Acta agriculturae Slovenica, 90(december 2007)2, 85–95. Agris category codes: L51 COBISS Code 1.01 POTEK FERMENTACIJE ŠKROBA OB DODATKU RAZLI ČNIH VRST TANINOV Urška SIVKA a) in Andrej LAVREN ČI Č b) a) Univ. v Ljubljani, Biotehniška Fak., Odd. za zootehniko, Groblje 3, SI-1230 Domžale, Slovenija, e-pošta: sursek@gmail.com. b) Isti naslov kot a) , doc., dr. Delo je prispelo 12. julija 2007, sprejeto 26. oktobra 2007. Received July 12, 2007, accepted October 26, 2007. IZVLE ČEK Prou čevali smo vpliv vrste in koncentracije razli čnih taninskih izvle čkov na kinetiko in vitro fermentacije škroba v vampnem soku. K škrobu smo dodali tri taninske izvle čke: kostanjev tanin (F75), kebra čo tanin (QUE) in taninsko kislino (TAK) v razli čnih koncentracijah: 0 (kontrola), 0,33, 0,67 in 1,33 mg taninskega izvle čka ml –1 medija. S pomo čjo Gompertzove funkcije smo ocenili kazalnike fermentacije, skupno potencialno produkcijo plina (B), specifično hitrost fermentacije (C) in konstantni faktor mikrobne (ne)u činkovitosti (A)) ter izra čunali čas najve čje hitrosti fermentacije ( ČNHF), najve čjo hitrost fermentacije (NHF) in časovni zaostanek za četka fermentacije (LAG). Z dodatkom F75 (507,8 ml g –1 SS) in QUE (474,2 ml g –1 SS), se je skupna potencialna produkcija plina iz škroba v primerjavi s kontrolo (528,4 ml g –1 SS) statisti čno zna čilno zmanjšala (p < 0,05). Nasprotno pa se je skupna potencialna produkcija plina z dodatkom TAK v povpre čju pove čala. Najve čjo hitrost fermentacije škroba (50,6 ml h –1 ) smo izmerili po skoraj 9. urah inkubacije. ČNHF se je z dodatkom taninskih izvle čkov statisti čno zna čilno podaljšal, še najbolj ob dodatku 0,33 mg taninskih izvle čkov/ml medija. Vrsta taninskega izvle čka in koncentracija taninskega izvle čka sta statisti čno zna čilno vplivala (p < 0,01) na najve čjo hitrost fermentacije škroba. Še najmanj se je NHF zmanjšala ob dodatku F75 (42,0 ml h –1 ), medtem ko se je NHF ob dodatku TAK zmanjšala na 38,1 ml h –1 , ob dodatku QUE pa na 34,7 ml h –1 . NHF se je najbolj zmanjšala ob dodatku taninskih izvle čkov v koncentraciji 0,67 mg ml –1 medija. Klju čne besede: prehrana živali / tanini / škrob / fermentacija / vamp / Gompertz / produkcija plina THE COURSE OF FERMENTATION OF STARCH WITH THE ADDITION OF DIFFERENT TYPES OF TANNINS ABSTRACT Four different concentrations (0 (control), 0.33, 0.67 and 1.33 mg ml –1 medium) of three tannin extracts (chestnut (F75) and quebracho (QUE) tannin extracts and tannic acid (TAK) were used to investigate their effect on the kinetics of in vitro fermentation of starch. Gas production was measured at 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 36, 48, 72 and 96 h after the start of incubation. Gompertz model was used to estimate kinetic parameters “B” (total potential gas production), “C” (relative degradation rate) and “A” (constant decay in relative degradation rate). First and second derivatives of Gompertz model were used to calculate the maximum fermentation rate (MFR) and time of maximum fermentation rates (TMFR). Addition of F75 (507.8 ml g –1 DM) and QUE (474.2 ml g –1 DM) significantly decreased (P < 0.05) total potential gas production compared to control (528.4 ml g –1 DM). On contrary, the addition of TAK (560.5 ml g –1 DM) significantly increased total potential gas production. Maximum fermentation rate of starch (50.6 ml h –1 ) occurred after almost 9 hours of incubation. The addition of tannin extracts significantly increased TMFR; this increase was greatest when 0.33 mg of tannin extracts were added to the http://aas.bf.uni-lj.si Acta agriculturae Slovenica, 90(december 2007)2. 86 medium. Type and concentration of tannin extracts had significant effect (P < 0.01) on maximum fermentation rate of starch. The lowest reduction in MFR was determined when F75 was used (MFR reduced to 42.0 ml h –1 ), while it was reduced to 38.1 ml h –1 when TAK and 34.7 ml g –1 when QUE were used. The greatest reduction in MFR was determined when the concentration of 0.67 mg of tannin extracts/ml medium was used. Key words: animal nutrition / tannins / starch / fermentation / rumen / Gompertz / gas production UVOD Izmed nestrukturnih ogljikovih hidratov je škrob najpomembnejša sestavina krme, ki zagotavlja energijo visoko produktivnim kravam molznicam in govejim pitancem. Razgradnja škroba v predželodcih poteka pod vplivom anaerobnih bakterij vrst Streptoccocus bovis, Butyrivibrio fibrisolvens, Bacteriodes ruminicola in Selenomonas ruminatium (Huntington, 1997). Pri anaerobni fermentaciji škroba nastaja poleg hlapnih maš čobnih kislin tudi mle čna kislina. Ob prekomernem zauživanju škroba se zaradi fermentacije za čnejo kopi čiti hlapne maš čobne kisline in mle čna kislina, kar zniža pH predželodcev na raven, ki