Rok Stojan1, Žiga Stojan2, Jure Stojan3
Holin-esteraze: struktura, delovanje ter inhibicija z naravnimi in sinteti~nimi strupi
Cholinesterases: Structure, Mechanism and Inhibition by Natural and Synthetic Poisons
IZVLEČEK
KLJUČNE BESEDE: holinesteraze, holinesteraze inhibitorji
Holin-esteraze sodelujejo pri prekinitvi prenosa signala v holinergičnih sinapsah centralnega in perifernega živčnega sistema. Doseganje visokih koncentracij encima v holinergičnih sinapsah omogoča vezava katalitskih podenot na strukturne podenote encima in njihovo usmerjanje na ustrezna mesta. 3D-struktura katalitske podenote (monomera) nam prikaže aktivno mesto, ki s svojo strukturo daje encimu učinkovitost, specifičnost in tudi različne psevdokoo-perativne sposobnosti. Zaradi življenjsko pomembne vloge je acetilholin-esteraza tarča mnogih tako naravnih kot umetno razvitih inhibitorjev. Medtem ko reverzibilni inhibitorji preprečijo vezavo substrata z vezavo v aktivno mesto, se ireverzibilni kovalentno vežejo na serin v aktivnem centru. Inhibirani encim lahko reaktiviramo, vendar je to mogoče le, dokler ne pride do delne dealkilacije vezanega inhibitorja, kar se še posebej hitro dogaja ob inhibiciji z živčnimi bojnimi strupi. Kombinacija tega pojava, ki ga imenujemo staranje, in splošnega citotoksične-ga vpliva je domnevni razlog za pozno nevrotoksičnost pri zastrupitvi z živčnimi bojnimi strupi.
293
ABSTRACT_
KEY WORDS: cholinesterases, cholinesterase inhibitors
Cholinesterases are involved in terminating nerve impulses in the central nervous system and at the periphery. The high enzyme concentration at the cholinergic synapses is achieved by oligomerization on an anchoring, collagen-like peptide. The 3D structure of a monomer shows a buried active site, which is responsible for the effectiveness and specificity of the enzyme, but also for various pseudocooperative phenomena. Due to its important role, acetylcholinesterase is a target for various inhibitors, natural as well as artificial ones. Reversible inhibitors prevent substrate accommodation by sterically blocking the active site and the irreversible ones act as acylating agents that modify the active site serine, the major participant in covalent catalysis. When irreversibly inhibited by potent nerve gases, cholinesterases can be reactivated, unless partial dealkylation of the bound inhibitor has occurred. This particular phenomenon, called aging of cholinesterases, along with generalized cytotoxic effect appear to be the cause of organophosphate-induced delayed neurotoxicity in nerve gas poisoned casualties.
1	Rok Stojan, štud. med., Inštitut za biokemijo, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Vrazov trg 2, 1000 Ljubljana.
2	Žiga Stojan, univ. dipl.inž. agr., Inštitut za biokemijo, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Vrazov trg 2, 1000 Ljubljana.
3	Prof. dr. Jure Stojan, dr.med., Inštitut za biokemijo, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Vrazov trg 2, 1000 Ljubljana.
294
UVOD
Holin-esteraze (ChE) so encimi, ki hidrolizira-jo holinske estre in katerih delovanje je zavrto v prisotnosti 10 |jmol fisostigmina (1). Vretenčarji imajo dva encima: eden od teh je sub-stratno dokaj nespecifična butirilholin-este-raza (BChE), drugi pa substratno zelo specifična acetilholin-esteraza (AChE). Fiziološka vloga prve je po mnogih desetletjih še vedno nejasna. Zdi se, da opravlja več nalog, med njimi detoksifikacijo strupenih holinskih estrov. Kljub temu pa tudi pri posameznikih s popolnoma neaktivno BChE zaradi sprememb v genu za ta encim v normalnih razmerah niso opazili nobenih kliničnih znakov. Težave pa nastopijo, če za mišično sprostitev pri operacijah teh ljudi uporabijo sukcinilholin (Leptosuccin®), ki je holinski ester in deluje kot blokator nikotinskih receptorjev, a ga cepi tudi BChE. V takih razmerah je podaljšan čas apneje po operaciji.
Po drugi strani pa je AChE življenjsko pomemben encim, saj s hidrolizo nevrotran-smitorja acetilholina konča prenos signala v holinergični sinapsi. Po vzburjenju presinap-tičnega nevrona se acetilholin sprosti iz vezi-klov v živčnem končiču v sinaptično špranjo. Mnoge molekule se reverzibilno vežejo na tarčni receptor in sprožijo depolarizacijo post-sinaptične membrane, ki lahko pripada drugemu nevronu ali pa skeletnemu mišičnemu vlaknu, če gre za motorično ploščico. Na svoji poti po sinaptični reži se večina acetilholin-skih molekul sreča z AChE, ki jih hidrolizira v neaktivna produkta acetat in holin. Manjši del acetilholinskih molekul pobegne v in-tersticij in kri, kjer jih razgradita na eritrocite vezana AChE in serumska BChE. Zelo razumljivo je torej, da akutna zastrupitev z inhibitorji AChE v centralnih in perifernih holi-nergičnih sinapsah zelo hitro pripelje do mišičnih krčev v nadaljevanju pa zaradi desenzi-bilizacije nikotinskih receptorjev do mišične ohromelosti. Vse skupaj z drugimi primarnimi (raven holinergičnih sinaps) in sekundarnimi učinki (predvsem hipoksemija) lahko povzroči smrt (2). Po drugi strani in proti vsem pričakovanjem pa miške brez AChE knock-out preživijo, saj pomanjkanje AChE nadomestijo z veliko večjo koncentracijo BChE ali drugih serumskih esteraz (3). Žuželke in
nevretenčarji imajo le eno vrsto holin-este-raz, ki tudi če so produkti več genov, kažejo katalitske lastnosti, ki so nekje med AChE in BChE. Insekticidi, pesticidi in živčni bojni strupi so zelo močni inhibitorji ChE, vendar specifični aminokislinski ostanki v aktivnih centrih pri encimih različnih izvorov močno vplivajo na njihovo občutljivost za te spojine.
