102 ■ Proteus 84/3 • November 2021 103Vloga proteinov na površini rakavih celic pri odkrivanju in zdravljenju rakavih obolenj • MedicinaMedicina • Vloga proteinov na površini rakavih celic pri odkrivanju in zdravljenju rakavih obolenj Rakava obolenja so v sodobni družbi zelo pogosta – za rakom umre vsak šesti človek na Zemlji (Roth, 2018). V letu 2018 je to pomenilo 9,6 milijona ljudi na leto, kar je več, kot jih je umrlo za aidsom, tuberkulozo in malarijo skupaj (Ferlay, Colombet, Soer- jomataram, Mathers, Parkin, Piñeros, Zna- or, Bray, 2019). Tudi številke za prihodnost niso obetavne. V Veliki Britaniji ocenjujejo, da bo za rakom zbolel vsak drugi človek, rojen po letu 1960 (Cancer Research UK). A dobra novica je, da se umrljivost zaradi raka niža. V Veliki Britaniji poročajo, da več kot deset let od diagnoze preživi že po- lovica ljudi, kar je dvakrat toliko kot pred štiridesetimi leti (Cancer Research UK). Podobne trende glede naraščanja števila obolelih za rakom in nižanja umrljivosti je mogoče opaziti tudi v Sloveniji (Zadnik in sod., 2017). Večje število odkritih obolenj in višjo stopnjo preživetja so omogočili novi diagnostični in terapevtski pristopi, ključ do teh pa je napredek v razumevanju procesov, povezanih z nastankom in razvojem rakavih obolenj. Medtem ko so v preteklosti obstajale različ- ne bolj ali manj nenavadne teorije o vzroku za nastanek raka, danes vemo, da je njegov nastanek povezan z različnimi okoljskimi in dednimi dejavniki, do neke mere pa vseh potencialnih dejavnikov oziroma njihove kombinacije še ne znamo pojasniti (Toma- setti, Vogelstein, 2015). Rakavo obolenje nastane, ko naše lastne celice naberejo zado- stno število sprememb dednine, imenovanih mutacije, ki jim omogočajo nenadzorovano deljenje in kasneje razraščanje. Pomembno je, kje se mutacije nahajajo – najbolj pro- blematične mutacije so v genih, ki skrbijo za regulacijo celičnega cikla in odpravljanje napak v dednini. Do mutacij sicer naključ- no prihaja ves čas, tudi v idealno zdravem okolju, nezdravi način življenja (na primer kajenje, nezdrava prehrana, preveč inten- zivno sončenje) pa dodatno prispeva k po- višanemu številu mutacij in s tem povišani verjetnosti za nastanek neugodnega skupka mutacij. Kadar govorimo o dednih dejavni- kih, želimo poenostavljeno povedati, da ima posameznik nekatere neugodne mutacije že v svojem dednem zapisu. Katere pa so pravzaprav tiste lastnosti, ki jih mora celica pridobiti, da lahko nastane rakavo obolenje? Znanstveniki so opredelili osem lastnosti, ki so skupne celicam v veči- ni rakastih tvorb (slika 1) (Hanahan, Wein- berg, 2011): lastna proizvodnja molekul, ki spodbujajo rast; neobčutljivost za molekule, ki zavirajo rast; reprogramiranje celičnega metabolizma; izogibanje celični smrti (apop- tozi ali avtofagiji); izogibanje odzivu imun- skega sistema; sposobnost neomejenega pod- vajanja; zmožnost tvorbe žil znotraj tumorja in vraščanje v okolno tkivo ter sposobnost tvorbe zasevkov (metastaz). Vrstni red pri- dobivanja teh lastnosti je lahko različen, kljub temu pa lahko proces razvoja rakavih obolenj razdelimo v nekaj stopenj oziroma stadijev. Rakava obolenja so v prvem stadiju tako manjša in omejena na tkivo, v katerem so nastala. V drugem stadiju so rakava obo- lenja že večja, še vedno omejena na mesto nastanka, v nekaterih primerih pa se ta obo- lenja razširijo tudi na bezgavke v bližini. V tretjem stadiju se rakavo obolenje začne raz- raščati v tkiva v svoji okolici, pri čemer so rakave celice tudi v bezgavkah. V zadnjem, četrtem stadiju pride do tvorbe zasevkov in nastanka sekundarnih rakavih obolenj dru- god po telesu. Stadij, v katerem rakavo obo- lenje odkrijemo, je za možnost ozdravitve ključnega pomena. Na primer, bolnica ima kar devetdeset odstotkov možnosti, da bo po odkritju raka na dojki v zgodjem stadiju živela vsaj še pet let, v primeru kasnejšega odkritja že napredovanega obolenja pa je ta verjetnost zgolj pet- do petnajstodstotna (Cancer Research UK). Pomembno je to- rej, da rakavo obolenje odkrijemo čimprej, ključ do tega pa je podrobno poznavanje značilnosti rakavih celic, saj jih le tako lah- ko zanesljivo in dovolj zgodaj prepoznamo in bolezen primerno zdravimo z ustreznimi tarčnimi terapijami. Proteini na površini rakavih celic Ocenjujejo, da petindvajset do trideset od- stotkov genov nosi zapis za membranske proteine, od katerih je približno polovica takih, ki se nahajajo na površini celic (Ba- usch-Fluck, Goldmann, Müller, van Oo- strum, Müller, Schubert, Wollscheid, 2018). Nekateri so takšni, ki so skupni večini celic, spet drugi pa so značilni samo za določeni tip celic. Tako se med diferenciacijo/dedife- renciacijo nabor in količna izraženih prote- inov na površini rakavih in normalnih celic razlikujeta. Na površini rakavih celicah se lahko pojavijo novi proteini, ki za normalno celico sicer niso značilni, prav tako lahko ni nekaterih proteinov, značilnih za izvorni tip celice, lahko pa se zgolj poveča število ne- katerih proteinov na površini ali pa pride do mutacij proteina oziroma se spremenijo nji- hove postranslacijske modifikacije: to so ke- mijske modifikacije aminokislinskih ostan- kov, do katerih pride po prevedbi dednega zapisa v aminokislinsko zaporedje (slika 2). Spremembe ravni izražanja ali posttransla- cijske modif ikacije proteinov na površini rakavih celicah v primerjavi z zdravimi ce- licami uporabljajo tako za diagnostiko kot tudi za zdravljene raka. Glede na funkcijo lahko proteine na povr- šini celic razdelimo v več skupin. Najbolj raziskana skupina so transmembranski re- ceptorji, ki celici omogočajo komunikacijo z okoljem. Za rakave celice so posebnega pomena receptorji za različne rastne dejav- nike, ki so na površini rakavih celic bodisi pretirano izraženi ali pa so spremenjeni ta- ko, da so aktivni tudi v odsotnosti rastne- ga dejavnika, kar vodi do zvišane stopnje Vloga proteinov na površini rakavih celic pri odkrivanju in zdravljenju rakavih obolenj Aljaž Gaber, Uroš Prešern, Špela Konjar, Miha Pavšič Slika 1: Lastnosti rakavih celic. Prirejeno po Hanahan, Weinberg, 2011. 102 ■ Proteus 84/3 • November 2021 103Vloga proteinov na površini rakavih celic pri odkrivanju in zdravljenju rakavih obolenj • MedicinaMedicina • Vloga proteinov na površini rakavih celic pri odkrivanju in zdravljenju rakavih obolenj Rakava obolenja so v sodobni družbi zelo pogosta – za rakom umre vsak šesti človek na Zemlji (Roth, 2018). V letu 2018 je to pomenilo 9,6 milijona ljudi na leto, kar je več, kot jih je umrlo za aidsom, tuberkulozo in malarijo skupaj (Ferlay, Colombet, Soer- jomataram, Mathers, Parkin, Piñeros, Zna- or, Bray, 2019). Tudi številke za prihodnost niso obetavne. V Veliki Britaniji ocenjujejo, da bo za rakom zbolel vsak drugi človek, rojen po letu 1960 (Cancer Research UK). A dobra novica je, da se umrljivost zaradi raka niža. V Veliki Britaniji poročajo, da več kot deset let od diagnoze preživi že po- lovica ljudi, kar je dvakrat toliko kot pred štiridesetimi leti (Cancer Research UK). Podobne trende glede naraščanja števila obolelih za rakom in nižanja umrljivosti je mogoče opaziti tudi v Sloveniji (Zadnik in sod., 2017). Večje število odkritih obolenj in višjo