negativno vpliva na delovanje predželodcev, prirejo mleka in zdravje živali (Hoover in Miller-Webster, 1998). Hitrost in obseg razgradnje škroba v predželodcih sta odvisna od sestave obroka, koli čine zaužite krme, mehani čne in kemi čne obdelave krme ter prilagoditve vampnih mikroorganizmov na substrat (Huntington, 1997). Na razgradnjo škroba v predželodcih lahko vplivamo z dodatki, kot so maš čobe in maš čobne kisline, formaldehid ali fenolne spojine, med katere prištevamo tudi tanine. Tanini so razširjeni po vseh rastlinskih družinah. Najdemo jih tako v travniških rastlinah, kot tudi v grmovnih in drevesnih vrstah. Na splošno so tanini topni v vodi, vendar pa se topnost molekul s pove čevanjem molekulske mase zmanjšuje (Lavren či č, 2001). Zaradi velikega števila hidroksilnih skupin tvorijo tanini razli čne vrste vezi z beljakovinami, aminokislinami, ogljikovimi hidrati, kovinskimi ioni, vitamini, bakterijskimi celi čnimi membranami in encimi vklju čenimi v razgradnjo beljakovin in ogljikovih hidratov (Mole in Waterman, 1987; Haslam, 1989; Butter in sod., 1999; Makkar, 2003). Tanine delimo na kondenzirane in hidrolizirajo če tanine. Kondenzirani tanini so oligomeri in polimeri flavanolnih enot (flavan-3-olov in flavan-4-diolov), povezanih z ogljikovimi vezmi, ki niso dovzetne na hidrolizo (Hagerman in Butler, 1991). Hidrolizirajo či tanini vsebujejo ogljikohidratno jedro (ponavadi D-glukozo), ki tvori estre z galno kislino (galotanini) ali heksahidroksidifensko kislino (elagitanini) (Mangan, 1988). Obe skupini taninov lahko vplivata na zdravje živali tako pozitivno kot negativno, kar je odvisno od vrste in koncentracije tanina v obroku, vrste živali ter fiziološkega stanja živali (Kumar in Vaithiyanathan, 1990; Butter in sod., 1999; Makkar, 2003). Nizke koncentracije taninov (pod 50 g/kg SS obroka) pove čujejo sintezo mikrobnih beljakovin in zmanjšujejo razgradljivost beljakovin v predželodcih prežvekovalcev, zaradi česar se zmanjša koli čina izlo čenega dušika v okolje (Butter in sod., 1999; Makkar, 2003). Zaradi njihovega vpliva na delovanje mikroorganizmov se zmanjša tudi tvorba metana v predželodcih prežvekovalcev (Roth, 2003). Tanini v majhnih koncentracijah torej pozitivno vplivajo na prirejo mleka, mesa in volne, saj pove čujejo tok esencialnih aminokislin v tanko črevo. Nasprotno pa so (pre)velike koncentracije tako kondenziranih kot tudi hidrolizirajo čih taninov strupene. Presežke hidrolizirajo čih taninov vampni mikroorganizmi lahko do neke mere razgradijo (Makkar, 2003), kar pa ne velja za kondenzirane tanine (McSweeney in sod., 2001). Tvorba kompleksov med tanini in beljakovinami oz. aminokislinami je še vedno predmet številnih raziskav vpliva taninov na razgradljivost beljakovin v predželodcih prežvekovalcev. Manj so se raziskovalci posve čali preu čevanju vpliva taninov na razgradnjo oz. fermentacijo ogljikovih hidratov. Reed (1995) in McSweeney in sod. (2001) navajajo, da tanini tvorijo mo čne vodikove vezi s celulozo, hemicelulozo, škrobom ter pektini. Poleg tega pa se tanini vežejo na Sivka, U. in Lavren či č, A. Potek fermentacije škroba ob dodatku razli čnih vrst taninov. 87 mikrobne encime (beljakovine), ki so vklju čeni v presnovo ogljikovih hidratov (Makkar in sod., 1987, cit po. Butter in sod., 1999; McSweeney in sod., 2001), s čimer inhibirajo njihovo delovanje. Kljub temu antimikrobnemu delovanju, pa Scalbert (1991) navaja, da lahko številni mikroorganizmi v prisotnosti taninov normalno rastejo in se razvijajo. In vitro produkcija plina je ena od tehnik, s katerimi ugotavljamo mikrobno aktivnost vampnih mikroorganizmov (Williams in sod., 2001). Namen naše raziskave je bil ugotoviti, kako razli čni taninski izvle čki v razli čnih koncentracijah vplivajo na kinetiko sproš čanja plina pri in vitro fermentaciji čistega škroba oz. kako ti izvle čki vplivajo na amiloliti čno aktivnost vampnih mikroorganizmov. MATERIAL IN METODE In vitro fermentacijo škroba smo izvedli po metodi, ki jo navajata Menke in Steingass (1988), le da smo vampni sok odvzeli uro in pol po jutranjem krmljenju. Vampni dok smo odvzeli iz dveh fistuliranih kastriranih ovnov jezersko-sol čavske pasme, ki smo jih krmili s senom (po volji), sestavljeno krmno mešanico (300 g dan –1 ) in rudninsko vitaminsko mešanico (50 g dan –1 ), ter tako pokrili vzdrževalne potrebe po hranljivih snoveh. Krompirjev škrob (Art.