STRUKTURA IN SUBSTRATI ACETILHOLIN-ESTERAZE
AChE se izraža v mnogih tkivih in različnih oblikah, ki se razlikujejo po kvartarni strukturi (4, 5). Lokalizacijo encima določi najprej proces alternativnega pripajanja (izrezovanje intronov s C-terminalnega konca primarne mRNK), v nadaljevanju pa vezava s sidrišč-nim proteinom in njegovo usmerjanje. Glavna oblika AChE, ki se izraža pri normalnih odraslih sesalcih v možganih in mišicah, se sprošča kot monomer, ki se lahko sestavi v dimere ali tetramere, ti pa so lahko prosti ali vezani na kolagenski oz. hidrofobni rep v heteroo-ligomere (6). Pri heterooligomerih je vsak tetramer povezan z eno od treh verig kolagen-skega ali s prolinom bogatega transmembran-skega sidriščnega proteina (slika 1). Monomer ima na C-terminalnem koncu s triptofani bogato amfifilno tetramerizacijsko vijačnico. Stiri triptofanske vijačnice tako tvorijo vzporedno povesmo, in sicer okoli ene verige sidrišč-nega proteina. Slednja je usmerjena antipa-ralelno in zavzame obliko levosučne vijač-nice (7). Takšno heteropentamerno supramo-lekulsko sestavo stabilizirajo štirje disulfidni mostiči; dva sta med dvema triptofanskima heliksoma, dva pa med cisteini preostalih dveh triptofanskih heliksov in sidriščnim proteinom. Heteropentamer ostane stabilen tudi, če zamenjamo cisteine, ki sodelujejo v di-sulfidnih mostičih (8).
Kinetično obnašanje ChE je nenavadno, a lastnosti niso odvisne od stopnje oligome-rizacije. Dimeri in tetrameri kažejo v delovanju enaka odstopanja od Michaelis-Mente-novega reakcijskega mehanizma kot monomer brez triptofanske tetramerizacijske vijačnice. Posredne študije z elektronsko spinsko resonanco (ESR) (9) in kasnejša razrešitev 3D-struk-ture (10) so pokazale, da leži aktivno mesto ChE na dnu ozkega grla v središču proteina.
Slika 1.3D-model heteropentamera in trije tetrameri na sidriščnem proteinu. Temna veriga - del sidriščnega proteina, svetlo - vhod vaktivno mesto.
Zdi se, da so psevdokooperativni pojavi pri vseh ChE posledica prav te nenavadne arhitekture, ki omogoča vezavo ligandov v aktivno mesto in tudi na t. i. periferno anionsko mesto ob vhodu v okoli 20 A globok lijak (slika 2).
ChE spadajo v naddružino hidrolaz alfa-beta z več kot 530 aminokislinami. Tvorijo 12 mešanih listov beta, ki so obdani s 14 al-favijačnicami in imajo nenavadno Ser-His-Glu katalitsko triado (identifikacijska koda pro-teinske baze, PDB-koda: 1EA5). Aktivno mesto AChE je posebej prilagojeno za proces hidrolize naravnega substrata acetilholina, tako da v nasprotju z BChE (11) katalitična sposobnost za substrate karboksilnih estrov z acilnimi skupinami, večjimi od propionilne, zelo upade (12). Prepojitev kristalov nativne AChE s substratnim analogom 4-oxo-N,N,N--trimetilpentanaminijem (slika 3) nam prikaže, da pri akomodaciji kvartarni amonijev ion ni vezan na neko negativno nabito 'anionsko' mesto, temveč da se kationska glava poveže s n-elektroni indolnega obroča ohranjenega triptofana. (PDB-koda: 2CF5) (13).
Poleg vseh kinetičnih posebnosti zaradi specifične zgradbe aktivnega mesta so ChE
295
Slika 2. 3D-model lijaka aktivnega mesta zacetilholinskima molekulama (PDB-koda: 2C4H, SpEAS vmesni produkt na sliki 4); Ac-Ser je acetiliran katalitski serin; temno so hidrofobni aminokislinski ostanki, ki tvorijo steno aktivnega mesta; molekuli ACh sta vstiku s triptofanoma.
Slika 3. 4-oxo-N,N,N-trimetilpentanaminij, substratni analog.
296
hidrolaze, ki delujejo s kombinacijo kislin-sko-baznega in kovalentnega mehanizma katalize (14). Vprvem delu reakcije vproce-su imenovanem acilacija delno deprotoniran serin s pomočjo His-Glu sistema napade prihajajoč substrat tako, da zamenja holinski del substrata s samim seboj. Acilirani encim, ki je kovalentni vmesni produkt reakcije, se hidro-lizira med izstopanjem alkoholne skupine iz aktivnega mesta. Za hidrolizo se porabi najbližja molekula vode, ki jo domnevno aktivira isti His-Glu sistem. Po odcepitvi se acetat sprosti zelo hitro.
Poznavanje katalitskih mehanizmov ChE po večini izhaja iz študij kinetike le-teh. Kinetični podatki so zbrani v številnih kinetičnih shemah, ki predstavljajo mehanizem reakcije. Novi predlogi se porajajo z vsakim novim odkritjem. Trenutno velja, da ima glavna kata-
litična pot pri vseh ChE vsaj tri vmesne produkte (zgornja veja na sliki 4), se pravi enega več kot klasična shema, ki jo je pred desetletji predlagal Wilson (15). Ker je aktivno mesto zakopano v notranjosti, se substrat z encimom najprej sreča na perifernem anionskem mestu, kjer se orientira za optimalno vstopanje (SpE na sliki 4). Sledi zelo usmerjeno površinsko drsenje substrata na dno aktivnega mesta (ES na sliki 4), kjer poteče dvostopenjska katali-za: nukleofilni substituciji holina za serin sledi hidroliza. Pri zelo nizkih, mikromolarnih koncentracijah substrata je sedaj encim pripravljen na nov katalitični krog (zgornja veja na sliki 4). Pri nekoliko višjih, milimolarnih koncentracijah substrata pa se med razgradnjo prve substratne molekule na periferno mesto veže še ena molekula substrata (SpES) in s tem zapre vhod/izhod žepa oz. lijaka, na dnu
Slika 4. Hidroliza substrata s ChE. E - encim, S - substrat, P - produkta, SP - substrat, vezan na periferno mesto encima. Vreakcijski shemi je sedem intermediatov, popišemo pa jo s sedmimi kinetičnimi parametri: KP - disociacijska konstanta za vezavo substrata na periferno mesto, KL in KL - porazdelitvena koeficienta, k2 in k3 - hitrostni konstanti za acetilacijo in deacetilacijo, ainb- proporcijska faktorja. Voklepajih ob posameznih intermediatih so zapisane PDB-kode kristalografsko razrešenih 3D-struktur posameznih vmesnih spojin.