stopnjo preživetja so omogočili novi diagnostični in terapevtski pristopi, ključ do teh pa je napredek v razumevanju procesov, povezanih z nastankom in razvojem rakavih obolenj. Medtem ko so v preteklosti obstajale različ- ne bolj ali manj nenavadne teorije o vzroku za nastanek raka, danes vemo, da je njegov nastanek povezan z različnimi okoljskimi in dednimi dejavniki, do neke mere pa vseh potencialnih dejavnikov oziroma njihove kombinacije še ne znamo pojasniti (Toma- setti, Vogelstein, 2015). Rakavo obolenje nastane, ko naše lastne celice naberejo zado- stno število sprememb dednine, imenovanih mutacije, ki jim omogočajo nenadzorovano deljenje in kasneje razraščanje. Pomembno je, kje se mutacije nahajajo – najbolj pro- blematične mutacije so v genih, ki skrbijo za regulacijo celičnega cikla in odpravljanje napak v dednini. Do mutacij sicer naključ- no prihaja ves čas, tudi v idealno zdravem okolju, nezdravi način življenja (na primer kajenje, nezdrava prehrana, preveč inten- zivno sončenje) pa dodatno prispeva k po- višanemu številu mutacij in s tem povišani verjetnosti za nastanek neugodnega skupka mutacij. Kadar govorimo o dednih dejavni- kih, želimo poenostavljeno povedati, da ima posameznik nekatere neugodne mutacije že v svojem dednem zapisu. Katere pa so pravzaprav tiste lastnosti, ki jih mora celica pridobiti, da lahko nastane rakavo obolenje? Znanstveniki so opredelili osem lastnosti, ki so skupne celicam v veči- ni rakastih tvorb (slika 1) (Hanahan, Wein- berg, 2011): lastna proizvodnja molekul, ki spodbujajo rast; neobčutljivost za molekule, ki zavirajo rast; reprogramiranje celičnega metabolizma; izogibanje celični smrti (apop- tozi ali avtofagiji); izogibanje odzivu imun- skega sistema; sposobnost neomejenega pod- vajanja; zmožnost tvorbe žil znotraj tumorja in vraščanje v okolno tkivo ter sposobnost tvorbe zasevkov (metastaz). Vrstni red pri- dobivanja teh lastnosti je lahko različen, kljub temu pa lahko proces razvoja rakavih obolenj razdelimo v nekaj stopenj oziroma stadijev. Rakava obolenja so v prvem stadiju tako manjša in omejena na tkivo, v katerem so nastala. V drugem stadiju so rakava obo- lenja že večja, še vedno omejena na mesto nastanka, v nekaterih primerih pa se ta obo- lenja razširijo tudi na bezgavke v bližini. V tretjem stadiju se rakavo obolenje začne raz- raščati v tkiva v svoji okolici, pri čemer so rakave celice tudi v bezgavkah. V zadnjem, četrtem stadiju pride do tvorbe zasevkov in nastanka sekundarnih rakavih obolenj dru- god po telesu. Stadij, v katerem rakavo obo- lenje odkrijemo, je za možnost ozdravitve ključnega pomena. Na primer, bolnica ima kar devetdeset odstotkov možnosti, da bo po odkritju raka na dojki v zgodjem stadiju živela vsaj še pet let, v primeru kasnejšega odkritja že napredovanega obolenja pa je ta verjetnost zgolj pet- do petnajstodstotna (Cancer Research UK). Pomembno je to- rej, da rakavo obolenje odkrijemo čimprej, ključ do tega pa je podrobno poznavanje značilnosti rakavih celic, saj jih le tako lah- ko zanesljivo in dovolj zgodaj prepoznamo in bolezen primerno zdravimo z ustreznimi tarčnimi terapijami. Proteini na površini rakavih celic Ocenjujejo, da petindvajset do trideset od- stotkov genov nosi zapis za membranske proteine, od katerih je približno polovica takih, ki se nahajajo na površini celic (Ba- usch-Fluck, Goldmann, Müller, van Oo- strum, Müller, Schubert, Wollscheid, 2018). Nekateri so takšni, ki so skupni večini celic, spet drugi pa so značilni samo za določeni tip celic. Tako se med diferenciacijo/dedife- renciacijo nabor in količna izraženih prote- inov na površini rakavih in normalnih celic razlikujeta. Na površini rakavih celicah se lahko pojavijo novi proteini, ki za normalno celico sicer niso značilni, prav tako lahko ni nekaterih proteinov, značilnih za izvorni tip celice, lahko pa se zgolj poveča število ne- katerih proteinov na površini ali pa pride do mutacij proteina oziroma se spremenijo nji- hove postranslacijske modifikacije: to so ke- mijske modifikacije aminokislinskih ostan- kov, do katerih pride po prevedbi dednega zapisa v aminokislinsko zaporedje (slika 2). Spremembe ravni izražanja ali posttransla- cijske modif ikacije proteinov na površini rakavih celicah v primerjavi z zdravimi ce- licami uporabljajo tako za diagnostiko kot tudi za zdravljene raka. Glede na funkcijo lahko proteine na povr- šini celic razdelimo v več skupin. Najbolj raziskana skupina so transmembranski re- ceptorji, ki celici omogočajo komunikacijo z okoljem. Za rakave celice so posebnega pomena receptorji za različne rastne dejav- nike, ki so na površini rakavih celic bodisi pretirano izraženi ali pa so spremenjeni ta- ko, da so aktivni tudi v odsotnosti rastne- ga dejavnika, kar vodi do zvišane stopnje Vloga proteinov na površini rakavih celic pri odkrivanju in zdravljenju rakavih obolenj Aljaž Gaber, Uroš Prešern, Špela Konjar, Miha Pavšič Slika 1: Lastnosti rakavih celic. Prirejeno po Hanahan, Weinberg, 2011. 104 ■ Proteus 84/3 • November 2021 105Vloga proteinov na površini rakavih celic pri odkrivanju in zdravljenju rakavih obolenj • MedicinaMedicina • Vloga proteinov na površini rakavih celic pri odkrivanju in zdravljenju rakavih obolenj celičnih delitev. Primer takega receptorja je receptor za epidermalni rastni dejavnik (EGFR), katerega izražanje ali delovanje sta pogosto deregulirana pri različnih tipih raka (Sigismund, Avanzato, Lanzetti, 2018). Me- hanizem delovanja receptorja za epidermal- ni rastni dejavnik temelji na interakciji med dvema proteinoma receptorja za epidermalni rastni dejavnik - dimerizaciji receptorja po vezavi zunajceličnega rastnega dejavnika, te- mu pa sledi avtofosforilacija (proces prenosa fosforilne skupine na aminokislinske ostan- ke istega proteina, ki katalizira reakcijo) znotrajcelične domene in sprožitev signal- ne kaskade, ki vodi v rast in delitev celic, zaviranje celične smrti in povečanje celične gibljivosti. Ob vezavi rastnega dejavnika se lahko receptor za epidermalni rastni dejav- nik poveže tudi z ostalimi tremi receptor- ji iz iste družine – najbolj poznan tovrstni partner je receptor HER2, ki je mutiran ali pretirano izražen v približno petindvajsetih odstotkih primerov raka dojke (Ishikawa, Ichikawa, Shimizu, Sasaki, Tanabe, Chis- hima, Takabe, Endo, 2014). Tako receptor za epidermalni rastni dejavnik kot receptor HER2 spadata med receptorske tirozin ki- naze, saj njuni znotrajcelični regiji vsebujeta kinazno domeno, ki fosforilira tirozinske ostanke. Vloga te skupine receptorjev pri razvoju raka je do sedaj ena izmed najbolj preučenih, vendar pa trenutne raziskave ka- žejo tudi na pomembno vlogo receptorjev iz drugih skupin, kot so receptorske serin/tre- onin kinaze (na primer receptor za TGF-β), receptorji, sklopljeni s kinazami Janus (na primer receptor za eritropoetin), z G-prote- ini sklopljeni receptorji ter receptorji signal- nih poti Wnt, Notch, Hedgehog in tako dalje. Pomembno vlogo pri razvoju raka imajo tudi adhezijski proteini, ki sodelujejo pri tvorbi celičnih stikov in pritrjevanju celic na zunaj- celični matriks, saj je njihova (de)regulacija povezana z invazivnostjo ter napredovanjem rakavih celic v okolna in tudi bolj