št. 101252, Merck, Darmstadt, Nem čija) smo uporabili kot substrat za in vitro fermentacijo. Pred inkubacijo smo škrobu primešali tri razli čne taninske izvle čke: kostanjev tanin (farmatan 75 ® (F75); Tanin Sevnica, Slovenija), taninsko kislino (TAK; Sigma- Aldrich, Nem čija) in kebra čo tanin (QUE; Roy Wilson Dickson, Velika Britanija) v koncentracijah 0 (kontrola), 0,33, 0,67 in 1,33 mg ml –1 medija. V brizgalke smo zatehtali 175 mg substrata in dodali ustrezno koli čino taninskega izvle čka. Substratu s taninskim izvle čkom ali brez njega smo nato dodali še 30 ml mešanice vampnega soka in pufra (10 ml vampnega soka in 20 ml pufra) ter jih postavili v vodno kopel ogreto na 39 ± 0,5 °C. Vsako kombinacijo substrata in taninskega izvle čka v razli čnih koncentracijah smo izvedli v treh ponovitvah. Skupaj z vzorci smo inkubirali tudi slepe vzorce (brizgalke brez vzorca) in vzorec standardnega krmila (seno mnogocvetne ljuljke), s katerim smo primerjali aktivnosti vampnega soka med posameznimi serijami. Prostornino sproš čenega plina smo od čitali 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 36, 48, 72 in 96 ur po za četku inkubacije. Kazalnike in vitro fermentacije škroba smo ocenili za vsako kombinacijo koncentracije in vrste taninskega izvle čka s pomo čjo Gompertzove funkcije (Bidlack in Buxton, 1992; Lavren či č in sod., 1997): t A e C e B t y − − = )(, [1] kjer je »y« produkcija plina (ml) v času inkubacije »t«, »B« skupna potencialna produkcija plina (ml g –1 SS), »C« specifi čna hitrost fermentacije, na katero vpliva konstantni faktor »A«, s katerim ozna čujemo faktor mikrobne (ne)u činkovitosti. Kazalnike B, C in A smo ocenili kot nelinearno regresijo (PROC NLIN) v statisti čnem programskem paketu SAS (SAS, 2001). Spremembe v hitrosti fermentacije smo ocenili s prvim odvodom Gompertzove funkcije po času »t«: At Ce At e e BCA dt dy − − − =. [2] Z drugim odvodom Gompertzove funkcije po času, ki smo ga izena čili z ni č (0) in rešili po času »t«, smo izra čunali čas najve čje hitrosti fermentacije (h; ČNHF): Acta agriculturae Slovenica, 90(december 2007)2. 88 0 ) ( 2 2 2 2 2 2 = − = − − − − − At Ce At Ce At e ABC e e C AB dt y d . [3] Najve čjo hitrost fermentacije (ml h –1 ; NHF) smo izra čunali tako, da smo ustrezne ČNHF vstavili v prvi odvod Gompertzove funkcije. Za substrat z vsako kombinacijo koncentracije in vrste taninskega izvle čka smo s pomo čjo kazalnikov fermentacije izra čunali tudi časovni zaostanek za četka fermentacije (h; LAG): A C LAG 1 ) log( − =. [4] Ocenjene kazalnike fermentacije (B, C in A) ter izra čunane kazalnike ČNHF, NHF in LAG smo analizirali z metodo najmanjših kvadratov v proceduri GLM (General Linear Model): ijk ij j i ijk e TK K T y + + + + = µ , kjer je »y ijkl « opazovana vrednost, »µ« srednja vrednost, »T i « sistematski vpliv vrste taninskega izvle čka, »K j « sistematski vpliv koncentracije taninskega izvle čka ter »TK ij « interakcija med taninskim izvle čkom in koncentracijo taninskega izvle čka. Statisti čno zna čilne razlike (p < 0,05) med vrstami in koncentracijami posameznega taninskega izvle čka smo ovrednotili s pomo čjo Tukey-Kramer testa (SAS, 2001). REZULTATI Vpliv taninskega izvle čka V preglednici 1 so predstavljeni ocenjeni kazalniki fermentacije škroba. Na vse tri ocenjene kazalnike fermentacije sta statisti čno zna čilno (p < 0,01) vplivala tako vrsta kot koncentracija taninskega izvle čka. Poleg vrste in koncentracije taninskega izvle čka je na ocenjene kazalnike fermentacije vplivala (p < 0,001) tudi interakcija med vrsto taninskega izvle čka in njegovo koncentracijo. Dodatka taninskih izvle čkov F75 in QUE v medij sta skupno potencialno produkcija plina iz škroba v primerjavi s kontrolo zmanjšala. Najbolj je skupno potencialno produkcijo plina zmanjšal dodatek QUE (za 54,2 ml g –1 SS), medtem ko je dodatek F75 zmanjšal skupno potencialno produkcijo plina za 20,6 ml g –1 SS. Ravno nasprotno pa je dodatek taninske kisline (TAK) skupno potencialno produkcijo plina pove čal od 528,4 ml g –1 SS (kontrola) na 560,5 ml g –1 SS (pregl. 1). Specifi čna hitrost fermentacije škroba (C) brez dodanega taninskega izvle čka je bila 10,1 (pregl. 1). Dodatek QUE in TAK sta specifi čno hitrost fermentacije škroba zmanjšala na 7,6 (QUE) in 8,4 (TAK), medtem ko je specifi čna hitrost fermentacije ob dodanem F75 ostala bolj ali manj nespremenjena (10,8). Konstantni faktor mikrobne (ne)u činkovitosti (A) škroba (0,260) se je dodajanjem taninskih izvle čkov zmanjšal za 30 % ob dodatku TAK, 23 % ob dodatku QUE in 14 % ob dodatku F75 (pregl. 1). V preglednici 2 so predstavljeni izra čunani kazalniki fermentacije škroba. Na izra čunane kazalnike fermentacije (LAG, ČNHF in NHF) sta statisti čno zna čilno (p < 0,05) vplivala vrsta in koncentracija taninskega izvle čka. Enako kot pri ocenjenih kazalnikih fermentacije je tudi Sivka, U. in Lavren či č, A. Potek fermentacije škroba ob dodatku razli čnih vrst taninov. 