Za analizo kinetičnih podatkov uporabimo iz sheme izpeljano hitrostno enačbo:
k k
^	[E ]o [S ]
, [s]	[s]	[s]2 ^ [s]l j°l
X	K K,,	K2 K„	LL K
k p	p LL p 11 + k _P
k2	[S] + k -,+JS]
1 + a—	1 + b—
v _ kcat [E]o [S]_	kp	kp
[S ] + Km	k3 kpkl
S +
1+b 151
K
p
, [s] [s ] [S]2 ^ [S ]
1+LJ-+ 1 1 +	1 + K.. K K K,, K2 K„ LL K
k p p ll p 11 + k _P-
k 1 + a 15] k3 1 + bM
K	K
p p
katerega je aktivni center. Pride do dveh nasprotnih učinkov: izstopanje alkohola je ste-rično onemogočeno (b< 1), aktivacija/orien-tacija vode za hidrolitično cepitev acetilira-nega serina pa se v zmanjšanem in zaprtem prostoru izboljša (a> 1; druga veja na sliki 4). Pri še večjih, submolarnih koncentracijah substrata pa je delovanje holin-esteraz popolnoma blokirano (EAS in SpEAS ne razpadata), saj se v acetiliranem aktivnem mestu znajdeta dve molekuli substrata: ena na dnu, druga pa na perifernem mestu (slika 2, PDB-koda: 2C4H) (13). Vse te dogodke lahko strnemo v kinetični shemi, ki jo prikazuje slika 4 (16).
Iz enačbe, ki je urejena po zgledu enačbe po Michaelisu in Maud Menten, vidimo, da sta kinetična parametra kcat in KM odvisna od koncentracije substrata. S prilagajanjem parametrov takšna enačba zelo natančno popiše spreminjanje začetne hitrosti hidrolize ace-tilholina z AChE v zelo širokem koncentracijskem razponu, kar je tudi prikazano na sliki 5 (16).
Proučevanje ChE je zanimivo z več zornih kotov, tako znanstveno-teoretičnih kot tudi praktičnih. Katalitske sposobnosti vreten-čarskih AChE so zelo visoke, saj lahko cepijo tudi do 10.000 substratnih molekul na sekundo,
297
Acetiltioholin [mM]
Slika 5. Odvisnost aktivnosti AChE, izolirane iz električnega organa električne jegulje, od koncentracije substrata.
Slika 6. Prikaz 3DD-zgradbe naravnega substrata acetilholina in fenilacetata.
298
kar si je težko predstavljati pri encimu s tako globokim in ozkim vhodom v aktivno mesto. Ravno zato se je porodila misel, da ima encim še dodaten stranski izhod za produkte (18,19). V podporo tej razlagi so v strukturi nativne AChE iz vinske mušice opazili gibanja indol-ne skupine triptofana v aktivnem mestu, ki spominjajo na odpiranje in zapiranje stranskih vrat (20, 21). Dejstvo, da so vretenčarske ChE aktivne tudi po popolni blokadi vhoda v aktivno mesto s fascikulinom II, sestavino strupa zelene mambe (22, 23), dodatno podpira hipotezo stranskih vrat (angl. back door), ki pa še vedno ni povsem priznana.
Čeprav je AChE zelo specifičen encim, je sposoben hidrolizirati številne druge estre, tako z različnimi alkoholnimi (fenilacetat, slika 6) kot tudi različnimi kislinskimi skupinami (butirilholin) (24). Medtem ko hidroliza naravnih substratov poteka s podobnimi hitrostmi skozi vse stopnje, je pri hidrolizi drugih sub-
stratov ponavadi ena stopnja omejujoča. Tako lahko te substrate razdelimo v dve skupini: tiste, ki so preveliki in zato zelo redko dosežejo prehodno stanje, kot sta npr. protitumor-sko zdravilo CPT-11 (PDB-koda: 1U65) (25) in butilrilholin (26); v drugo skupino spadajo substrati, ki so majhni, se vežejo v aktivno mesto, acilirajo serin, a se potem več ne odcepijo. Predstavniki obeh skupin so inhibitorji AChE: spojine iz prve so reverzibilni, spojine iz druge skupine pa ireverzibilni inhibitorji. Nekateri od teh inhibitorjev, ki jih pogosteje srečujemo v praksi, so prikazani v tabeli 1.
REVERZIBILNI INHIBITORJI ACHE
Lijaku podobno aktivno mesto ChE lahko sprejme številne različne molekule, če le niso prevelike. Seveda inhibicijska konstanta ni odvisna le od inhibitorja, temveč tudi od izvora
Slika 7. 3-D zgradba dekametonija in edrofonija.
Slika 8. 3-D zgradba propidija in D-tubokurarina.
encima. Zaradi sorodne zgradbe imajo vse ChE afiniteto do pozitivno nabitih ligandov s hidrofobnimi predeli. Klasičen predstavnik te skupine je tetrametilamonij, kvartarna dušikova spojina, ki je tudi del holina v molekuli acetilholina. Zasidra se, podobno kot substrat, na dno aktivnega mesta med stranski verigi triptofana in fenilalanina z vezavno konstanto v milimolarnem območju. Tudi dekametonij (slika 7), ki je sestavljen iz dveh tetrametila-monijev, povezanih z desetimi metilenskimi ponovitvami, je inhibitor AChE, toda nekaj-tisočkrat močnejši od tetrametilamonija. Kristalna struktura kompleksa kaže, da se dekametonij z eno nabito glavo veže na periferno mesto in z drugo na dno, tako da zapolni prehod do aktivnega mesta (PDB-koda: 1ACL) (27). Dekametonij je prototip rever-zibilnega inhibitorja ChE, ki premosti obe vezalni mesti in deluje v zelo nizkih koncentracijah. Njegove izpeljave, npr. E2020 (Done-pezil, Aricept®; PDB-koda: 1EVE), se uporabljajo pri lajšanju zgodnje faze Alzheimerjeve bolezni.
