaturi 22 ± 1 °C in 46 ± 1 % vlažnosti. Merjene aw-vrednosti so bile najvišje pri formulaciji iz samih oljčnih listov in so se v treh mesecih z 0,463 ± 0,001 povišale na 0,523 ± 0,012. Tabletkam z 20- in 40-odstotnim maltodekstrinom (MD) in oljčnimi listi pa so aw-vrednosti v tem obdobju padle, in sicer pri 20-odstotni vsebnosti MD z 0,4795 ± 0,0004 na 0,4467 ± 0,0004, pri 40-odstotni vrednosti MD pa z 0,4805 ± 0,0005 na 0,4383 ± 0,0004. Iz teh rezultatov lahko sklepamo, da formulacije, pripravljene le iz zmletih oljčnih listov, niso primerne. Stabilnost prehranskih dopolnil z olevropeinom iz oljčnih listov smo tudi testirali s testom trdnosti z instrumentom TA XT Plus Texture Analyser ter jih primerjali tudi z obstoječim prehranskim dopolnilom italijanskega proizvajalca in zdravilom Lekadol 500 mg. Iz rezultatov lahko sklepamo, da prehransko dopolnilo v obliki tabletk, pripravljeno samo iz zmletih listov in brez dodanega maltodekstrina, ni primerno, ker se razpoložljivost vode v treh mesecih poveča, kar pomeni, da je večja možnost za okužbo z mikroorganizmi. Primernejša je priprava prehranskega dopolnila v obliki tabletke z mešanico maltodekstrina in zmletih oljčnih listov, v katerem se razpoložljivost vode s časom zmanjša, s čimer se manjša tudi možnost okužbe z mikroorganizmi. Obrazec ARRS-RPROJ-CRP-HRANA-VP-2014 Stran 36 od 42 Literatura: Omar, Oleuropein in olive and its pharmacological effect. Scientia Pharmaceutica 78 (2010) 133–154. Inge van der Stelt in sod., Nutraceutical oleuropein supplementationprevents high fat diet-induced adiposity in mice. Journal of functional foods 14 (2015) 702–715. Castejon in sod., Dietary oleuropein and its new acyl-derivate, attenuate murine lupus nephritisthrough HO-1/Nrf2 activation and suppressing JAK/STAT, NF-κB,MAPK and NLRP3 inflammasomesignaling pathways. The journal of nutritional biochemistry, https://doi.org/10.1016/j.jnutbio.2019.108229. Moudache in sod., Phenolic content and antioxidant activity of olive by-products andantioxidant film containing olive leaf extract. Food Chemistry 212 (2016), 521–527. Moudache in sod., Antioxidant effect of an innovative active plastic film containing olive leaves extract on fresh pork meat and its evaluation by Raman spectroscopy. Food Chemistry 229 (2017), 98–103. Obrazec ARRS-RPROJ-CRP-HRANA-VP-2014 Stran 37 od 42 DS 4 IZDELAVA SMERNIC ZA TRAJNOSTNO UPORABO OSTANKOV PROIZVODNJE V OLJKARSTVU Glej publikacijo Maja Podgornik, Milena Bučar-Miklavčič, Alenka Levart, Janez Salobir, Vida Rezar, Nataša Poklar Ulrih, Mihaela Skrt, Bojan Butinar: SMERNICE ZA TRAJNOSTNO UPORABO OSTANKOV PROIZVODNJE V OLJKARSTVU. Koper: Annales ZRS, 2019. Obrazec ARRS-RPROJ-CRP-HRANA-VP-2014 Stran 38 od 42 DS 5 KOMUNIKACIJA IN DISEMINACIJA V okviru projekta CRP V4 -1621 smo sodelovali in izvedli te dejavnosti: • udeležba na 10 sestankih delovne skupine (23. 3. 2016, 14. 12. 2016, 20. 2. 2017, 21. 6. 2017, 6. 10. 2017, 9. 11. 2017, 12. 7. 2018, 14. 9. 2018, 18. 9. 2018, 11. 5. 2019); • organizacija petih sestankov z oljarji (6. 5. 2016, 3. 10. 2016, 10. 3. 2017, 18. 7. 2017, 26. 3. 2018, 19. 6. 2018); • udeležba na dveh sestankih za usklajevanja zakona o kmetijstvu (30. 5. 2019, 5. 6. 2019); • udeležba na štirih sestankih na medresorski ravni (MKGP, MOP) (20. 7. 2018, 14. 9. 2018, 18. 9. 2018, 1. 4. 2019); • izdelava osnutkov za Smernice za ravnanje z oljčnimi tropinami in rastlinsko vodo ter njihovo uporabo za gnojenje; • tri letna poročila o projektu CRP – ARRS (1. 