89 interakcija med vrsto taninskega izvle čka in njegovo koncentracijo statisti čno zna čilna (p < 0,01). Preglednica 1. Ocenjeni kazalniki fermentacije po inkubaciji z razli čnimi vrstami in koncentracijami taninskih izvle čkov Table 1. Estimated kinetic parameters after incubation with different types and concentrations of tannins extracts Ocenjeni kazalniki fermentacije / Estimated kinetic parameters B (ml g –1 SS) † B (ml g –1 DM) C † A † F75 QUE TAK F75 QUE TAK F75 QUE TAK Koncentracija TI ‡ Concentration TE 0 528,4 a† 10,1 a 0,260 a 1 504,8 bA 503,7 bA 537,3 acB 6,1 bA 9,3 aB 6,6 bA 0,130 bA 0,186 bB 0,120 bA 2 511,0 bA 462,2 cB 581,5 bC 15,9 cA 7,1 bB 11,0 aB 0,308 cA 0,213 cB 0,266 aC 3 507,6 bA 456,6 cB 562,7 bcC 10,5 aA 6,4 bB 7,5 bAB 0,234 dA 0,199 bcAB 0,164 bB SDO § / RMSE 9,26 1,06 0,01 Statisti čna zna čilnost Statistical significance Taninski izvle ček (T) Tannin extract (T) *** *** *** Koncentracija TI (K) Concentration TE (K) ** *** *** TI × K TE × K *** *** *** † B – skupna potencialna produkcija plina / total potentially gas production, C – specifi čna hitrost fermentacije / relative degradation rate, A – konstantni faktor mikrobne (ne)u činkovitosti / constant decay in relative degradation rate; ‡ 0 – kontrola / control, 1 – 0,33 mg ml –1 medija / 0.33 mg ml –1 medium, 2 – 0,67 mg ml –1 medija / 0.67 mg ml –1 medium, 3 – 1,33 mg ml –1 medija / 1.33 mg ml –1 medium; § SDO – standardni odklon ostanka / RMSE – root mean square error; abcd vrednosti v stolpcih se statisti čno zna čilno razlikujejo (p < 0,05) / means in a column differ significantly (p < 0.05); ABCD vrednosti v vrsticah se statisti čno zna čilno razlikujejo (p < 0,05) / means in a row differ significantly (p < 0.05); Dodatek taninskih izvle čkov je glede na kontrolo podaljšal časovni zaostanek za četka fermentacije (LAG) škroba (pregl. 2). LAG je bil najkrajši ob dodatku QUE (5,1 ure) in najdaljši ob dodatku TAK (6,3 ure). LAG je bil ob dodatku TAK v povpre čju za 20 % daljši od izra čunanega za kontrolo (5,0 ure). Škrob brez dodatkov taninskih izvle čkov je najhitreje fermentiral 8,9 ure po za četku inkubacije, ko se je sprostilo 50,6 ml/uro (pregl. 2 in slika 1). Najkasneje je najve čjo hitrost fermentacije škrob dosegel z dodatkom TAK (12,5 h), medtem ko je dodatek F75 in QUE v medij čas najve čje hitrosti fermentacije ( ČNHF) podaljšal za najve č dve uri. Najve čja hitrost fermentacije (NHF) škroba je se je z dodatkom taninskih izvle čkov zmanjšala (pregl. 2 in slika 1). V primerjavi s kontrolo (50,6 ml h –1 ) je najmanjši vpliv na NHF imel dodatek F75 (42,0 ml h –1 ), kateremu sta sledila dodatka TAK (38,1 ml h –1 ) ter QUE (34,7 ml h –1 ). Vpliv koncentracije taninskega izvle čka S pove čevanjem koncentracije posameznih taninskih izvle čkov se skupna potencialna produkcija plina zmanjšuje. V primerjavi s kontrolo (528,4 ml g –1 SS) je dodatek 1,33 mg QUE Acta agriculturae Slovenica, 90(december 2007)2. 90 ml –1 medija najbolj zmanjšal skupno potencialno produkcijo plina (456,6 ml g –1 SS), medtem ko se skupna potencialna produkcija plina pri razli čnih koncentracija F75 ni statisti čno zna čilno spremenila. Za razliko od QUE in F75 pa je v primerjavi s kontrolo dodatek TAK pove čal skupno potencialno produkcijo plina iz škroba, ki je do koncentracije 0,67 mg TAK ml –1 medija naraš čala (581,5 ml g –1 SS), pri najve čji koncentraciji pa se je zmanjšala na 562,7 ml g –1 SS. Taninska izvle čka F75 in QUE sta imela enak u činek na skupno potencialno produkcijo plina pri koncentraciji 0,33 mg ml –1 medija (pregl. 1). Pri ve čjih koncentracijah (0,67 in 1,33 mg ml –1 medija) je QUE statisti čno zna čilno zmanjšal skupno potencialno produkcijo plina iz škroba. Preglednica 2. Izra čunani kazalniki fermentacije po inkubaciji z razli čnimi vrstami in koncentracijami taninskih izvle čkov Table 2. Calculated kinetic parameters after incubation with different types and concentrations of tannins extracts Izra čunani kazalniki fermentacije Calculated kinetic parameters LAG (h) † ČNHF (h) † TMFR (h) NHF (ml h –1 ) † MFR (ml h –1 ) F75 QUE TAK F75 QUE TAK F75 QUE TAK Koncentracija TI ‡ Concentration TE 0 5,0 a† 8,9 a 50,6 a 1 6,1 bA 6,6 bB 7,4 bC 13,8 bA 12,0 bB 15,8 bC 24,2 bA 34,4 bB 23,6 bA 2 5,7 abA 4,5 cB 5,2 aA 8,9 a 9,2 a 9,0 a 58,0 cA 36,2 bB 56,9 aA 3 5,7 abA 4,3 cB 6,2 cA 10,0 c 9,3 a 12,6 c 43,8 d 33,4 b 33,8 b SDO § / RMSE 0,28 0,74 2,82 Statisti čna zna čilnost Statistical significance Taninski izvle ček (TI) Tannin extract (TE) *** *** ** Koncentracija TI (K) Concentration TE (K) *** *** *** TI × K TE × K *** ** *** † LAG – časovni zaostanek za četka fermentacije (h) / lag phase (h), ČNHF – čas najve čje hitrosti fermentacije (h) / TMFR – time of maximum fermentation rates (h), NHF – najve čja hitrost fermentacije (ml h –1 ) / MFR – maximum fermentation rate (ml h –1 ); ‡ 0 – kontrola / control, 1 – 0,33 mg ml –1 medija / 0.33 mg ml –1 medium, 2 – 0,67 mg ml –1 medija / 0.67 mg ml –1 medium, 3 – 1,33 mg ml –1 medija / 1.33 mg ml –1 