Drugi način za povečanje afinitete tetra-metilamonija je oponašanje celotnega holina z dodatnim povečanjem hidrofobnosti. Aro-matski kvartarni alkohol edrofonij (slika 7), ki se klinično uporablja za diagnosticiranje miastenije gravis, zavzame celotno dno aktivnega mesta, metahidroksilna skupina pa tvori vodikove vezi s Ser-His iz katalitske
triade (PDB-koda: 2ACK) (27). Tudi vtem primeru se afiniteta tisočkrat poveča.
Redkeje, a vendarle naletimo tudi na inhibitorje, ki so po svoji strukturi podobni substratu in ki se v aktivno mesto nekovalentno vežejo z afiniteto, ki je tudi deset velikostnih razredov večja od afinitete dobrih reverzibil-nih inhibitorjev. Njihova struktura je natančen odlitek aktivnega mesta in to popolnoma brez prilagajanja. To so analogi prehodnega stanja in trimetilamino-trifloro-dihidroksie-tilbenzen (PDB-koda: 1AMN) je takšna molekula, ki z atomolarno (10-15) afiniteto blokira katalitsko triado AChE (28). Kot zdravilo sicer ni uporaben, pri proučevanju ChE pa je zelo primeren za titracijsko določevanje koncentracije aktivnih mest.
Tretja skupina reverzibilnih inhibitorjev ChE so tako imenovani periferni ligandi, ki zaradi velikosti ne morejo v aktivno mesto. Ker so pozitivno nabiti, jih močan elektrostat-ski dipol okoli vhoda vleče v notranjost (29). Najbolj znani med njimi so propidij, galamin in D-tubokurarin (PDB-kode: 1N5M, 1N5R) (30, 31) (slika 8). Kurare, ki je predvsem znan po tesni vezavi na nikotinski holinergični receptor, učinkovito inhibira AChE, delovanje na konjsko BChE pa je dvojno: šibkejši trenutni inhibiciji sledi desetkrat močnejša, a počasna blokada (32). Ker je tudi reaktiva-cija po odstranitvi D-tubokurarina počasna, lahko sklepamo, da se aktivno mesto BChE
299
Slika 9. 3-D zgradba diisopropilfluorofosfata (DFP); F je fluor (angl. leaving group).
300
in D-tubokurarin po začetnem stiku konfor-macijsko prilagodita, tako da se slednji tam zagozdi.
Podobno deluje tudi fascikulin II (PDB-ko-da: 1MAH), 62 aminokislinskih ostankov dolga nevrotoksična triprsta beljakovina iz strupa zelene mambe, ki se v stehiometrič-nem razmerju veže na rob aktivnega mesta vretenčarskih AChE in tako prepreči dostop drugim ligandom (22, 33). V nasprotju s tem pa drugačne aminokisline okoli vhoda v aktivno mesto pri BChE in AChE nevretenčarjev zmanjšajo afiniteto za fascikulin II za več kot milijonkrat tako, da jim strup zelene mambe ne škodi.
IREVERZIBILNI INHIBITORJI ACHE
Snovi, ki na aktivni serin ChE prenašajo kislinske ostanke, so najmočnejša antiholin-esterazna sredstva (34). To so estri, halidi ali podobne nestabilne spojine substituirane fosforne, karbamoilne ali žveplove kisline. Mehanizmi esterifikacije so dobro proučeni in so v osnovi enaki kot pri substratih, le hidroliza acili-ranega serina je zelo počasna. Sem spadajo
insekticidi, pesticidi in kemični bojni strupi, kot so živčni bojni plini. Med vsemi antiho-lin-esteraznimi spojinami so najbolj strupeni živčni bojni strupi.
Najbolj znani med njimi so diisopropilf-luorofosfat (DFP) (slika 9), isopropil metilfos-fonofluoridat (sarin), pinacolil metilfosfono-fluoridat (soman, slika 10) in etil-N-dimetil fosforamidocianidat (tabun, slika 10). Vsi so derivati fosforne kisline, ki pri kovalentni povezavi z aktivnim serinom ChE izgubijo relativno najbolj kislo skupino, ki ji zato angleško pravimo leaving group. Pri DFP-ju je to fluorid, pri tabunu pa nitrilna skupina. Druge funkcionalne skupine so alkilne (sarin, soman), alkoksi (DFP) ali amino (tabun), lahko pa so tudi arilne kot pri etil-nitro-fenil fenil-fosfonotiolatu (EPN) ali ariloksi (EPN, para-okson).
Ce karbonilni kisik, npr. v paraoksonu, zamenjamo z žveplom (paration) ali selenom, so te spojine v razmerah in vitro neaktivne, vendar po biološki aktivaciji v telesu postanejo strupene. Ker je ta pretvorba v organizmih insektov hitrejša kot pri sesalcih, so slednji ob zastrupitvah s temi spojinami manj prizadeti.
Slika 10. 3-D zgradba somana in tabuna.
večja od koncentracije ChE. Pod takimi pogoji poteka inhibicija v dveh stopnjah: začetni reverzibilni sledi ireverzibilna. Reakcijo prikazuje slika 13.
Slika 13. Reakcijo med ChE in ireverzibilnim inhibitorjem sprikozom Slika 11. 3-D zgradbo fisostigmino - eserino, monometikorbomoil reverzibilnego vmesnega kompleksa EI, E-I je ireverzibilno inhibiron
eserolino.
encim.
Karbamati se široko uporabljajo tako kot insekticidi, pa tudi kot zdravila. Nekateri, npr. fisostigmin (eserin) (slika 11), so klinično pomembni pri diagnostiki in zdravljenju mia-stenije gravis in glavkoma. Holin-esteraze so bile opredeljene kot vse hidrolaze, ki cepijo holinske estre in jih eserin inhibira v koncentraciji 10 |jmol (35).
Najučinkovitejši karbamati imajo na dušiku eno metilno skupino, druga pa je bodisi metilna skupina bodisi vodik. V nasprotju s tem je alkoholna leaving group lahko zelo različna. Vzrok za podaljšanje dekarbamoila-cije, tj. hidrolize karbamoiliranega serina, je vodikova vez med karbamoilnim dušikom in N histidina v His-Glu sistemu (PDB-koda: 1OCE) (19).