oddaljena tkiva. Pomembni predstavniki adhezijskih proteinov so proteini iz razreda integrinov (Bianconi, Unseld, Prager, 2016). Ti tvori- jo heterodimere, ki se na zunajcelični strani pritrjujejo na različne komponente zunajce- ličnega matriksa, na notranji strani celic pa na citoskelet (notranje celično ogrodje). So- delujejo tudi pri prenosu signalov iz okoli- ce v notranjost celic in obratno, pri čemer lahko celica z različnimi mehanizmi vpliva na njihovo sposobnost pritrjevanja, s tem pa uravnava lastno gibljivost in premikanje. Zanimiv primer je tudi epitelijska celična adhezijska molekula (EpCAM), ki je, v pri- merjavi z normalnimi epitelijskimi celicami, prisotna v povečani količini na površini ve- čine rakavih celic epitelijskega izvora (karci- nomov). Dolgo časa je veljalo, da tudi epi- telijska celična adhezijska molekula sodeluje pri tvorbi celičnih stikov, vendar se je pred kratkim pokazalo, da temu ni tako. Vloga epitelijske celične adhezijske molekule v ra- ku je verjetno bolj povezana z njeno funkcijo pri celičnem signaliziranju, saj epitelijska ce- lična adhezijska molekula oziroma njeni po- samezni deli sodelujejo v različnih signalnih poteh (Gaber, Lenarčič, Pavšič, 2020). Z invazivno naravo rakavih celic in sposob- nostjo metastaziranja so poleg adhezijskih molekul povezani tudi številni encimi, ki delujejo na površini celic, pri čemer gre v glavnem za različne tipe proteaz (na primer proteaze iz družine ADAM), ki z remode- liranjem zunajceličnega matriksa omogočajo celicam pobeg iz lokalnega okolja (Raka- shanda, Rana, Rafiq, Masood, Amin, 2012). Hkrati je njihovo proteolitično delovanje povezano z razvojem krvnih žil v tumorju (angiogeneza), sodelujejo pa tudi pri spro- ščanju rastnih dejavnikov iz površine celic in s komponentami zunajceličnega matriksa, kar dodatno pripomore k povečani prolife- raciji celic. Pomembni značilnosti rakavih celic sta tu- di deregulirani celični metabolizem in s tem povezano spremenjeno izražanje raz- ličnih transportnih proteinov, udeleženih pri vnosu hranil in iznosu za celico neže- lenih snovi. Rakave celice imajo namreč visoke energijske zahteve, kar je posledica pospešene rasti in z njo povezane sinteze različnih celičnih komponent. Na primer, pogosto imajo na površini neobičajno veliko količino prenašalcev iz družine GLUT, ki omogočajo vnos glukoze v notranjost celic. Drugi tip prenašalcev, ki pomembno vpli- vajo na potek zdravljenja raka, so nekateri predstavniki družine prenašalcev ABC (na primer MRP1), ki prek aktivnega transporta odstranjujejo citostatike iz notranjosti celic, posledično pa je njihovo povečano izražanje povezano z zmanjšanim učinkom kemotera- pije (Zhang, Wang, Gupta, Chen, 2015). Vloga proteinov na površini pri odkrivanju in spremljanju rakavih obolenj Kljub omenjenim značilnostim rakavih ce- lic je razlikovanje med njimi in normalnimi, zdravimi celicami pogosto težko, vsekakor pa bistveno težje in manj zanesljivo, kot je človeškemu organizmu zaznavanje tujih proteinov na površini bakterij in virusov. Dodatne težave so še razmeroma majhno število rakavih celic v zgodnjem stadiju in odsotnost simptomov, ko so obeti za ozdra- vitev še dobri, in pa tudi sama dostopnost/ izpostavljenost rakavih celic. Najlažje je za- znavati celice v krvnem obtoku, kjer je po- vršina celic zelo dobro izpostavljena, prav tako pa je odvzem vzorca enostaven in ne- invaziven. Celice, ki jih lahko zaznavamo na tak način, imenujemo krožeče tumorske celice (angleško circulating tumor cells, CTC). To so celice, ki so se odcepile od tumorja in so povezane z nastankom zasevkov, nji- hovo zaznavanje pa omogoča ne samo skle- panje na prisotnost in izvor rakave bolezni, temveč nam njihovo število in značilnosti nudijo vpogled v napredovanje bolezni ter spremljanje odziva na zdravljenje (Paoletti, Hayes, 2016). Velik izziv pri analizi krožečih tumorskih celic je, da so te celice zelo redke – v dese- tih mililitrih krvi lahko pričakujemo le do deset takih celic (Jesenko, Grašič - Kuhar, Čemažar, 2018). Krožeče tumorske celice iz krvi običajno ulovimo s protitelesi, ki prepo- znajo nekatere proteine na njihovi površini. Trenutno je za uporabo v diagnostiki Ame- riška agencija za hrano in zdravila (FDA) odobrila zgolj en tovrstni sistem, imenovan CELLSEARCH (Riethdorf, O’Flaherty, Slika 2: Shematski prikaz sprememb proteinov na površini rakastih celic (celice označene s sivo barvo). Različne vrste proteinov na površini so prikazane z različno obliko in barvo. Lahko pride do spremembe količine nekaterih proteinov na celici ali pa zgolj do njihove spremembe v smislu spremenjenih posttranslacijskih modifikacij (PTM) ali mutacij. 104 ■ Proteus 84/3 • November 2021 105Vloga proteinov na površini rakavih celic pri odkrivanju in zdravljenju rakavih obolenj • MedicinaMedicina • Vloga proteinov na površini rakavih celic pri odkrivanju in zdravljenju rakavih obolenj celičnih delitev. Primer takega receptorja je receptor za epidermalni rastni dejavnik (EGFR), katerega izražanje ali delovanje sta pogosto deregulirana pri različnih tipih raka (Sigismund, Avanzato, Lanzetti, 2018). Me- hanizem delovanja receptorja za epidermal- ni rastni dejavnik temelji na interakciji med dvema proteinoma receptorja za epidermalni rastni dejavnik - dimerizaciji receptorja po vezavi zunajceličnega rastnega dejavnika, te- mu pa sledi avtofosforilacija (proces prenosa fosforilne skupine na aminokislinske ostan- ke istega proteina, ki katalizira reakcijo) znotrajcelične domene in sprožitev signal- ne kaskade, ki vodi v rast in delitev celic, zaviranje celične smrti in povečanje celične gibljivosti. Ob vezavi rastnega dejavnika se lahko receptor za epidermalni rastni dejav- nik poveže tudi z ostalimi tremi receptor- ji iz iste družine – najbolj poznan tovrstni partner je receptor HER2, ki je mutiran ali pretirano izražen v približno petindvajsetih odstotkih primerov raka dojke (Ishikawa, Ichikawa, Shimizu, Sasaki, Tanabe, Chis- hima, Takabe, Endo, 2014). Tako receptor za epidermalni rastni dejavnik kot receptor HER2 spadata med receptorske tirozin ki- naze, saj njuni znotrajcelični regiji vsebujeta kinazno domeno, ki fosforilira tirozinske ostanke. Vloga te skupine receptorjev pri razvoju raka je do sedaj ena izmed najbolj preučenih, vendar pa trenutne raziskave ka- žejo tudi na pomembno vlogo receptorjev iz drugih skupin, kot so receptorske serin/tre- onin kinaze (na primer receptor za TGF-β), receptorji, sklopljeni s kinazami Janus (na primer receptor za eritropoetin), z G-prote- ini sklopljeni receptorji ter receptorji signal- nih poti Wnt, Notch, Hedgehog in tako dalje. Pomembno vlogo pri razvoju raka imajo tudi adhezijski proteini, ki sodelujejo pri tvorbi celičnih stikov in pritrjevanju celic na zunaj- celični matriks, saj je njihova (de)regulacija povezana z invazivnostjo ter napredovanjem rakavih celic v okolna in tudi bolj oddaljena tkiva. Pomembni predstavniki adhezijskih proteinov so proteini iz razreda integrinov (Bianconi, Unseld, Prager, 2016). Ti tvori- jo heterodimere, ki se na zunajcelični strani pritrjujejo na različne komponente zunajce- ličnega matriksa, na notranji strani celic pa na citoskelet (notranje celično