medium; § SDO – standardni odklon ostanka / RMSE – root mean square error; abcd vrednosti v stolpcih se statisti čno zna čilno razlikujejo (p < 0,05) / means in a column differ significantly (P < 0.05); ABCD vrednosti v vrsticah se statisti čno zna čilno razlikujejo (p < 0,05) / means in a row differ significantly (P < 0.05); Pri koncentraciji F75 in TAK 0,33 mg ml –1 medija je bila specifi čna hitrost fermentacije škroba statisti čno zna čilno manjša (6,1 za F75 in 6,6 za TAK) od škroba, brez dodanega taninskega izvle čka. Specifi čna hitrost fermentacije se je s pove čanjem koncentracije F75 in TAK pove čala na 15,9 in 11,0, potem pa upadla na 10,5 in 7,5. S pove čevanjem koncentracije QUE se je specifi čna hitrost fermentacije škroba zmanjšala od 9,3 pri koncentraciji 0,33 mg ml –1 medija na 6,4 pri 1,33 mg ml –1 medija. Na konstantni faktor mikrobne (ne)u činkovitosti najbolj vplivajo najmanjše koncentracije taninskih izvle čkov (pregl. 1). Z naraš čanjem koncentracije taninskega izvle čka do koncentracije Sivka, U. in Lavren či č, A. Potek fermentacije škroba ob dodatku razli čnih vrst taninov. 91 0,67 mg ml –1 medija naraš ča tudi konstantni faktor mikrobne (ne)u činkovitosti, ki pa se pri najve čji koncentraciji ponovno zmanjša. 0 10 20 30 40 50 60 0 5 10 15 20 25 30 35 Čas inkubacije (ure) - Incubation time (h) Hitrost fermentacije (ml/uro) - Fermentation rate (ml/h) 0 1 2 3 0 10 20 30 40 50 60 0 5 10 15 20 25 30 35 Čas inkubacije (ure) - Incubation time (h) Hitrost fermentacije (ml/uro) - Fermentation rate (ml/h) 0 1 2 3 0 10 20 30 40 50 60 0 5 10 15 20 25 30 35 Čas inkubacije (ure) - Incubation time (h) Hiotrost fermentacije (ml/uro) - Fermentation rate (ml/h) 0 1 2 3 Slika 1. Hitrost fermentacije škroba pri razli čnih koncentracijah taninskih izvle čkov a) F75, b) QUE in c) TAK (0 – kontrola, 1– 0,33 mg ml –1 ; 2 – 0,67 mg ml –1 in 3 – 1,33 mg ml –1 medija). Figure 1. Starch fermentation rate at different tannin extract concentrations a) F75, b) QUE and c) TAK (0 – control, 1 – 0.33 mg ml –1 ; 2 – 0.67 mg ml –1 in 3 – 1.33 mg ml –1 of medium). a) b) c) Acta agriculturae Slovenica, 90(december 2007)2. 92 V primerjavi s škrobom brez dodanega taninskega izvle čka je koncentracija 0,67 mg taninskega izvle čka ml –1 medija podaljšala časovni zaostanek za četka fermentacije (LAG) v povpre čju za 2 %, medtem ko je koncentracija 1,33 mg taninskega izvle čka ml –1 medija podaljšala LAG za 7 %. LAG se je ob dodatku F75 in QUE skrajšal, vendar je bil pri vseh koncentracijah F75 daljši kot LAG kontrole, medtem ko se je bil pri najve čjih koncentracijah QUE statisti čno zna čilno krajši od kontrole (pregl. 2). Ob uporabi 0,33 mg TAK ml –1 medija je bil LAG v primerjavi s kontrolo statisti čno zna čilno daljši, nato pa se je skrajšal na 6,2 ure. Daljši časovni zaostanek za četka fermentacije je vplival tudi na čas najve čje hitrosti fermentacije ( ČNHF; pregl. 2 in slika 1). Ob dodajanju razli čnih koncentracij taninskih izvle čkov se je čas najve čje hitrosti fermentacije škroba podaljšal. Najdaljši ČNHF smo izra čunali za škrob, ki smo ga inkubirali s taninskimi izvle čki v koncentraciji 0,33 mg ml –1 medija (13,8 ure za F75, 12,0 ure za QUE in 15,8 ure za TAK). ČNHF je bil pri koncentraciji 0,67 mg taninskega izvle čka ml –1 medija enak kot pri kontroli. Pri koncentraciji 1,33 mg taninskega izvle čka ml –1 medija sta se glede ČNHF od kontrole statisti čno razlikovala samo F75 in TAK. ČNHF se med taninskimi izvle čki pri koncentracijah 0,67 in 1,33 mg ml –1 medija ni statisti čno zna čilno razlikoval. Pri koncentraciji 0,67 mg ml –1 medija se najve čja hitrost fermentacije (NHF; 50,4 ml h –1 ) ni statisti čno zna čilno razlikovala od kontrole (50,6 ml h –1 ). V primerjavi s kontrolo pa je bila NHF statisti čno zna čilno manjša (27,4 ml h –1 ) pri koncentraciji taninskih izvle čkov 0,33 mg ml –1 medija (pregl. 2 ter slike 1, 2 in 3). Pri koncentraciji 0,67 mg ml –1 medija F75 (58,0 ml h –1 ) in TAK (56,9 ml h –1 ) je bila NHF ve čja kot kontrola, medtem ko so bile NHF pri najve čji koncentraciji statisti čno zna čilno manjše kot pri kontroli. RAZPRAVA Taninska izvle čka F75 in QUE sta zmanjšala in vitro produkcijo plina med anaerobno inkubacijo škroba. Do podobnih rezultatov je z istima vrstama izvle čkov prišla tudi Roth (2003). Zmanjšan obseg fermentacija škroba v prisotnosti taninov v primerjavi s kontrolo je najverjetneje posledica tvorbe kompleksov med tanini in škrobom (Butter in sod., 1999; McSweeney in sod., 2001; Makkar, 2003) oziroma povezava taninov z vampnimi mikroorganizmi (Jones in sod., 1994) in/ali njihovimi encimi, ki so vklju čeni v fermentacijo škroba (Makkar in sod., 1987, cit. po Butter in sod., 1999). Martínez in sod. (2006) navajajo, da tanini kebra ča in taninska kislina