1. 2017, 1. 1. 2018, 1. 1. 2019); • šest vmesnih poročil projekta CRP – MKGP (15. 11. 2016, 15. 3. 2017, 15. 9. 2017, 15. 3. 2018, 15. 9. 2018, 15. 3. 2019); • okrogla miza o oljčnih tropinah (20. 6. 2018), dostop do objav: https://www.primorske.si/2018/06/20/v-novi-stevilki-primorskih-novic-preberite, https://www.primorske.si/primorska/istra/bomo-po-oljcnem-olju-zascitili-tudi-tartuf, http://www.kmeckiglas.com/post/401223/o-tartufih-oljcnih-tropinah-in-namakanju-oljk; • organizacija mednarodnega znanstvenega in strokovnega posveta Možnost uporabe oljčnih tropin v luči krožnega gospodarstva (14. 2. 2019); • pripravljen dokument o uporabi oljčnih tropin kot sredstva za izboljšanje tal, dostop do objav: https://www.facebook.com/tvkoper/posts/10156137657333008, https://www.rtvslo.si/radio-koper/prispevki/novice/oljcne-tropine-v-tujini-za-krmo-dodatek-k- prehrani-ogrevanje-pri-nas-so-le-odpadek/480257, https://www.primorske.si/primorska/istra/tropine-kot-gnojilo-piscancja-krma. Obrazec ARRS-RPROJ-CRP-HRANA-VP-2014 Stran 39 od 42 1. Izvirni znanstveni članek NENADIS, Nikolaos, MASTRALEXI, Aspasia, TSIMIDOU, M. Z., VICHI, Stefania, QUINTANILLA-CASAS, Beatriz, DONARSKI, James, BAILEY-HORNE, Victoria, BUTINAR, Bojan, BUČAR-MIKLAVČIČ, Milena, GARCÍA GONZÁLEZ, Diego-Luis, TOSCHI, Tullia Gallina. Toward a harmonized and standardized protocol for the determination of total hydroxytyrosol and tyrosol content in virgin olive oil (VOO) : extraction solvent. European Journal of Lipid Science and Technology, ISSN 1438-9312. [Online ed.], 2018, vol. 120, iss. 11, str. 1–10, ilustr. https://doi.org/10.1002/ejlt.201800099, doi: 10.1002/ejlt.201800099. [COBISS.SI-ID 2528467]. CIFÀ, Domenico, SKRT, Mihaela, PITTIA, Paola, DI MATTIA, Carla, POKLAR ULRIH, Nataša. Enhanced yield of oleuropein from olive leaves using ultrasound-assisted extraction. Food science & nutrition, ISSN 2048-7177, 2018, vol. 6, str. 1128–1137, ilustr., doi: 10.1002/fsn3.654. [COBISS.SI-ID 4893560]. V pripravi: Za objavo v: International Journal of Agricultural Sustainability Naslov članka: Chemical characteristics of two-phase olive mill waste »alperujo« for possible direct soil application in humid Mediterranean regions Avtorji: Maja Podgornik, Milena Bučar-Miklavčič, Alenka Levart, Janez Salobir, Vida Rezar, Bojan Butinar 2. Strokovni članek PODGORNIK, Maja, VALENČIČ, Vasilij, BUČAR-MIKLAVČIČ, Milena, BEŠTER, Erika, VOLK, Saša, FANTINIČ, Jakob, HLADNIK, Teja, KOZLOVIČ, Gašper, STEVOVIĆ, Bojana, LEVART, Alenka, SALOBIR, Janez, REZAR, Vida, BUTINAR, Bojan. Možnosti uporabe oljčnih tropin v luči krožnega gospodarstva. Oljka : novice Društva oljkarjev, ISSN 1580-0113, maj 2019, letn. 21, št. 5, str. 11 in12, ilustr. [COBISS.SI-ID 2578643]. 3. Objavljeni znanstveni prispevek na konferenci LEVART, Alenka, SALOBIR, Janez, LESKOVEC, Jakob, PODGORNIK, Maja, BUČAR-MIKLAVČIČ, Milena, BUTINAR, Bojan, REZAR, Vida. Sestava oljčnih tropin iz slovenskih oljčnikov in vpliv oljčnih listov in tropin na proizvodne lastnosti pitovnih piščancev = Composition of olive cakes from Slovenian olive groves and influence of olive leaves and cake on perormance in broilers. V: ČEH, Tatjana (ur.), KAPUN, Stanko (ur.). Zbornik predavanj = Proceedings of the 27th International Scientific Symposium on Nutrition of Farm Animals [being] Zadravec-Erjavec Days 2018, 8th and 9th November 2018. Murska Sobota: Kmetijsko gozdarska zbornica Slovenije, Kmetijsko gozdarski zavod. 