ogrodje). So- delujejo tudi pri prenosu signalov iz okoli- ce v notranjost celic in obratno, pri čemer lahko celica z različnimi mehanizmi vpliva na njihovo sposobnost pritrjevanja, s tem pa uravnava lastno gibljivost in premikanje. Zanimiv primer je tudi epitelijska celična adhezijska molekula (EpCAM), ki je, v pri- merjavi z normalnimi epitelijskimi celicami, prisotna v povečani količini na površini ve- čine rakavih celic epitelijskega izvora (karci- nomov). Dolgo časa je veljalo, da tudi epi- telijska celična adhezijska molekula sodeluje pri tvorbi celičnih stikov, vendar se je pred kratkim pokazalo, da temu ni tako. Vloga epitelijske celične adhezijske molekule v ra- ku je verjetno bolj povezana z njeno funkcijo pri celičnem signaliziranju, saj epitelijska ce- lična adhezijska molekula oziroma njeni po- samezni deli sodelujejo v različnih signalnih poteh (Gaber, Lenarčič, Pavšič, 2020). Z invazivno naravo rakavih celic in sposob- nostjo metastaziranja so poleg adhezijskih molekul povezani tudi številni encimi, ki delujejo na površini celic, pri čemer gre v glavnem za različne tipe proteaz (na primer proteaze iz družine ADAM), ki z remode- liranjem zunajceličnega matriksa omogočajo celicam pobeg iz lokalnega okolja (Raka- shanda, Rana, Rafiq, Masood, Amin, 2012). Hkrati je njihovo proteolitično delovanje povezano z razvojem krvnih žil v tumorju (angiogeneza), sodelujejo pa tudi pri spro- ščanju rastnih dejavnikov iz površine celic in s komponentami zunajceličnega matriksa, kar dodatno pripomore k povečani prolife- raciji celic. Pomembni značilnosti rakavih celic sta tu- di deregulirani celični metabolizem in s tem povezano spremenjeno izražanje raz- ličnih transportnih proteinov, udeleženih pri vnosu hranil in iznosu za celico neže- lenih snovi. Rakave celice imajo namreč visoke energijske zahteve, kar je posledica pospešene rasti in z njo povezane sinteze različnih celičnih komponent. Na primer, pogosto imajo na površini neobičajno veliko količino prenašalcev iz družine GLUT, ki omogočajo vnos glukoze v notranjost celic. Drugi tip prenašalcev, ki pomembno vpli- vajo na potek zdravljenja raka, so nekateri predstavniki družine prenašalcev ABC (na primer MRP1), ki prek aktivnega transporta odstranjujejo citostatike iz notranjosti celic, posledično pa je njihovo povečano izražanje povezano z zmanjšanim učinkom kemotera- pije (Zhang, Wang, Gupta, Chen, 2015). Vloga proteinov na površini pri odkrivanju in spremljanju rakavih obolenj Kljub omenjenim značilnostim rakavih ce- lic je razlikovanje med njimi in normalnimi, zdravimi celicami pogosto težko, vsekakor pa bistveno težje in manj zanesljivo, kot je človeškemu organizmu zaznavanje tujih proteinov na površini bakterij in virusov. Dodatne težave so še razmeroma majhno število rakavih celic v zgodnjem stadiju in odsotnost simptomov, ko so obeti za ozdra- vitev še dobri, in pa tudi sama dostopnost/ izpostavljenost rakavih celic. Najlažje je za- znavati celice v krvnem obtoku, kjer je po- vršina celic zelo dobro izpostavljena, prav tako pa je odvzem vzorca enostaven in ne- invaziven. Celice, ki jih lahko zaznavamo na tak način, imenujemo krožeče tumorske celice (angleško circulating tumor cells, CTC). To so celice, ki so se odcepile od tumorja in so povezane z nastankom zasevkov, nji- hovo zaznavanje pa omogoča ne samo skle- panje na prisotnost in izvor rakave bolezni, temveč nam njihovo število in značilnosti nudijo vpogled v napredovanje bolezni ter spremljanje odziva na zdravljenje (Paoletti, Hayes, 2016). Velik izziv pri analizi krožečih tumorskih celic je, da so te celice zelo redke – v dese- tih mililitrih krvi lahko pričakujemo le do deset takih celic (Jesenko, Grašič - Kuhar, Čemažar, 2018). Krožeče tumorske celice iz krvi običajno ulovimo s protitelesi, ki prepo- znajo nekatere proteine na njihovi površini. Trenutno je za uporabo v diagnostiki Ame- riška agencija za hrano in zdravila (FDA) odobrila zgolj en tovrstni sistem, imenovan CELLSEARCH (Riethdorf, O’Flaherty, Slika 2: Shematski prikaz sprememb proteinov na površini rakastih celic (celice označene s sivo barvo). Različne vrste proteinov na površini so prikazane z različno obliko in barvo. Lahko pride do spremembe količine nekaterih proteinov na celici ali pa zgolj do njihove spremembe v smislu spremenjenih posttranslacijskih modifikacij (PTM) ali mutacij. 106 ■ Proteus 84/3 • November 2021 107Vloga proteinov na površini rakavih celic pri odkrivanju in zdravljenju rakavih obolenj • MedicinaMedicina • Vloga proteinov na površini rakavih celic pri odkrivanju in zdravljenju rakavih obolenj Hille, Pantel, 2018). Temelji na zaznavanju celic, ki na površini izražajo prej omenjeni tumorski označevalni protein EpCAM. Ta je značilen za normalne epitelijske celice in za številne rake epitelijskega izvora – karci- nome. Če uporabimo druga protitelesa, lah- ko ulovimo tudi celice, ki imajo na površini druge označevalce, značilne za druge vrste rakov. Tak primer je lovljenje celic s proti- telesi proti OB-kadherinu, ki je prisoten na površini rakastih celic mezenhimskega izvo- ra, to so celice, ki sestavljajo mehka tkiva in kosti. Vloga proteinov na površini pri zdravljenju rakavih obolenj Za rakave celice značilni površinski proteini niso uporabni zgolj za zaznavanje takih celic – izkoristimo jih lahko tudi kot označeval- ce mesta za dostavo terapevtske učinkovine. Ključna komponenta tovrstnih sistemov so protitelesa, ki te proteine prepoznajo, hkra- ti pa imajo pripeto tudi neko funkcional- no učinkovino. Zaradi visoke specifičnosti protiteles lahko dosežemo, da je delovanje terapevtske učinkovine omejeno na obmo- čje rakastega tkiva, kar je bistvena prednost pred klasičnimi kemoterapijami. Pri teh namreč kemoterapevtiki – zaviralci celične rasti in/ali povzročitelji poškodb DNA – delujejo tako na rakaste kot tudi normalne celice, kar ima za posledico številne stran- ske učinke, posebej na hitro deleče se krvne celice, celice črevesja in podobno. Do sedaj je bilo prepoznanih že precej površinskih proteinov, značilnih za rakaste celice, proti katerim so že bila pripravljena terapevtska protitelesa (tabela 1). Terapevtiki na osnovi protiteles lahko de- lujejo na različne načine (slika 3). Najbolj enostaven mehanizem delovanja je že sama vezave protitelesa na protein na površini ra- kave celice – to lahko vpliva na delovanje proteina in s tem zavira napredovanje raka- vega obolenja (slika 3A). Na tak način de- lujeta zdravili Trastuzumab in Cetuximab, ki se vežeta na receptor Her2 oziroma na receptor za epidermalni rastni dejavnik in s tem preprečita njegovo aktivacijo. Drug pristop predstavljajo protitelesa z vezanim »tovorom« – v najpreprostejši izvedbi je na protitelo vezana citotoksična spojina, ki po internalizaciji (vnosu kompleksa protein- -protitelo v celico) povzroči njeno odmrtje (slika 3B). Primer takega zdravila je Trastu- zumab emtazin, prva tarčna kemoterapija za raka dojk. Tretji pristop so kompleksnejša večfunkcionalna terapevtska protitelesa, ki lahko pomagajo imunskemu sistemu pre- poznati in uničiti rakasto celico (slika 3C). Tak primer je zdravilo Catumaxomab, ki je bilo prvo trifunkcionalno protitelo in hkrati prvo odobreno zdravilo