Zelo podobni organofosfatom, a dosti manj toksični, so organosulfonati. Zato se pogosto uporabljajo pri proučevanju mehanizma, ne le ChE, ampak tudi drugih serinskih hidro-laz. Veliko študij je pokazalo prednosti spojin, kot je metansulfonilflorid (MSF) (slika 12), zaradi njegove majhnosti in ireverzibilnosti kompleksa inhibitor-encim (36-38).
Vpliv ireverzibilnih inhibitorjev se navadno vrednoti na osnovi hitrostne konstante za vezavo na encim. V večini primerov je koncentracija ireverzibilnega inhibitorja veliko
Ideja o dvostopenjskem mehanizmu temelji na zmanjševanju bimolekularne hitrostne konstante s časom (nelinearni semilogarit-mični diagrami). Nastanek reverzibilnega kompleksa je opisan z afinitetno konstanto (Ka = k-1/k+1), medtem ko je nastanek irever-zibilnega kompleksa opredeljen z acilacijsko konstanto, k2. Odnos med tema konstantama in hitrostno konstanto drugega reda je ki = k2/Ka (slika 14).
Slika 14. Enostopenjska bimolekulorno reakcijo med ChE in ireverzi-bilnim inhibitorjem.
Bimolekularna hitrostna konstanta ki je osnovni pokazatelj toksičnosti ireverzibilne-ga inhibitorja. Na preprost način jo ocenimo s pomočjo enačbe 2, ki upošteva razmerje med neinhibirano aktivnostjo in preostankom aktivnosti po predinkubaciji encima z irever-zibilnim inhibitorjem (39).
k. =
2.303 t [I]
Slika 12. 3-D zgradbo metonsulfonil florido (MSF).
[I] v enačbi 2 je koncentracija inhibitorja, v0 začetna hitrost encimske reakcije in vt hitrost po času t. Enačba velja le, če je koncentracija inhibitorja vseskozi prebitna (I >> E).
301
v
0
v
Slika 15. 3-D zgradba holina in pralidoksima.
302
Pomen velikosti bimolekularne hitrostne konstante si v grobem predstavljamo tako, da je za dosego podobnega biološkega učinka ire-verzibilnega inhibitorja z desetkrat manjšo vrednostjo konstante, treba uporabiti desetkrat višjo koncentracijo. Za uničenje mrčesa, ki se je prilagodil z mutacijo v ChE, tako potrebujemo ustrezno več insekticida.
Ireverzibilni inhibitorji reagirajo s ChE v ekvimolarnem razmerju, kar nam omogoča uporabo le-teh za določanje neznanih koncentracij encima v neočiščenem beljakovinskem preparatu. Zal pa je, zaradi nizke številčne vrednosti k, v takih razmerah hitrost vezave ireverzibilnega inhibitorja največkrat tako počasna, da popolno inhibicijo redko dosežemo. Kljub temu se 7-(metiletoksifosfonilok-si)1-metil-kinolinijev jodid (MEPQ) večkrat uporablja v te namene.
REAKTIVACIJA IN STARANJE HOLIN-ESTERAZ
Kadar so aktivna mesta encima in molekule inhibitorjev v stehiometrično istih količinah, se bo inhibicija nadaljevala, dokler ne bo prišlo do popolne izgube encimske aktivnosti. Vendar pa običajno opazimo, da kljub temu pride do manjše vrnitve encimske aktivnosti. To se lahko v razmerah in vitro zgodi spontano kot posledica interakcije s topilom ali pa tudi z namenoma dodano snovjo v raztopino inhibiranega encima, kar izkoriščamo pri zdravljenju zastrupitev z reaktivatorji AChE v razmerah in vivo. Spontana reaktivacija fos-foriliranih ChE je pod fiziološkimi pogoji zanemarljiva. Znano pa je, da lahko nukleo-filne spojine, kot sta hidroksilamin in holin (slika 15), povrnejo encimsko aktivnost (14).
E + I
E + ILG

E-I + R
E + R-I
LG
EI
E-I*
Slika 16. Procesi, ki se dogajajo pri ireverzibilni inhibiciji, spontani reaktivaciji ter reaktivaciji z reaktivatorjem in staranje ChE. E - encim, ILG - intaktni ireverzibilni inhibitor, LG - skupina, ki zapušča (angl. leaving group), I - kislinski del ireverzibilnega inhibitorja, EI - reverzibilni kompleks med encimom in ireverzibilnim inhibitorjem, E-I - ireverzibilno inaktiviran encim, E-I* - postaran encim, R - reaktivator.
Se posebej učinkovita snov je piridin-2-aldok-sim metiodid (Pralidoxim, 2-PAM, slika 15), ki je kemično oksim (40).
Večina učinkovitih reaktivatorjev ChE je podobnih holinu, ki je produkt pri hidrolizi naravnega substrata (41). Vežejo se med indol-no skupino triptofana v aktivnem mestu in Ser-His iz katalitične triade, kjer elektrofilne imino in oksimske skupine sprejmejo z aktivnega serina vezano fosforno kislino.
Leta 1955 je Hobbiger (42) opazil povezavo med izpostavljenostjo ChE organofosfatu in encimsko aktivnostjo po reaktivaciji z nu-kleofilnim aktivatorjem, saj so encimi, ki so bili dlje časa izpostavljeni inhibitorju, imeli manjšo aktivnost po reaktivaciji kot tisti, ki so bili izpostavljeni manj časa. Ta pojav je znan pod imenom staranje in velja za vse holin--esteraze, razlikuje pa se za vsak inhibitor in encim posebej. Najhitreje se stara AChE električne jegulje, če jo inhibiramo s somanom, saj je razpolovni čas le 8 sekund (43). V splošnem pa se BChE stara hitreje kot AChE.