ne inhibirajo vezave mikroorganizmov na škrobna zrna, ampak zmanjšujeta hidrolizo škroba tako, da zmanjšujeta razgradnje beljakovinske ovojnice škrobnih zrnc. TAK je za razliko od F75 in QUE pove čal skupno potencialno produkcijo plina iz škroba. Ti rezultati so v skladu z rezultati, ki jih navajajo Nelson in sod. (1995) ter Singh in sod. (2001). To pomeni, da taninska kislina ne inhibira mikrobne aktivnosti. To sta potrdila tudi O'Donovan in Brooker (2001), ki sta gojila bakterijo Streptococcus gallolyticus v prisotnosti taninske kisline in ugotovila, da ta bakterija normalno raste tudi pri koncentraciji 7 % (w/v) taninske kisline. Nelson in sod (1995) je preu čeval rast vampnih anaerobnih bakterij in ugotovil, da so rasle neovirano pri koncentraciji 3 % (w/v) taninske kisline, kar je kar trikrat ve čja koncentracija od tiste, ki smo jo uporabili v našem poskusu. Čeprav mnogi avtorji poro čajo o zmanjševanju produkcije plina zaradi pove čevanja koncentracije taninskih izvle čkov (Longland in sod., 1995; Zimmer in Cordesse, 1996; Lavren či č, 2001; Roth, 2003), tega trenda v naši raziskavi nismo mogli dokazati za vse preu čevane taninske izvle čke (pregl. 1). Silanikove in sod. (2001) ter Reed (1995) navajajo, da je vezava taninov na ogljikove hidrate in beljakovine odvisna od lastnosti taninov in lastnosti substratov, ki jih opredeljujejo molekulska masa, terciarna struktura, izoelektri čna to čka in kompatibilnost mest za vezavo. Tudi to je lahko razlog, da se naši rezultati razlikujejo od objavljenih v strokovni literaturi. Sivka, U. in Lavren či č, A. Potek fermentacije škroba ob dodatku razli čnih vrst taninov. 93 Časovni zaostanek za četka fermentacije (LAG) je faza prilagajanja mikroorganizmov na novo okolje in poselitev mikroorganizmov na substrat. Dodatek taninskih izvle čkov je podaljšal časovni zaostanek za četka fermentacije škroba (pregl. 2). O'Donovan in Brooker (2001) sta opazila, da je za četek rasti Streptococcus gallolyticus in Streptococcus bovis odložen ob dodatku taninske kisline. Roth (2003) poro ča, da je časovni zaostanek za četka fermentacije graha podaljšan s pove čevanjem koncentracije taninskega izvle čka mimoze (kondenziran tanin). Daljši časovni zaostanek za četka fermentacije je verjetno posledica vezave taninskih izvle čkov na mikrobne encime. Ker se tanini vežejo tudi na substrat, le ta postane nedostopen za encime, ki razkrajajo ogljikove hidrate (Scalbert, 1991; McSweeney in sod., 2001; Kumar in Singh, 1984). O'Donovan in Brooker (2001) menita, da je daljši časovni zaostanek za četka fermentacije substrata lahko posledica tvorbe zaš čitnega sloja na površini mikroorganizmov. Ta sloj sestavljajo predvsem glikoproteini, ki imajo veliko afiniteto do taninov. Vendar pa tvorba kompleksov med glikoproteini zaš čitnega sloja in tanini prepre či predvsem vezavo taninov na mikrobne encime (Scalbert, 1991; McSweeney in sod., 2001), zato tanini ne bi smeli bistveno vplivati na časovni zaostanek za četka fermentacije. Najhitreje je škrob fermentiral po 9 urah inkubacije ter dosegel hitrost 50,6 ml h –1 (pregl. 2 in slika 1). Dodatek taninskih izvle čkov je podaljšal čas najve čje hitrosti fermentacije škroba in zmanjšal najve čjo hitrost fermentacije škroba. Najmanjši u činek na najve čjo hitrost fermentacije škroba je imel kostanjev tanin (Farmatan 75), najve čjega pa dodatek kebračo taninov (QUE). Roth (1003) je primerjala kinetike in vitro fermentacije sojinih tropin v prisotnosti taninskih izvle čkov in ugotovila, da kostanjev tanin (farmatan) upo časni fermentacijo sojinih tropin bolj kot pa tanini kebra ča in mimoze. Manjšo hitrost in situ razgradnje travniškega sena v prisotnosti kostanjevih taninov sta ugotovila tudi Zimmer in Cordesse (1996). Hervás in sod. (2003) so ugotavljali potek in vitro fermentacije voluminozne krme ob dodatku razli čnih koncentracij taninov kebra ča in ugotovili, da se hitrost fermentacije s pove čevanjem koncentracije taninskega izvle čka zmanjšuje. Do podobnih rezultatov in vitro so prišli tudi Makkar in sod. (1995), ki so dokazali, da se obseg in hitrost razgradnje travniškega sena s pove čevanjem koncentracije taninov kebra ča zmanjšuje. SKLEPI Dodatek taninskih izvle čkov je spremenil potek in vitro fermentacije škroba. Pri tem se zmanjšata prostornina proizvedenega plina in hitrost fermentacije. Vrsta in koncentracija taninskega izvle čka sta imela mo čan vpliv (p < 0,01) na skupno potencialno produkcijo plina. Dodatek taninskih izvle čkov je podaljšal za četek fermentacije škroba za najve č dve uri (0,33 mg ml –1 TAK). Najve čjo hitrost fermentacije (50,6 ml h –1 ) škroba smo zabeležili po skoraj 9. urah od za četka fermentacije. Z dodatkom taninskih izvle čkov se je najve čja hitrost fermentacije zmanjšala, podaljšal pa se