za zdravljenje raka- vih celic v trebušni vodenici, katere so po- gosto povezane z epitelijskimi raki. Catu- maxomab je hibridno protitelo, ki se hkrati veže na protein epitelijske celične adhezijske molekule EpCAM na površini rakastih celic in se hkrati veže preko receptorja CD3 na celice T, s tem pa sproži aktivacijo adaptiv- nega immunskega odogovora. To protitelo lahko aktivira tudi naravni imunski sistem, in sicer z vezavo na receptor za konstan- tno regijo protiteles, ki se nahaja na povr- šini makrofagov, naravnih celic ubijalk in dendritskih celic. Na ta način lahko torej z umetno pripravljenimi protitelesi usmerimo nam lastni imunski sistem na želeno mesto in ga aktiviramo. Kljub temu da predstavljajo tarčne terapije sodobnejši način zdravljenja in da je njiho- vo delovanje ciljno usmerjeno, pa niso brez neželenih stranskih učinkov. Že omenjeno zdravilo Catumaxomab je bilo leta 2017 umaknjeno s trga, k temu pa je domnevno pripomoglo prav dejstvo, da je bilo zdra- vilo premalo učinkovito, neželenih stran- skih učinkov pa je bilo preveč (sproščanje signalnih proteinov citokinov in toksičnost za jetrne celice). V nekaterih primerih se vsi proteini na površini celic, ki se povečano iz- ražajo pri rakavih celicah, pojavljajo tudi na površini (nekaterih) normalnih celic drugod v telesu. Konkretno, epitelijska celična ad- hezijska molekula (EpCAM) se tako v večji meri izraža tudi na sicer normalnih epite- lijskih celicah, predvsem na površini celic v prebavnem traktu in ščitnici. Podobna te- žava je povezava z uporabo Trastuzumaba, ki prepozna receptor Her2 in se uporablja pri zdravljenju raka dojk – tarčni protein Her2 se nahaja tudi na celicah srčne miši- ce, kar je neposredno povezano s kardioto- ksičnostjo omenjenega protitelesa (Sandoo, Kitas, Carmichael, 2015). Dodatne težave predstavljajo heterogenost na ravni tumor- jev ter celic samih in njihovega mikrooko- lja (med- in znotrajtumorska heterogenost), Protein Izvor rakavih celic Terapevtsko protitelo integrin avβ3 endotelijske celice Etaracizumab CAIX debelo črevo Girentuximab CEA debelo črevo Labetuzumab, Arcitumomab, Besilesomab, Altumomab CD44, v6 glava in vrat Bivatuzumab CXR4 dojke BMS-936564 EGFR glava in vrat, dojke Cetuximab, Imgatuzumab, Panitumumab, Nimotuzumab, Matuzumab, Futuximab, Ne- citumumab, Zalutumumab ErbB-2, Her2 dojke Trastuzumab, Pertuzumab, Ertumaxomab Emmprin pankreas Metuximab, Gabilimomab Endoglin endotelijske celice TRC105 EpCAM debelo črevo Adecatumumab, Edrecolomab, Citatuzumab, Oportuzumab, Solitomab, Tucotuzumab, Ca- tumaxomab EphA2 jajčniki in melanomi MEDI-547, Dasatinib, KB004 FAP-a s f ibroblasti povezani raki Sibrotuzomab, F19 Folat R jajčniki FARLETUZEMAB GRP78 endotelijske celice PAT-SM6 IGF-1R debelo črevo Cixutumumab, Figitumumab Mezotelin mezoteliom Amatuximab cMet/HGFR pljuča Rilotumumab, Onartuzumab, Ficlatuzumab Muc-1 dojke Cantuzumab, Clivatuzumab PSCA AGS-1C4D4 PSMA prostata Capromab, J591 uPAR debelo črevo ATN-658 Tabela 1: Pregled za rakaste celice značilnih proteinov, proti katerim so bila pripravljena terapevtska protitelesa (Boonstra, De Geus, Prevoo, Hawinkels, Van De Velde, Kuppen, Vahrmeijer, Sier, 2016). 106 ■ Proteus 84/3 • November 2021 107Vloga proteinov na površini rakavih celic pri odkrivanju in zdravljenju rakavih obolenj • MedicinaMedicina • Vloga proteinov na površini rakavih celic pri odkrivanju in zdravljenju rakavih obolenj Hille, Pantel, 2018). Temelji na zaznavanju celic, ki na površini izražajo prej omenjeni tumorski označevalni protein EpCAM. Ta je značilen za normalne epitelijske celice in za številne rake epitelijskega izvora – karci- nome. Če uporabimo druga protitelesa, lah- ko ulovimo tudi celice, ki imajo na površini druge označevalce, značilne za druge vrste rakov. Tak primer je lovljenje celic s proti- telesi proti OB-kadherinu, ki je prisoten na površini rakastih celic mezenhimskega izvo- ra, to so celice, ki sestavljajo mehka tkiva in kosti. Vloga proteinov na površini pri zdravljenju rakavih obolenj Za rakave celice značilni površinski proteini niso uporabni zgolj za zaznavanje takih celic – izkoristimo jih lahko tudi kot označeval- ce mesta za dostavo terapevtske učinkovine. Ključna komponenta tovrstnih sistemov so protitelesa, ki te proteine prepoznajo, hkra- ti pa imajo pripeto tudi neko funkcional- no učinkovino. Zaradi visoke specifičnosti protiteles lahko dosežemo, da je delovanje terapevtske učinkovine omejeno na obmo- čje rakastega tkiva, kar je bistvena prednost pred klasičnimi kemoterapijami. Pri teh namreč kemoterapevtiki – zaviralci celične rasti in/ali povzročitelji poškodb DNA – delujejo tako na rakaste kot tudi normalne celice, kar ima za posledico številne stran- ske učinke, posebej na hitro deleče se krvne celice, celice črevesja in podobno. Do sedaj je bilo prepoznanih že precej površinskih proteinov, značilnih za rakaste celice, proti katerim so že bila pripravljena terapevtska protitelesa (tabela 1). Terapevtiki na osnovi protiteles lahko de- lujejo na različne načine (slika 3). Najbolj enostaven mehanizem delovanja je že sama vezave protitelesa na protein na površini ra- kave celice – to lahko vpliva na delovanje proteina in s tem zavira napredovanje raka- vega obolenja (slika 3A). Na tak način de- lujeta zdravili Trastuzumab in Cetuximab, ki se vežeta na receptor Her2 oziroma na receptor za epidermalni rastni dejavnik in s tem preprečita njegovo aktivacijo. Drug pristop predstavljajo protitelesa z vezanim »tovorom« – v najpreprostejši izvedbi je na protitelo vezana citotoksična spojina, ki po internalizaciji (vnosu kompleksa protein- -protitelo v celico) povzroči njeno odmrtje (slika 3B). Primer takega zdravila je Trastu- zumab emtazin, prva tarčna kemoterapija za raka dojk. Tretji pristop so kompleksnejša večfunkcionalna terapevtska protitelesa, ki lahko pomagajo imunskemu sistemu pre- poznati in uničiti rakasto celico (slika 3C). Tak primer je zdravilo Catumaxomab, ki je bilo prvo trifunkcionalno protitelo in hkrati prvo odobreno zdravilo za zdravljenje raka- vih celic v trebušni vodenici, katere so po- gosto povezane z epitelijskimi raki. Catu- maxomab je hibridno protitelo, ki se hkrati veže na protein epitelijske celične adhezijske molekule EpCAM na površini rakastih celic in se hkrati veže preko receptorja CD3 na celice T, s tem pa sproži aktivacijo adaptiv- nega immunskega odogovora. To protitelo lahko aktivira tudi naravni imunski sistem, in sicer z vezavo na receptor za konstan- tno regijo protiteles, ki se nahaja na povr- šini makrofagov, naravnih celic ubijalk in dendritskih celic. Na ta način lahko torej z umetno pripravljenimi protitelesi usmerimo nam lastni imunski sistem na želeno mesto in ga aktiviramo. Kljub temu da predstavljajo tarčne terapije sodobnejši način zdravljenja in da je njiho- vo delovanje ciljno usmerjeno, pa niso brez neželenih stranskih učinkov. Že omenjeno zdravilo Catumaxomab je bilo leta 2017 umaknjeno s trga, k temu pa je domnevno pripomoglo prav dejstvo, da je bilo zdra- vilo premalo učinkovito, neželenih stran- skih učinkov pa je bilo preveč (sproščanje signalnih proteinov citokinov in toksičnost za jetrne celice). V nekaterih primerih se vsi proteini