Obstaja več teorij o mehanizmih staranja ChE (44, 45). Oosterbaan in sodelavci so predlagali, da se pri inhibiciji z DFP-jem to zgodi z odcepitvijo izopropilne skupine z organofos-fata, vezanega na serin v aktivnem mestu, kar so poimenovali dealkilacija (46). Pred kratkim so pokazali, da pri s tabunom inhibira-ni in starani mišji AChE pride do deaminacije (PDB ID-kode: 2C0P, 2C0Q) (47). V vseh kri-stalografsko dokumentiranih primerih so opazili (PDB ID-kode: 1SOM, 1VXO, 1VXR) (48) zamenjavo enega od organskih substituentov s hidroksilno skupino na z organofosfatom inhi-birani ChE, kar nakazuje, da His-Glu sistem za prenos protonov napade in hidrolizira napačno vez v kovalentnem kompleksu (PDB ID-kode: 1SOM, 1VXO, 1VXR) (48). Ko pride do staranja z organofosfati zastrupljene ChE, reaktivacija ni več mogoča. Vzrok je najbrž nastanek zelo močne vodikove vezi med Ne histidina katalitične triade in kisikom nove hidroksilne skupine po dealkilaciji. To hipotezo podpira tudi dejstvo, da se sulfonilirane ChE ne starajo, pa tudi reaktivirajo se ne.
Kadar ocenjujemo reaktivacijo ireverzibil-no inhibirane ChE, moramo biti pozorni, saj je običajno reaktivator tudi inhibitor, ki lahko reagira s substratom ali pa v reakciji s strupom tvori nov še nevarnejši inhibitor. Uspešnost
reaktivacije je torej odvisna od časa, ki je pretekel pred dodanim reaktivatorjem, od koncentracije inhibitorja in reaktivatorja, od vrste ChE in seveda splošnih pogojev, kot sta temperatura in ionska moč. Če lahko vse te vplive standardiziramo, je časovni potek reaktivacije ponavadi eksponentna krivulja, podobna, a obratna inhibicijski. Učinkovitost reaktivatorja-nukleofila pa je predstavljena z bimolekularno hitrostno konstanto, tokrat za hidrolizo ireverzibilnega inhibitorja.
POSTOPKI OB ZLORABI HOLIN-ESTERAZNIH STRUPOV
Zaradi izredno pomembne fiziološke vloge AChE je inhibicija tega encima že desetletja predmet intenzivnih raziskav. V tem času je bilo razvitih veliko zelo učinkovitih reverzibil-nih in ireverzibilnih inhibitorjev. Med vsemi so najnevarnejši organofosfati, ki že v zelo nizkih odmerkih povzročijo smrt. Pri akutnih zastrupitvah nevarnost še dodatno narašča s časom, saj pojav staranja zmanjšuje količino za reaktivacijo sposobnega encima. Pri zdravljenju žrtev je treba poleg umetne ventilacije takoj začeti s farmakološko terapijo (49). Kon-vencionalno se daje atropin vsakih nekaj ur, obenem pa tudi oksimske reaktivatorje (50). Ker sarin in tabun starata človeške encime zelo počasi, paralidoksim (2-PAM) deluje tudi nekaj ur po izpostavitvi. Nasprotno pa se s so-manom zastrupljena človeška AChE stara v minutah, zato pomaga le takojšnje samoi-njiciranje 2-PAM. Ob grozeči nevarnosti za zastrupitev z živčnimi bojnimi strupi, kot npr. med prvo zalivsko vojno, se uporablja kar-bamatna profilaksa. Zavezniške vojake so takrat sistemsko ščitili s piridostigminom, ki pa ga sedaj doktrinarno zamenjuje rekombi-nantna človeška BChE v enkratnem odmerku 200 mg (51).
V zvezi z zastrupitvijo z živčnim bojnim plinom je treba poudariti, da poleg inhibici-je AChE in posledične takojšne smrti, lahko strup poškoduje različne organe pri preživelih. Se posebej v kombinaciji s stresom privede do trajnih posledic, kot je nevarni sindrom zalivske vojne (52, 53). Naravne serumske esteraze, npr. serumska paraoksonaza, niso dovolj učinkovite, da bi preprečile akutno organofosfatno inhibicijo holin-esteraz (54),
303
niti ne morejo varovati pred zakasnelo nevro-toksičnostjo (55).
Inhibitorji ChE so tudi zelo zanimiva teroristična sredstva. Večina enostavno dostopnih insekticidov in pesticidov seveda ni tako učinkovitih kot leta 1995 v Tokiu uporabljeni sarin. Toda ogromne količine zaščitnih fito-farmacevtskih sredstev za uničenje vse bolj odpornih škodljivcev (tabela 1) kljub poostre-
nemu nadzoru prodaje postajajo vse večja grožnja tudi na tem področju.
ZAHVALA
Delo je bilo delno opravljeno v okviru projekta 'Znanost za mir', ki ga je v letih 2006-08 financiralo Ministrstvo za obrambo Republike Slovenije.
Tabela 1. Nekateri pogosto uporabljeni insekticidi, fungicidi, herbicidi in repelenti.
304
	Strukturna formula	Kemijska skupina	Delovanje	Trgovsko ime
INSEKTICIDI Imidakloprid	JO^V" Cr N N - NO,	Kloronikotinil	listne uši, hmeljeve uši, koloradski hrošč	CONFIDOR SL 200
Tiakloprid	. 1 1 XTv CK N N-CN	Kloronikotinil	listni zavrtači, zavijači	CALYPSO SC 480
Primikarb	C", H3C^L^O-C-N(CH3), I T O NyN N(CH,),	Karbamat	listne uši	PIRIMOR 50WG
Diazinon	,OC,HS NyN HC -CH, i 3 CH,	Tioorganofosfat	kapar, uši, pršice, resarja, bolšice, bolhači, molji	DIAZINON 20
FUNGICIDI Propineb	r s s -i -Zn-S-C-NH-CHrCH-NH-Č-S- L CH, Jx	Ditiokarbamat	peronospora, krompirjeva in čebulna plesen	ANTRACOL WG 70
Ditianon	O a^N O	Kinon	škrlup, breskova kodravost, črna pegavost	DELAN 700WG
	Strukturna formula	Kemijska skupina	Delovanje	Trgovsko ime
Fenheksamid	OH	Cikloheksano-karboksiamid	sadna gniloba, cvetna monilija, siva plesen	TELDOR SC 500
HERBICIDI Glifosat	O HOOC-CH,— NH — CH2 — P - OH OH	Organofosforni glicin	uničuje zelene dele rastlin	BOOM EFEKT
Metamitron	-nh2 N-^CH'	Triazinon	dotikalno, talni zatiralec plevelov	GOLTIX WG 90
Rimsulfuron	^vso2ch2ch5 och3 L 1 k 3 t^so2-nhcnh —t ^ n=4h,	Sulfonat	zatiranje večletnih plevelov v koruzi	TAROT 25 WG
REPELENTI Metiokarb	H,C O H h'c-s^^-0-c-n-ch, H,C	Karbamat	repelent in odvrača ptice od mladih rastlin	MESUROL FS-500