2018, str. 103–110, ilustr. [COBISS.SI-ID 4152968]. LESKOVEC, Jakob, REZAR, Vida, SALOBIR, Janez, LEVART, Alenka. Stranski proizvodi oljkarstva kot krmila in krmni dodatki v prehrani prašičev = Olive by-products as feed stuff and feed additives in pig nutrition. V: ČEH, Tatjana (ur.), KAPUN, Stanko (ur.). Zbornik predavanj = Proceedings of the 27th International Scientific Symposium on Nutrition of Farm Animals [being] Zadravec-Erjavec Days 2018, 8th and 9th November 2018. Murska Sobota: Kmetijsko gozdarska zbornica Slovenije, Kmetijsko gozdarski zavod. 2018, str. 97–101, ilustr. [COBISS.SI-ID 4153224]. V pripravi: Za 28. posvetovanje o prehrani domačih živali za »Zadravčeve-Erjavčeve dneve« 7. in 8. novembra 2019 Naslov prispevka: Vpliv oljčnih listov in tropin v krmnih mešanicah za pitovne piščance na izkoristljivost hranljivih snovi in energije ter na mineralizacijo kosti Avtorji: Vida REZAR, Alenka LEVART, Silvester ŽGUR in Janez SALOBIR Obrazec ARRS-RPROJ-CRP-HRANA-VP-2014 Stran 40 od 42 4. Objavljeni povzetek znanstvenega prispevka na konferenci LEVART, Alenka, REZAR, Vida, LESKOVEC, Jakob, PIRMAN, Tatjana, BUTINAR, Bojan, BUČAR-MIKLAVČIČ, Milena, PODGORNIK, Maja, SALOBIR, Janez. Utilization of olive byproducts in non-ruminant nutrition. V: PERIĆ, Lidija (ur.). Book of abstracts, The International Symposium on Animal Science (ISAS) 2019, 3–8. 6. 2019, Herceg Novi, Črna gora. Novi Sad: Faculty of Agriculture. 2019, str. 24. [COBISS.SI-ID 4236168]. CIFÀ, Domenico, FELTI, Veronica, SKRT, Mihaela, DI MATTIA, Carla, PITTIA, Paola, POKLAR ULRIH, Nataša. The ultrasound assisted extraction of oleuropein from olive leaves Olea europaea L. and its stabilization by encapsulation. V: GORIČAR, Katja (ur.), HUDLER, Petra (ur.). Book of abstracts = Zbornik povzetkov, 12th Meeting of the Slovenian Biochemical Society with International Participation = 12. srečanje Slovenskega biokemijskega društva z mednarodno udeležbo, Bled, 20.–23. september 2017. Ljubljana: Slovenian Biochemical Society. 2017, str. 96, PI-22. [COBISS.SI-ID 4817528]. GONZÁLEZ ORTEGA, Rodrigo, PITTIA, Paola, DI MATTIA, Carla, POKLAR ULRIH, Nataša. Liposome encapsulation of a oleuropein-rich olive leaf extract and study of the effect of oleuropein on model lipid membrane. V: VICENTE, António A. (ur.), PINHEIRO, Ana Cristina (ur.), MARTINS, Joana T. (ur.). Book of abstracts of the 8th International Symposium on "Delivery of Functionality in Complex Food Systems", Porto, Portugalska, 7.–10. julija 2019. 1st ed. Braga: Universidade do Minho, Departamento de Engenharia Biológica. 2019, str. 28, OC02-24919. https://www.dof2019.org/docs/Book_of_Abstracts.pdf. 5. Prispevek na konferenci brez natisa BUTINAR, Bojan. Kemijske značilnosti slovenskih oljčnih tropin = Chemical characteristics of slovenian olive mill waste : predavanje na Mednarodnem posvetu "Možnost uporabe oljčnih tropin v luči krožnega gospodarstva" = International Conference "The possibility of using olive mill waste in the light of circular economy", Koper, Slovenija, 15. februar 2019. [COBISS.SI-ID 2579155]. POKLAR ULRIH, Nataša. Stabilizacija ekstraktov iz oljčnih listov = Stabilization of extracts obtained from olive leaf : predavanje na Mednarodnem posvetu "Možnost uporabe oljčnih tropin v luči krožnega gospodarstva" = International Conference "The possibility of using olive mill waste in the light of circular economy", Koper, Slovenija, 15. februar 2019. [COBISS.SI-ID 5033080]. POKLAR ULRIH, Nataša. Uporabnost oljčnih listov : Strokovni posvet "Hlajevi dnevi 2019", Koper, Znanstveno-raziskovalno središče, 29. 