na površini celic, ki se povečano iz- ražajo pri rakavih celicah, pojavljajo tudi na površini (nekaterih) normalnih celic drugod v telesu. Konkretno, epitelijska celična ad- hezijska molekula (EpCAM) se tako v večji meri izraža tudi na sicer normalnih epite- lijskih celicah, predvsem na površini celic v prebavnem traktu in ščitnici. Podobna te- žava je povezava z uporabo Trastuzumaba, ki prepozna receptor Her2 in se uporablja pri zdravljenju raka dojk – tarčni protein Her2 se nahaja tudi na celicah srčne miši- ce, kar je neposredno povezano s kardioto- ksičnostjo omenjenega protitelesa (Sandoo, Kitas, Carmichael, 2015). Dodatne težave predstavljajo heterogenost na ravni tumor- jev ter celic samih in njihovega mikrooko- lja (med- in znotrajtumorska heterogenost), Protein Izvor rakavih celic Terapevtsko protitelo integrin avβ3 endotelijske celice Etaracizumab CAIX debelo črevo Girentuximab CEA debelo črevo Labetuzumab, Arcitumomab, Besilesomab, Altumomab CD44, v6 glava in vrat Bivatuzumab CXR4 dojke BMS-936564 EGFR glava in vrat, dojke Cetuximab, Imgatuzumab, Panitumumab, Nimotuzumab, Matuzumab, Futuximab, Ne- citumumab, Zalutumumab ErbB-2, Her2 dojke Trastuzumab, Pertuzumab, Ertumaxomab Emmprin pankreas Metuximab, Gabilimomab Endoglin endotelijske celice TRC105 EpCAM debelo črevo Adecatumumab, Edrecolomab, Citatuzumab, Oportuzumab, Solitomab, Tucotuzumab, Ca- tumaxomab EphA2 jajčniki in melanomi MEDI-547, Dasatinib, KB004 FAP-a s f ibroblasti povezani raki Sibrotuzomab, F19 Folat R jajčniki FARLETUZEMAB GRP78 endotelijske celice PAT-SM6 IGF-1R debelo črevo Cixutumumab, Figitumumab Mezotelin mezoteliom Amatuximab cMet/HGFR pljuča Rilotumumab, Onartuzumab, Ficlatuzumab Muc-1 dojke Cantuzumab, Clivatuzumab PSCA AGS-1C4D4 PSMA prostata Capromab, J591 uPAR debelo črevo ATN-658 Tabela 1: Pregled za rakaste celice značilnih proteinov, proti katerim so bila pripravljena terapevtska protitelesa (Boonstra, De Geus, Prevoo, Hawinkels, Van De Velde, Kuppen, Vahrmeijer, Sier, 2016). 108 ■ Proteus 84/3 • November 2021 109Vloga proteinov na površini rakavih celic pri odkrivanju in zdravljenju rakavih obolenj • MedicinaMedicina • Vloga proteinov na površini rakavih celic pri odkrivanju in zdravljenju rakavih obolenj slaba penetracija proteinskih terapevtikov v rakasto tkivo ter dejstvo, da se izražanje proteinov na površini celic med nastankom in napredovanjem rakavega obolenja spremi- nja (časovna heterogenost). Če spet za pri- mer vzamemo epitelijsko celično adhezijsko molekulo (EpCAM), se ta povečano izraža na začetku razvoja karcinomov in na tumor- skih matičnih celicah, po epitelijsko-mezen- himskem prehodu, povezanim z začetkom metastaziranja, pa s površine rakastih celic izgine (Gires, Pan, Schinke, Canis, Baeuer- le, 2020). Drug primer predstavlja uporaba terapevtskih protiteles Cetuximab in Pani- tumumab, usmerjenih proti receptorju za epidermalni rastni dejavnik (EGFR), kjer ne glede na videz optimalni izbor primernih bolnikov pride do pojava precejšnje odpor- nosti nekaterih rakavih celic zaradi znotraj- tumorske heterogenosti in pojava genetskih sprememb ravno kot posledica selekcijske- ga pritiska proti receptorju za epidermalni rastni dejavnik (EGFR) usmerjene terapije (Neves, Kwok, 2015). Za uspešen spopad z rakom je tako ključnega pomena podrobna opredelitev rakastega tkiva in njegove he- terogenosti na začetku kot tudi neprestano spremljanje med zdravljenjem ter ustrezne prilagoditve terapevtskega pristopa, najbo- lje, podobno kot rakasto tkivo, zasnovanega heterogeno. Novejši načini zdravljenja s ciljanjem proteinov na površini Zaradi želje po učinkovitejših pristopih zdravljenja raka je ogromno truda vloženega v iskanje novih in izboljšanih pristopov, pri čemer pa so številni šele v začetnih stopnjah testiranj in je tako kljub njihovi zmogljivo- sti težko napovedati, ali se bodo pokazali za učinkovite. Tak primer je nadgradnja opi- sanih terapij s protitelesi, imenovana AD- PET, kjer je na protitelo pritrjen encim, ki pretvarja zdravilno učinkovino iz neaktivne v aktivno obliko (Sharma, Bagshawe, 2017). Tako protitelo se veže na površino rakavih celic, nato pa v krvni obtok bolnika vnese- mo neaktivno obliko zdravilne učinkovine, ki se aktivira šele v rakavem tkivu in uniči rakave celice. S tem dosežemo povečano se- lektivnost in zmanjšanje stranskih učinkov, saj zdravilna učinkovina ne uniči celic v normalnih tkivih. Pri trdnih tumorjih, kjer težavo predstavlja- ta razdalja med žilami v tumorju ter sam zunajcelični matriks, ki otežuje prehajanje molekul po tumorskem tkivu, je posebej izrazit problem penetracije globlje v tkivo. S tem problemom se ukvarja več raziskav, med drugim tudi nedavna, v kateri avtor- ji opisujejo usmerjene magnetne nanobo- te z lastnim pogonom (Andhari, Wavhale, Dhobale, Tawade, Chate, Patil, Khandare, Banerjee, 2020). Nanobote so sestavili ta- ko, da so spojili nanodelce iz magnetita (Fe3O4) s protitelesi proti epitelijski celič- ni adhezijski molekuli (EpCAM) ter na- nocevkami iz ogljika, v te pa naložili tovor – kemoterapevtik doksorubicin. Nanodelci iz železovega oksida katalizirajo pretvor- bo vodikovega peroksida, ki ga proizvajajo tumorske celice, v vodo in kisik, kar pred- stavlja gonilno silo, hkrati pa omogočajo vodenje nanobota z magnetom. S protitelesi proti epitelijski celični adhezijski molekuli (EpCAM) je doseženo ciljanje tumorskih celic, kjer po vezavi na epitelijsko celično adhezijsko molekulo (EpCAM) na njihovi površini pride do vnosa kompleksa v celico, kislo okolje lizosomov pa povzroči odprtje posebnih vratc nanocevk in s tem omogoči sprostitev kemoterapevtika doksorubicina iz njihove notranjosti. Ta preko zaviranja pre- pisovanja genov in podvojevanja DNA delu- je citotoksično. Kombinacija vseh navedenih komponent se je pokazala vsaj dvakrat bolj učinkovita kot le delne kombinacije ali po- samezne komponente pri uničenju trdnega tumorja. Raziskava je bila sicer opravljena na modelnem sistemu, vsekakor pa kaže na velik potencial nanotehnologije pri razvoju novih terapevtskih pristopov. Ciljanje proteinov na površini celic za ustre- zno dostavo zdravilnih učinkovin je neiz- ogibno tudi pri povsem novih dostavnih sistemih in mehanizmih zdravljenja. Tak primer je uporaba bakterijskih minicelic, neživih sto do štiristo nanometrov velikih veziklih, ki nastanejo pri abnormalni delitvi bakterijskih celic. Gre za zanimiv dostav- ni sistem, ker se minicelice niso sposobne deliti in zato ne morejo povzročiti okužbe, hkrati pa so še vedno metabolno aktivne in vsebujejo vse potrebne komponente za pre- pisovanje in prevajanje genskega zapisa. Mi- nicelice za dostavo terapetvskih učinkovin pripravljajo iz bakterij Salmonella enterica, serotip Typhimurium (S. Typhimurium) (Ma- cDiarmid, Brahmbhatt, 2011). Za tarčno zdravljanje z minicelicami uporabljajo bi- specifična protitelesa, ki hkrati prepoznajo protein na površini minicelic in protein na površini rakastih celic. Tak dostavni sistem uporablja zdravilo TargomiR (Reid, Kao, Pavlakis, Brahmbhatt, MacDiarmid, Clar- ke, Boyer, van Zandwijk, 2016), ki v mi- nicelicah dostavlja mimetično mikroRNA (miRNA), ki posnema skupino mikroRNA miR-15/107, protitelo pa