je čas, v katerem je škrob najhitreje fermentiral. S pove čevanje koncentracije taninskih izvle čkov se zmanjšujeta skupna potencialna produkcija plina in najve čja hitrost fermentacije ter podaljšujeta časovni zaostanek za četka fermentacije in čas, v katerem je škrob najhitreje fermentiral. SUMMARY Starch is the major energy component in ruminant nutrition. Rate and extent of starch digestion in the rumen are affected by different factors, including source of dietary starch, diet composition, amount of feed consumed, mechanical in chemical alterations and degree of adaptation of rumen microbiota to the diet (Huntington, 1997). Additives such as dietary fat or treatment with formaldehyde or phenolic substances, such as tannins, reduce the rate and extent Acta agriculturae Slovenica, 90(december 2007)2. 94 starch fermentation in the rumen (Huntington, 1997). Condensed and hydrolysable tannins are capable to form complexes with proteins, amino acids, carbohydrates, metal ions, vitamins, bacterial cell membranes and their enzymes (Mole in Waterman, 1987; Butter in sod., 1999; Makkar, 2003). These complexes are often resistant to microbial attack. The objective of the present work was to investigate effect of different types and concentrations of tannins extracts on extent and rate of starch fermentation. Potato starch (Merck, Darmstadt, Germany) was used as a substrate and to it three different tannin extracts were added. Chestnut tannin (F75; Tanin Sevnica, Slovenia) and tannic acid (TAK; Sigma-Aldrich, Germany) were members of hydrolysable tannins, whilst quebracho tannin (QUE; Roy Wilson Dickson, Great Britian) belongs to condensed tannin. Concentrations of added tannin extracts were control (0), 0.33 mg ml –1 medium (1), 0.67 mg ml –1 medium (2) and 1.33 mg ml –1 medium (3). In vitro gas production method was performed according to Menke and Steingass (1988). Rumen liquor was taken from two fistulated and castrated adult Jezersko-Sol čavska male sheep fed to their maintenance requirements with hay (ad libitum), compound feed (300 g dan –1 ) and vitamin-mineral supplement (50 g dan –1 ). Measurements of produced gas were taken 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 36, 48, 72 and 96 hours after the start of incubation. Gompertz model was used for the determination of total potentially gas production (B), relative degradation rate (C) and constant (A) describing the decay in relative degradation rate. First and second derivatives of Gompertz equation were used to calculate the maximum fermentation rate (MFR) and the time of maximum fermentation rate (TMFR). Compared to control (528.4 ml g –1 DM) F75 (507.8 ml g –1 DM) and QUE (474.2 ml g –1 DM) decreased total potential gas production (B) of starch (table 1). On contrary, TAK increased the total potential gas production of starch for 6% (560.5 ml g –1 DM). Fermentation of starch started (LAG) after five hours of incubation (table 2). Tannin extracts extended the LAG. Maximum fermentation rate (MFR) of starch occurred after almost 9 hours. Addition of F75, QUE and TAK extended TMFR to 10.9, 10.2 and 12.5 hours, respectively. Maximum fermentation rate of starch was very high (50.6 ml h –1 ). Addition of tannin extracts reduced MFR of starch to 42 ml h –1 (F75), 38.1 ml h –1 (TAK) and 34.7 ml h –1 (QUE). These results suggest that tannin extracts with their ability to bind to microorganisms, their enzymes and substrate alter the kinetics of in vitro starch fermentation. VIRI Bidlack, J. E./ Buxton, D. R. Content and deposition rates of cellulose, hemicellulose, and lignin during regrowth of forage grasses and legumes. Canadian Journal of Plant Science, 72(1992), 809–818. Butter N.L./ Dawson J.M., Buttery P.J. Effects of dietary tannins on ruminants. V: Secondary plant products: antinutritional and beneficial actions in animal feeding (ur.: Caygill J.C./ Mueller-Harvey I.). Nottingham, Nottingham University Press, 1999, 51–72. Hagerman A.E./ Butler L.G. Tannins and Lignins. V: Herbivores, their interaction with secondary plant metabolites (ur.: Rosenthal G.A./ Berenbaum M.R.). California, Academic Press Inc., 1991, 355–383. Haslam E. Plant polyphenols: vegetable tannins revisited. Cambridge, Cambridge University Press,1989, 230 str. Hervás G./ Frutos P./ Javier Giráldez F./ Mantecón A.R./ Álvarez Del Pino M.C. Effect of different doses of quebracho tannins extract on rumen fermentation in ewes. Animal Feed Science and Technology, 109(2003), 65–78. Huntington G.B. Starch utilization by ruminants: From basics to the bunk. Journal of Animal Science, 75(1997), 852–867. Hoover W.H./ Miller-Webster T.K. Role of sugars and starch in ruminal fermentation. V: Tri-State Dairy Nutrition Conference (ur.: Eastridge M.L.). 