3. 2019. http://www.zrs-kp.si/wp- content/uploads/2019/03/PROGRAM_Hlajevi_dnevi_2019.pdf. [COBISS.SI-ID 5087864]. 6 Diplomska naloga TOMAŽIČ, Kaja. Vpliv postopkov ekstrakcije na vsebnost aktivnih učinkovin v ekstraktu iz oljčnih listov : diplomsko delo univerzitetnega študijskega programa I. stopnje. Maribor: [K. Tomažič], 2019. XI, 49 str., ilustr. https://dk.um.si/IzpisGradiva.php?lang=slv&id=74157. [COBISS.SI-ID 22611478]. 7. Magistrske naloge ZAVERL, Manca. Vpliv oljčnih listov in tropin na izkoristljivost hranil in energije pri prašičih: magistrsko delo : magistrski študij – 2. stopnja = The effect of olive leaves and pulp on utilization of nutrients and energy in pigs : M. Sc. Thesis : Master Study Programmes. Ljubljana: [M. Zaverl], 2019. X, 51 f., ilustr. https://repozitorij.uni-lj.si/IzpisGradiva.php?id=108723. [COBISS.SI-ID 4272008]. Obrazec ARRS-RPROJ-CRP-HRANA-VP-2014 Stran 41 od 42 V pripravi: FINDERLE, Nasja: Vpliv dodatka oljčnih listov in tropin na izkoristljivost hranil in energije pri pitovnih piščancih : magistrsko delo : magistrski študij – 2. stopnja = Effect of olive leaves and pulp in feed mix on utilization of nutrients and energy in chickens : M. Sc. Thesis : Master Study Programmes. ZAHVALA Predstavljeni rezultati so pridobljeni s finančno pomočjo Javne agencije za raziskovalno dejavnost Republike Slovenije in Ministrstva za kmetijstvo, gozdarstvo in prehrano v okviru ciljnoraziskovalnega programa (CRP) CRP V4-1621 Možnosti uporabe ostankov proizvodnje v oljkarstvu. Avtorji se zahvaljujejo financerjem projekta ter oljarjema Franku Lisjaku in Andreju Mihelju, ki sta omogočila praktično izvedbo poskusa in pomagala pri ovrednotenju rezultatov. Obrazec ARRS-RPROJ-CRP-HRANA-VP-2014 Stran 42 od 42 Document Outline DS1 POPIS STANJA IN PRIPRAVA PRIPOROČIL ZA KORISTNO UPORABO OSTANKOV PROIZVODNJE V OLJKARSTVU DS.1.1 Pregled in sinteza do zdaj znanih podatkov in raziskav s področja DS.1.2 Popis stanja ostankov v slovenskem oljkarstvu DS.1.3 Spremljanje uporabe tropin in rastlinske vode na kmetijskih zemljiščih DS2 PREHRANSKA VREDNOST IN KRMLJENJE ŽIVALI DS2.1 Pregled in sinteza do zdaj znanih podatkov in raziskav DS2.2 Analiza in meritve hranilne vrednosti oljčnih listov in tropin DS2.2.1 Analiza osnovnih parametrov hranilne vrednosti DS2.2.2 Meritve prebavljivosti oz. presnovljivosti energije in hranil pri prašičih in perutnini DS2.3 In vitro raziskave prehranske vrednosti za prežvekovalce DS2.4 Ocena možnosti uporabe oljčnih listov in tropin za siliranje DS3 PRIPRAVA EKSTRAKTOV, BOGATIH S FENOLNIMI SPOJINAMI, ZA PRIPRAVO PREHRANSKIH DOPOLNIL DS3.1 Pregled in sinteza dosedanjih znanih podatkov in raziskav DS3.2 Priprava in analiza etanolnih ekstraktov oljčnih listov in tropin DS3.3 Kapsulacija s proliposomi in karakterizacija DS3.4 Priprava alginatnih/hitozanskih kapsul in karakterizacija iz ekstrakta oljčnih listov DS3.5 Priprava ekstrakta za uporabo v živilskih izdelkih z metodo sušenja z razprševanjem DS3.6 Testiranje stabilnosti ekstraktov v prehranskem dopolnilu DS 4 IZDELAVA SMERNIC ZA TRAJNOSTNO UPORABO OSTANKOV PROIZVODNJE V OLJKARSTVU DS 5 KOMUNIKACIJA IN DISEMINACIJA ZAHVALA