prepozna recep- tor za epidermalni rastni dejavnik (EGFR). Uporaba mimetikov mikroRNA sodi med novejše mehanizme zdravljenja, temelji pa na tem, da z vnosom mimetikov mikroRNA popravlja v rakastih celicah porušeno urav- navanje izražanja proteinov z mikroRNA. Ena od sodobnejših terapiji v zdravljenju raka je tudi zdravljenje s celično terapijo CAR–T. Pri tem umetno spremenimo bolni- kove lastne celice T tako, da izražajo himer- ni antigenski receptor (CAR), ta pa prepo- zna specifične proteine na površini rakavih celic. Celična terapija CAR-T ima precejšen potencial v zdravljenju rakavih obolenj, kot so na primer kronična limfocitna levkemi- ja in B-celični limfomi, kaže pa se tudi, da za nekatere bolnike z rakom celična terapija CAR-T učinkuje le kratkoročno in jo je tre- ba kombinirati z ostalimi že uveljavljenimi metodami (Dreger in sod., 2018). Zaključek Kljub napredku v odkrivanju, spremljanju in zdravljenju rakavih obolenj ta še vedno predstavljajo veliko uganko. Proteini na površini celic zagotovo pomenijo pomemb- ni del sestavljanke, saj so zaradi svoje iz- postavljenosti tudi dobra tarča usmerjenih terapij. Njihove pomanjkljivosti pa ne gre pripisati lastnostim proteinov na površini celic kot takih, temveč dejstvu, da je rak iz- redno kompleksna in dinamična bolezen. Z Slika 3: Različni načini delovanja tarčnih protiteles. A B C 108 ■ Proteus 84/3 • November 2021 109Vloga proteinov na površini rakavih celic pri odkrivanju in zdravljenju rakavih obolenj • MedicinaMedicina • Vloga proteinov na površini rakavih celic pri odkrivanju in zdravljenju rakavih obolenj slaba penetracija proteinskih terapevtikov v rakasto tkivo ter dejstvo, da se izražanje proteinov na površini celic med nastankom in napredovanjem rakavega obolenja spremi- nja (časovna heterogenost). Če spet za pri- mer vzamemo epitelijsko celično adhezijsko molekulo (EpCAM), se ta povečano izraža na začetku razvoja karcinomov in na tumor- skih matičnih celicah, po epitelijsko-mezen- himskem prehodu, povezanim z začetkom metastaziranja, pa s površine rakastih celic izgine (Gires, Pan, Schinke, Canis, Baeuer- le, 2020). Drug primer predstavlja uporaba terapevtskih protiteles Cetuximab in Pani- tumumab, usmerjenih proti receptorju za epidermalni rastni dejavnik (EGFR), kjer ne glede na videz optimalni izbor primernih bolnikov pride do pojava precejšnje odpor- nosti nekaterih rakavih celic zaradi znotraj- tumorske heterogenosti in pojava genetskih sprememb ravno kot posledica selekcijske- ga pritiska proti receptorju za epidermalni rastni dejavnik (EGFR) usmerjene terapije (Neves, Kwok, 2015). Za uspešen spopad z rakom je tako ključnega pomena podrobna opredelitev rakastega tkiva in njegove he- terogenosti na začetku kot tudi neprestano spremljanje med zdravljenjem ter ustrezne prilagoditve terapevtskega pristopa, najbo- lje, podobno kot rakasto tkivo, zasnovanega heterogeno. Novejši načini zdravljenja s ciljanjem proteinov na površini Zaradi želje po učinkovitejših pristopih zdravljenja raka je ogromno truda vloženega v iskanje novih in izboljšanih pristopov, pri čemer pa so številni šele v začetnih stopnjah testiranj in je tako kljub njihovi zmogljivo- sti težko napovedati, ali se bodo pokazali za učinkovite. Tak primer je nadgradnja opi- sanih terapij s protitelesi, imenovana AD- PET, kjer je na protitelo pritrjen encim, ki pretvarja zdravilno učinkovino iz neaktivne v aktivno obliko (Sharma, Bagshawe, 2017). Tako protitelo se veže na površino rakavih celic, nato pa v krvni obtok bolnika vnese- mo neaktivno obliko zdravilne učinkovine, ki se aktivira šele v rakavem tkivu in uniči rakave celice. S tem dosežemo povečano se- lektivnost in zmanjšanje stranskih učinkov, saj zdravilna učinkovina ne uniči celic v normalnih tkivih. Pri trdnih tumorjih, kjer težavo predstavlja- ta razdalja med žilami v tumorju ter sam zunajcelični matriks, ki otežuje prehajanje molekul po tumorskem tkivu, je posebej izrazit problem penetracije globlje v tkivo. S tem problemom se ukvarja več raziskav, med drugim tudi nedavna, v kateri avtor- ji opisujejo usmerjene magnetne nanobo- te z lastnim pogonom (Andhari, Wavhale, Dhobale, Tawade, Chate, Patil, Khandare, Banerjee, 2020). Nanobote so sestavili ta- ko, da so spojili nanodelce iz magnetita (Fe3O4) s protitelesi proti epitelijski celič- ni adhezijski molekuli (EpCAM) ter na- nocevkami iz ogljika, v te pa naložili tovor – kemoterapevtik doksorubicin. Nanodelci iz železovega oksida katalizirajo pretvor- bo vodikovega peroksida, ki ga proizvajajo tumorske celice, v vodo in kisik, kar pred- stavlja gonilno silo, hkrati pa omogočajo vodenje nanobota z magnetom. S protitelesi proti epitelijski celični adhezijski molekuli (EpCAM) je doseženo ciljanje tumorskih celic, kjer po vezavi na epitelijsko celično adhezijsko molekulo (EpCAM) na njihovi površini pride do vnosa kompleksa v celico, kislo okolje lizosomov pa povzroči odprtje posebnih vratc nanocevk in s tem omogoči sprostitev kemoterapevtika doksorubicina iz njihove notranjosti. Ta preko zaviranja pre- pisovanja genov in podvojevanja DNA delu- je citotoksično. Kombinacija vseh navedenih komponent se je pokazala vsaj dvakrat bolj učinkovita kot le delne kombinacije ali po- samezne komponente pri uničenju trdnega tumorja. Raziskava je bila sicer opravljena na modelnem sistemu, vsekakor pa kaže na velik potencial nanotehnologije pri razvoju novih terapevtskih pristopov. Ciljanje proteinov na površini celic za ustre- zno dostavo zdravilnih učinkovin je neiz- ogibno tudi pri povsem novih dostavnih sistemih in mehanizmih zdravljenja. Tak primer je uporaba bakterijskih minicelic, neživih sto do štiristo nanometrov velikih veziklih, ki nastanejo pri abnormalni delitvi bakterijskih celic. Gre za zanimiv dostav- ni sistem, ker se minicelice niso sposobne deliti in zato ne morejo povzročiti okužbe, hkrati pa so še vedno metabolno aktivne in vsebujejo vse potrebne komponente za pre- pisovanje in prevajanje genskega zapisa. Mi- nicelice za dostavo terapetvskih učinkovin pripravljajo iz bakterij Salmonella enterica, serotip Typhimurium (S. Typhimurium) (Ma- cDiarmid, Brahmbhatt, 2011). Za tarčno zdravljanje z minicelicami uporabljajo bi- specifična protitelesa, ki hkrati prepoznajo protein na površini minicelic in protein na površini rakastih celic. Tak dostavni sistem uporablja zdravilo TargomiR (Reid, Kao, Pavlakis, Brahmbhatt, MacDiarmid, Clar- ke, Boyer, van Zandwijk, 2016), ki v mi- nicelicah dostavlja mimetično mikroRNA (miRNA), ki posnema skupino mikroRNA miR-15/107, protitelo pa prepozna recep- tor za epidermalni rastni dejavnik (EGFR). Uporaba mimetikov mikroRNA sodi med novejše mehanizme zdravljenja, temelji pa na tem, da z vnosom mimetikov mikroRNA popravlja v rakastih celicah porušeno urav- navanje izražanja proteinov z mikroRNA. Ena od sodobnejših terapiji v zdravljenju raka je tudi zdravljenje s celično terapijo CAR–T. Pri tem umetno spremenimo bolni- kove lastne celice T tako, da izražajo himer- ni antigenski receptor (CAR), ta pa prepo- zna specifične proteine na površini rakavih celic. Celična terapija CAR-T ima precejšen potencial v zdravljenju rakavih obolenj, kot so na primer kronična limfocitna levkemi- ja