1998-04-21/22. Ft. Wajne, ZDA, 1998, 1–16. Jones G.A./ McAllister T.A./ Muir A.D./ Cheng K.-J. Effects of Sainfoin (Onobrychis viciifolia Scop.) condensed tannins on growth and proteolysis by four strains of ruminal bacteria. Applied and Environmental Microbiology, 60(1994)4, 1374–1378. Sivka, U. in Lavren či č, A. Potek fermentacije škroba ob dodatku razli čnih vrst taninov. 95 Kumar R./ Singh M. Tannins: Their Adverse Role in Ruminant Nutrition. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 32(1984), 447–453. Kumar R./ Vaithiyanathan S. Occurrence, nutritional significance and effect on animal productivity of tannins in tree leaves. Animal Feed Science and Technology, 30(1990), 21–38. Lavren či č A. Razgradljivost beljakovin v predželodcih prežvekovalcev. V: 9. tradicionalno posvetovanje Uporaba kostanjevega tanina v prehrani živali, Pod četrtek, 2001-03-22. Sevnica, Tanin, 2001, 39–47. Lavren či č, A./ Stefanon, B./ Susmel, P. An evaluation of the Gompertz model in degradability studies of forage chemical components. Animal Science, 64(1997), 423–431. Longland A.C./ Theodorou M.K./ Sanderson R./ Lister S.J./ Powell C.J./ Morris P. Non-starch polysaccharide composition and in vitro fermentability of tropical forage legumes varying in phenolic content. Animal Feed Science and Technology, 55(1995), 161–177. Makkar H.P.S. Effects and fate of tannins in ruminant animals, adaption to tannins, and strategies to overcome detrimental effects of feeding tannin-rich feeds. Small Ruminant Research, 49(2003), 241–256. Makkar H.P.S./ Blümmel M./ Becker K. In vitro effects of and interactions between tannins and saponins and fate of rannins in the rumen. Journal of the Science of Food and Agriculture, 69(1995), 481–493. Mangan J.L. Nutritional effects of tannins in animal feeds. Nutrition Research Reviews, 1(1988), 209–231. Martínez T.F./ McAllister T.A./ Wang Y./ Reuter T. Effects of tannic acid and quebracho tannins on in vitro ruminal fermentation of wheat and corn grain. Journal of the Science of Food and Agriculture, 86(2006), 1244–1256. McSweeney C.S./ Palmer B./ McNeill D.M./ Krause D.O. Microbial interactions with tannins: nutritional consequences for ruminants. Animal Feed Science and Technology, 91(2001), 83–93. Menke K.H./ Steingass H. Estimation of the energetic feed value obtained from chemical analysis and in vitro gas production using rumen fluid. Animal Research and Development, 28(1988), 7–55. Mole S./ Waterman P.G. Tannic acid and proteolytic enzymes: enzyme inhibition or substrate deprivation? Phytochemistry, 26(1987)1, 99–102. Nelson K.E./ Pell A.N./ Schofield P./ Zinder S. Isolation and characterization of an anaerobic ruminal bacterium capable of degrading hydrolyzable tannins. Applied and Environmental Microbiology, 61(1995)9, 3293–3298. O'Donovan L./ Brooker J.D. Effect of hydrolysable and condensed tannins on growth, morphology and metabolism of Streptococcus gallolyticus (S. caprinus) and Streptococcus bovis. Microbiology, 147(2001), 1025–1033. Perez-Maldonado R.A./ Norton B.W. The effects of condensed tannins from Desmodium intortum and Calliandra calothyrsus on protein and carbohydrate digestion in sheep and goats. British Journal of Nutrition, 76(1996), 515–533. Reed J.D. Nutritional toxicology of tannins and related polyphenols in forage legumes. Journal of Animal Science, 73(1995), 1516–1528. Roth S. Reducing methane emission and optimising N-supply in ruminants by treating feeds with tannins. Doctoral Dissertation. Achen, Schaker Verlag, 2003, 155 str. Salawu M.B./ Acamovic T./ Stewart C.S./ Hovell F.D.DeB. Quebracho tannins with or without Browse Plus (a commercial preparation of polyethylene glycol) in sheep diets: effect on digestibility of nutrients in vivo and degradation of grass hay in sacco and in vitro. Animal Feed Science and Technology, 69(1997), 67–78. Statistical Analysis Systems Institute Inc. The SAS System for Windows, Release 8.02. Cary, NC, USA, 2001. Scalbert A. Antimicrobial properties of tannins. Phytochemistry, 30(1991)12, 3875–3883. Silanikove N./ Perevolotsky A./ Provenza F.D. Use of tannin-binding chemicals to assay for tannins and their negative postingestive effects in ruminants. Animal Feed Science and Technology, 91(2001), 69–81. Singh B./ Bhat T.K./ Sharma O.P. Biodegradation of tannic acid in an in vitro ruminal sistem. Livestock Production Science, 68(2001), 259–262. Zimmer N./ Cordesse R. Digestibility and ruminal digestion of non-nitrogenous compounds in adult sheep and goats: Effects of chestnut tannins. Animal Feed Science and Technology, 61(1996), 259–273. Williams, B./ Verstegen, M.W.A./ Tamminga, S. Fermentation in the large intestine of single-stomached animals and its relationship to animal health. Nutrition Research Reviews, 14(2001), 207–227.