Icaridin	/—V 0 < N"C" CH 3 \_( —CH —CH2—CH, CH —CH —OH	Karbamat	mrčes	AUTAN
Dietiltoluamid	CH, &Cr C ch2ch, 0	Amid	mrčes	PIPS BIBAN DEET
305
LITERATURA
1.	Usdin E. In: Karczmar AG, ed. Anticholinesterase Agents. Oxford: Pergamon Press; 1970. p. 61.
2.	Taylor P. Anticholinesterase Agents. In: Hardman JG, Limbird LE, eds. Goodman&Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics. 10th ed. New York: McGraw-Hill Press; 2001. p. 184.
3.	Xie W, Stribley JA, Chatonnet A, et al. Postnatal developmental delay and supersensitivity to organophosphate in gene-targeted mice lacking acetylcholinesterase. J Pharmacol Exp Ther 2000; 293 (3): 896-902.
4.	Dudai Y, Herzberg M, Silman I. Molecular structures of acetylcholinesterase from electric organ tissue of the electric eel. Proc Natl Acad Sci USA 1973; 70: 2473-6.
5.	Silman I, Futerman AH. Modes of attachment of acetylcholinesterase to the surface membrane. Eur J Biochem 1987; 170: 11-22.
6.	Inestrosa NC, Roberts WL, Marshall TL, et al. Acetylcholinesterase from bovine caudate nucleus is attached to membranes by a novel subunit distinct from those of acetylcholinesterases in other tissues. J Biol Chem 1987; 262: 4441-4.
7.	Dvir H, Harel M, Bon S, et al. The synaptic acetylcholinesterase tetramer assembles around a polyproline II helix. EMBO J 2004; 23 (22): 4394-405.
8.	Bon S, Ayon A, Leroy J, et al. Trimerization domain of the collagen tail of acetylcholinesterase. Neurochem Res 2003; 28: 523-35.
9.	Sentjurc M, Stalc A, Zupančič AO. On the location of active serines of membrane acetylcholinesterase studied by the ESR method. Biochim Biophys Acta 1976; 438 (1): 131-7.
10.	Sussman JL, Harel M, Frolow F, et al. Atomic structure of acetylcholinesterase from Torpedo californica: a prototypic acetylcholine-binding protein. Science 1991; 253: 872-9.
11.	Nicolet Y, Lockridge O, Masson P, et al. Crystal structure of human butyrylcholinesterase and of its complexes with substrate and products. J Biol Chem 2003; 278 (42): 41141-7.
12.	Rosenberry TL. Acetylcholinesterase. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol 1975; 43: 103-218.
13.	Colletier JP, Fournier D, Greenblatt HM, et al. Structural insights into substrate traffic and inhibition in acetylcholinesterase. EMBO J 2006; 25 (12): 2746-56.
14.	Krupka RM. Chemical structure and function of the active center of acetylcholinesterase. Biochemistry 1996;
__5 (6): 1988-97.
306 15. Wilson IB. Acetylcholinesterase. XI. Reversibility of tetraethyl pyrophosphate inhibition. J Biol Chem 1951; 190 (1): 111-7.
16.	Stojan J, Brochier L, Alies C, et al. Inhibition of Drosophila melanogaster acetylcholinesterase by high concentrations of substrate. Eur J Biochem 2004; 271 (7): 1364-71.
17.	Stojan J. Rational polynomial equation helps to select among homeomorphic kinetic models for cholinesterase reaction mechanism. Chem Biol Interact 2005; 157-158: 173-9.
18.	Gilson MK, Straatsma TP, McCammon JA, et al. Open »back door« in a molecular dynamics simulation of acetylcholinesterase. Science 1994; 263 (5151): 1276-8.
19.	Bartolucci C, Perola E, Cellai L, et al. »Back door« opening implied by the crystal structure of a carbamoylated acetylcholinesterase. Biochemistry 1999; 38(18): 5714-9.
20.	Harel M, Kryger G, Rosenberry TL, et al. Three-dimensional structures of Drosophila melanogaster acetylcho-linesterase and of its complexes with two potent inhibitors. Protein Sci 2000; 9 (6): 1063-72.
21.	Nachon F, Stojan J, Fournier D. Insights into substrate and product traffic in the Drosophila melanogaster acetylcholinesterase active site gorge by enlarging a back channel. FEBS J 2008; 275 (10): 2659-64.
22.	Rosenberry TL, Rabl CR, Neumann E. Binding of the neurotoxin fasciculin 2 to the acetylcholinesterase peripheral site drastically reduces the association and dissociation rate constants for N-methylacridinium binding to the active site. Biochemistry 1996; 35 (3): 685-90.
23.	Goličnik M, Stojan J. Multi-step analysis as a tool for kinetic parameter estimation and mechanism discrimination in the reaction between tight-binding fasciculin 2 and electric eel acetylcholinesterase. Biochim Biophys Acta 2002; 1597 (1): 164-72.
24.	Krupka RM. Hydrolysis of neutral substrates by acetylcholinesterase. Biochemistry 1966; 5 (6): 1983-8.
25.	Harel M, Hyatt JL, Brumshtein B, et al. The 3D structure of the anticancer prodrug CPT-11 with Torpedo californica acetylcholinesterase rationalizes its inhibitory action on AChE and its hydrolysis by butyrylcholinesterase and carboxylesterase. Chem Biol Interact 2005; 157-158: 153-7.
26.	Harel M, Sussman JL, Krejci E, et al. Conversion of acetylcholinesterase to butyrylcholinesterase: modeling and mutagenesis. Proc Natl Acad Sci USA 1992; 89 (22): 10827-31.
27.	Harel M, Schalk I, Ehret-Sabatier L, et al. Quaternary ligand binding to aromatic residues in the active-site gorge of acetylcholinesterase. Proc Natl Acad Sci USA 1993; 90 (19): 9031-5.
28.	Brodbeck U, Schweikert K, Gentinetta R, et al. Fluorinated aldehydes and ketones acting as quasi-substrate inhibitors of acetylcholinesterase. Biochim Biophys Acta 1979; 567 (2): 357-69.