in B-celični limfomi, kaže pa se tudi, da za nekatere bolnike z rakom celična terapija CAR-T učinkuje le kratkoročno in jo je tre- ba kombinirati z ostalimi že uveljavljenimi metodami (Dreger in sod., 2018). Zaključek Kljub napredku v odkrivanju, spremljanju in zdravljenju rakavih obolenj ta še vedno predstavljajo veliko uganko. Proteini na površini celic zagotovo pomenijo pomemb- ni del sestavljanke, saj so zaradi svoje iz- postavljenosti tudi dobra tarča usmerjenih terapij. Njihove pomanjkljivosti pa ne gre pripisati lastnostim proteinov na površini celic kot takih, temveč dejstvu, da je rak iz- redno kompleksna in dinamična bolezen. Z Slika 3: Različni načini delovanja tarčnih protiteles. A B C 110 ■ Proteus 84/3 • November 2021 111Medicina • Vloga proteinov na površini rakavih celic pri odkrivanju in zdravljenju rakavih obolenj »Imaš dober nos« • Medicina napredkom pri raziskavah, ki odkrivajo te- meljne lastnosti rakavih obolenj na moleku- larni ravni, tako genetski kot na ravni RNA in proteinov, ter razvojem in uporabo dia- gnostičnih pristopov spremljanja razvoja ra- kavih obolenj ob pomoči umetne inteligence bo v prihodnosti mogoče te pomanjkljivosti odpraviti, in sicer s prilagajanjem zdravlje- nja vsakemu bolniku in vsakemu rakavemu obolenju posebej. Literatura: Andhari, S. S., Wavhale, R. D., Dhobale, K. D., Tawade, B. V., Chate, G. P., Patil, Y. N., Khandare, J. J., Banerjee, S. S., 2020: Self-Propelling Targeted Magneto-Nanobots for Deep Tumor Penetration and pH-Responsive Intracellular Drug Delivery. Scientific Reports, 10: 4703. Bausch-Fluck, D., Goldmann, U., Müller, S., van Oostrum, M., Müller, M., Schubert, O. T., Wollscheid, B., 2018: The in silico human surfaceome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of Anerica, 115: E10988–E10997. Bianconi, D., Unseld, M., Prager, G. W., 2016: Integrins in the spotlight of cancer. International Journal of Molecular Sciences, 17 (12): 2037. Boonstra, M. C., De Geus, S. W. L., Prevoo, H. A. J. M., Hawinkels, L. J. A. C., Van De Velde, C. J. H., Kuppen, P. J. K., Vahrmeijer, A. L., Sier, C. F. M., 2016: Selecting Targets for Tumor Imaging: An Overview of Cancer-Associated Membrane Proteins. Biomark. Cancer, 8: BIC.S38542. Cancer Research UK. Dostopno: https://www. cancerresearchuk.org/health-professional/cancer-statistics- for-the-uk. Dreger, P., in sod., 2018: High-risk chronic lymphocytic leukemia in the era of pathway inhibitors: integrating molecular and cellular therapies. Blood, 132: 892–902. Ferlay, J., Colombet, M., Soerjomataram, I., Mathers, C., Parkin, D. M., Piñeros, M., Znaor, A., Bray, F., 2019: Estimating the global cancer incidence and mortality in 2018: GLOBOCAN sources and methods. International Journal of Cancer, 144: 1941–1953. Gaber, A., Lenarčič, B., Pavšič, M., 2020: Current View on EpCAM Structural Biology. Cells, 9: 1361. Gires, O., Pan, M., Schinke, H., Canis, M., Baeuerle, P. A., 2020: Expression and function of epithelial cell adhesion molecule EpCAM: where are we after 40 years? Cancer and Metastasis Reviews, 39: 969–987. Hanahan, D., Weinberg, R. A., 2011: Hallmarks of cancer: The next generation. Cell, 144: 646–674. Ishikawa, T., Ichikawa, Y., Shimizu, D., Sasaki, T., Tanabe, M., Chishima, T., Takabe, K., Endo, I., 2014: The role of HER-2 in Breast Cancer. Journal of Surgery Science, 2: 4–9. Jesenko, T., Grašič - Kuhar, C., Čemažar, M., 2018: Tekočinska biopsija pri raku. Onkologija, 22 (2): 26–31. MacDiarmid, J. A., Brahmbhatt, H., 2011: Minicells: Versatile vectors for targeted drug or si/shRNA cancer therapy. Current Opininion in Biotechnology, 22: 909–916. Neves, H., Kwok, H. F., 2015: Recent advances in the field of anti-cancer immunotherapy. BBA Clinical, 3: 280–288. Paoletti, C., Hayes, D. F., 2016: Circulating Tumor Cells. v Methods in molecular biology (Clifton, N.J.) 1692, 235–258. Rakashanda, S., Rana, F., Rafiq, S., Masood, A., Amin, S., 2012: Role of proteases in cancer: A review. Biotechnology and Molecular Biology Reviews, 7: 90–101. Reid, G., Kao, S. C., Pavlakis, N., Brahmbhatt, H., MacDiarmid, J., Clarke, S., Boyer, M., van Zandwijk, N., 2016: Clinical development of TargomiRs, a miRNA mimic-based treatment for patients with recurrent thoracic cancer. Epigenomics, 8: 1079–1085. Riethdorf, S., O’Flaherty, L., Hille, C., Pantel, K., 2018: Clinical applications of the CellSearch platform in cancer patients. Advanced Drug Delivery Reviews, 125: 102–121. Roth, G. A., in sod., 2018: Global, regional, and national age-sex-specific mortality for 282 causes of death in 195 countries and territories, 1980–2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet, 392: 1736–1788. Sandoo, A., Kitas, G., Carmichael, A., 2015: Breast cancer therapy and cardiovascular risk: focus on trastuzumab. Vascular Health and Risk Management, 11: 223. Sharma, S. K., Bagshawe, K. D., 2017: Antibody Directed Enzyme Prodrug Therapy (ADEPT): Trials and tribulations. Advanced Drug Delivery Reviews, 118: 2–7. Sigismund, S., Avanzato, D., Lanzetti, L., 2018: Emerging functions of the EGFR in cancer. Molecular Oncology, 12: 3–20. Tomasetti, C., Vogelstein, B., 2015: Variation in cancer risk among tissues can be explained by the number of stem cell divisions. Science, 347: 78–81. Zadnik, V., in sod., 2017: Rak v Sloveniji 2017. Zhang, Y. K., Wang, Y. J., Gupta, P., Chen, Z. S., 2015: Multidrug Resistance Proteins (MRPs) and Cancer Therapy. AAPS Journal, 17: 802–812. Nos, uho in grlo so bili v ospredju zanima- nja že od nekdaj. Zdravljenje teh organov so opravljali že v času Grkov, Hindujcev in Bizantincev. Veda, ki preučuje omenjene organe, je otorinolaringologija. V prispev- ku so predstavljene osnovne lastnosti voha, pomembnejša zgodovinska odkritja na tem področju, bolezni nosa, ki prizadenejo člo- veka, in nekatere značilnosti voha v žival- skem svetu. Voh ima evolucijsko gledano mnogo vlog: varuje pred nevarnostjo, omogoča zaznava- nje feromonov in hrane ter se veže z drugi- mi čutili (na primer okusom). Do zaznave vonja pride v trenutku, ko se vonjave prene- sejo po zraku, preidejo skozi nosnici v no- sno votlino in se nato vežejo na vohalne (ol- faktorne) receptorje v zgornjem delu nosne votline. Živci nato spremenijo informacijo v električni dražljaj, ta pa se prenese po pr- vem možganskem živcu (nervus olfactorius) v možgane. Senzor- ne informacije začnejo komu- nicirati z drugimi deli možga- nov, odgovornimi za spomin, občutke in prepoznavo. Tako se izoblikuje občutek zaznave vonjave. Sluznica nosne votline se po svoji vlogi del i na vohalno (zgornja tretjina) in respirator- no (spodnji dve tretjini). Nos je del dihalne poti in ima po- membno vlogo pri obdelavi vdihanega zraka. Vdihani zrak mora biti čist, topel in dovolj vlažen. Zrak se ob prehodu na- vlaži in segreje, zaradi dlačic in sluzi tudi očisti. Segrevanje poteka z mehanizmom širjenja žil, nabrekanjem sluznice in posledičnim segrevanjem vdi- hanega zraka. Raziskava, ki je preučevala povezanost med raz- ličnimi oblikami nosu in prila- goditvijo na različna podnebja, »Imaš dober nos« Lidija Kocbek Šaherl, Kristijan Skok Mandril (Mandrillus sphinx). Avtor: Malene Thyssen. Uporabljeno z licenco CC 2.5.