29.	Ripoll DR, Faerman CH, Axelsen PH, et al. (1993) An electrostatic mechanism for substrate guidance down the aromatic gorge of acetylcholinesterase. Proceedings of the Natl Acad Sci USA 1993; 90 (11): 5128-32.
30.	Bourne Y, Taylor P, Radic Z, et al. Structural insights into ligand interactions at the acetylcholinesterase peripheral anionic site. EMBO J 2003; 22 (1): 1-12.
31.	Changeux JP. Responses of acetylcholinesterase from Torpedo marmorata to salts and curarizing drugs. Mol Pharmacol 1966; 2 (5): 369-92.
32.	Stojan J, Pavlic MR. On the inhibition of cholinesterase by D-tubocurarine. Biochim Biophys Acta 1991; 1079 (1): 96-102.
33.	Bourne Y, Taylor P, Marchot P. Acetylcholinesterase inhibition by fasciculin: crystal structure of the complex. Cell 1995; 83 (3): 503-12.
34.	Kitz RJ, Ginsburg S, Wilson IB. The reaction of acetylcholinesterase with O-dimethylcarbamyl esters of quaternary quinolinium compounds. Biochem Pharmacol 1967; 16 (11): 2201-9.
35.	Engelhard N, Prchal K, Nenner M. Acetylcholinesterase. Angew Chem Int Ed Engl 1967; 6 (7): 615-26.
36.	Metzger HP, Wilson IB. The acceleration of the acetylcholinesterase catalyzed hydrolysis of acetyl fluoride. Biochem Biophys Res Commun 1967; 28 (2): 263-9.
37.	Pavlic MR. On the nature of the acceleration of the methanesulfonylation of acetylcholinesterase by tetraethy-lammonium. Biochim Biophys Acta 1973; 327 (2): 393-7.
38.	Golicnik M, Fournier D, Stojan J. Acceleration of Drosophila melanogaster acetylcholinesterase methanesulfonylation: peripheral ligand D-tubocurarine enhances the affinity for small methanesulfonylfluoride. Chem Biol Interact 2002; 139 (2): 145-57.
39.	Aldridge WN. Some properties of specific cholinesterase with particular reference to the mechanism of inhibition by diethyl-p-nitrophenyl triphosphate (E605) and analogues. Biochem J 1950; 46: 451-60.
40.	Wilson IB, Ginsburg S. A powerful reactivator of alkylphosphate-inhibited acetylcholinesterase. Biochim Biophys Acta 1955; 18: 168-70.
41.	Musilek K, Kuca K, Jun D, et al. Synthesis of a novel series of bispyridinium compounds bearing a xylene linker and evaluation of their reactivation activity against chlorpyrifos-inhibited acetylcholinesterase. J Enzyme Inhib Med Chem 2005; 20 (5): 409-15.
42.	Hobbiger F. Effect of nicotinhydroxamic acid methiodide on human plasma cholinesterase inhibited by orga-nophosphates containing a dialkylphosphato group. Br J Pharmacol Chemother. 1955; 10 (3): 356-62.	_
43.	Michel HO, Hackley BE Jr, Berkowitz L, et al. Ageing and dealkylation of Soman (pinacolylmethylphosphono 307 fluoridate)-inactivated eel cholinesterase. Arch Biochem Biophys 1967; 121 (1): 29-34.
44.	Wagner-Jauregg T, Hackley BE Jr. Model reactions of phosphorus-containing enzyme inactivators. III. Interaction of imidazole, pyridine and some of their derivates with dialkyl halogeno-phosphates. J Am Chem Soc 1953; 75: 2125-30.
45.	Davies DR, Green AL. The kinetics of reactivation by oximes of cholinesterase inhibited by organophosphorus compounds. Biochem J 1956; 63: 520-35.
46.	Oosterbaan RA, Warringa MGPJ, Jansz HS, et al. The reaction of pseudocholinesterase with diisopropyl phosp-horofluoridate (DFP). Abstracts of IV International Congress of Biochemistry 1958, 4, p. 38.
47.	Ekstrom F, Akfur C, Tunemalm AK, et al. Structural changes of phenylalanine 338 and histidine 447 revealed by the crystal structures of tabun-inhibited murine acetylcholinesterase. Biochemistry 2006; 45 (1): 74-81.
48.	Millard CB, Koellner G, Ordentlich A, et al. Reaction Products of Acetylcholinesterase and VX Reveal a Mobile Histidine in the Catalytic Triad. J Am Chem Soc 1999; 121: 9883-4.
49.	de Jong RH. Nerve gas terrorism: a grim challenge to anesthesiologists. Anesth Analg 2003; 96 (3): 819-25.
50.	Kuca K, Bartosova L, Kassa J, et al. Comparison of the potency of newly developed and currently available oximes to reactivate nerve agent-inhibited acetylcholinesterase in vitro and in vivo. Chem Biol Interact 2005; 157-158: 367-8.
51.	Cerasoli DM, Griffiths EM, Doctor BP, et al. In vitro and in vivo characterization of recombinant human butyrylc-holinesterase (Protexia) as a potential nerve agent bioscavenger. Chem Biol Interact 2005; 157-158: 363-5.
52.	Loewenstein-Lichtenstein Y, Schwarz M, Glick D, Norgaard-Pedersen B, et al. Genetic predisposition to adverse consequences of anti-cholinesterases in 'atypical' BCHE carriers. Nat Med 1995; 1 (10): 1082-5.
53.	Moss JI. Many Gulf War illnesses may be autoimmune disorders caused by the chemical and biological stressors pyridostigmine bromide, and adrenaline. Med Hypotheses 2001; 56 (2): 155-7.
54.	Amitai G, Gaidukov L, Adani R, et al. Enhanced stereoselective hydrolysis of toxic organophosphates by directly evolved variants of mammalian serum paraoxonase. FEBS J 2006; 273 (9): 1906-19.
55.	Damodaran TV, Abou-Donia MB. Alterations in levels of mRNAs coding for glial fibrillary acidic protein (GFAP) and vimentin genes in the central nervous system of hens treated with diisopropyl phosphorofluoridate (DFP). Neurochem Res 2000; 25 (6): 809-16.
Prispelo 1.6.2008