Boštjan Kocjan1, Katja Seme2, Mario Poljak3
Genetska osnova odpornosti Staphylococcus aureus proti meticilinu
Genetic Background of the Staphylococcus aureus Methicillin Resistance
IZVLEČEK_
KLJUČNE BESEDE: Staphylococcus aureus - genetika, meticilinska rezistenca, geni bakterijski, molekularne diagnostične tehnike
Proti meticilinu odporen Staphylococcus aureus (MRSA) je bil prvič izoliran pred več kot 30 leti in kmalu postal eden najpomembnejših povzročiteljev bolnišničnih okužb tako pri odrasli kot tudi pri otroški populaciji. V zadnjem času se v izvenbolnišničnem okolju vse pogosteje soočamo s pojavljanjem sevov MRSA, ki se po dejavnikih odpornosti in virulence ter dejavnikov tveganja za okužbo z MRSA razlikujejo od znanih bolnišničnih sevov. Pričujoči prispevek podaja pregled obstoječe literature o epidemiologiji okužb z MRSA in vzrokih odpornosti proti meticilinu. Podrobno je opisana sestava genetskih elementov, ki so osnova odpornosti proti meticilinu in ostalim betalaktamom. V nadaljevanju je predstavljena teorija o prenosu odpornosti proti meticilinu med stafilokoki ter opisani ključni dogodki v evoluciji, ki so verjetno privedli do nastanka različnih klonov MRSA. V zadnjem delu pregleda so predstavljene molekularne metode, ki se najpogosteje uporabljajo v diagnostiki okužb z MRSA in pri tipizaciji kliničnih izolatov MRSA.
ABSTRACT_
KEY WORDS: Staphylococcus aureus-genetics, methicillin resistance, genes bacterial, molecular diagnostic techniques
Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) was first reported over 30 years ago. Within a decade, MRSA was established as an important nosocomial pathogen in both the adult and pediatric populations. MRSA has also emerged as a pathogen in adults and children without traditional risk factors for MRSA infection. Recent studies have demonstrated that these strains have novel resistance and virulence genes. This review focuses on the epidemiology of MRSA infections and the genetic background of methicillin resistance. The genetic background of methicillin resistance and the transfer of the resistance genes between staphylococci are discussed. A theory of MRSA evolution and the development of major globally spread MRSA clones are presented. In addition, widely used methods for the diagnostic and typing of MRSA isolates are also summarized.
1	Boštjan Kocjan, univ. dipl. mikrobiol., Inštitut za mikrobiologijo in imunologijo, Zaloška 4, 1105 Ljubljana.
2	Doc. dr. Katja Seme, dr. med., Inštitut za mikrobiologijo in imunologijo, Zaloška 4, 1105 Ljubljana.
3	Prof. dr. Mario Poljak, dr. med., Inštitut za mikrobiologijo in imunologijo, Zaloška 4, 1105 Ljubljana.
UVOD
Staphylococcus aureus je klasična, po Gramu pozitivna patogena bakterija okrogle oblike, ki povzroča omejene gnojne okužbe na različnih predelih telesa. Pogosto okuži kožo, mehka tkiva, kirurške in druge rane ter povzroča vnetje očesne veznice. V kolikor preide v kri, lahko povzroči bakteremijo in sepso. Približno 30% zdrave odrasle populacije je kolonizirane z bakterijo S. aureus, največkrat v nosu, pod pazduho in v dimljah. Osebe, kolonizirane s S. aureus, lahko predstavljajo vir okužbe za bolnike na bolniških oddelkih, predvsem na oddelkih intenzivne nege. Koa-gulazno negativni stafilokoki (angl. coagulase negative staphylococci, CNS) vključujejo vrste Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus saprophyticus in številne ostale. Večina je normalnih kožnih komenzalov in manj patogenih kot S. aureus. Okužbe s CNS so pogoste pri osebah z oslabljenim imunskim sistemom in umetnimi vsadki. S. saprophyticus lahko povzroča tudi okužbe urinarnega trakta (1, 2). Odkritje antibiotikov v zgodnjih 50-ih letih prejšnjega stoletja je pomenilo bistven napredek v boju z bakterijskimi okužbami, saj se je po uvedbi penicilina v klinično prakso smrtnost zaradi stafilokoknih seps zmanjšala kar za 80%. Zaradi pojava in hitrega širjenja izolatov S. aureus, ki so postali odporni proti delovanju penicilina zaradi izločanja betalak-tamaz, se je skoraj istočasno pojavila potreba po razvoju novih antibiotikov, ki bi bili učinkoviti pri zdravljenju stafilokoknih in drugih bakterijskih okužb. Uvedba novih pro-timikrobnih sredstev je bila nujna, saj se je odstotek bolnišničnih sevov S. aureus, ki so izločali betalaktamaze, vrtoglavo bližal 90 %. Tudi naravni antibiotiki, kot so kloramfeni-kol, eritromicin, tetraciklin in streptomicin, ki so sprva delovali proti sevom S. aureus z betalaktamazami, so kasneje postali neučinkoviti. Izredno hitro naraščanje odpornosti proti različnim skupinam antibiotikov je bila pogosto posledica širjenja mobilnih genetskih elementov; transpozonov in plazmidov z zapisi za odpornost (1). Leta 1959 so sintetizirali prvi polsintetični penicilin, meticilin, ki je bil odporen proti delovanju betalaktamaz, encimov, ki cepijo betalaktamski obroč beta-
laktamov. V kratkem obdobju so mu sledili še nekateri drugi protistafilokokni penicilini (oksacilin, kloksacilin, dikloksacilin, flukloksa-cilin) s podobnimi kemičnimi, protimikrobnimi in farmakološkimi lastnostmi.
MRSA
Zaradi izjemne učinkovitosti pri zdravljenju stafilokoknih okužb so meticilin pričeli množično uporabljati že kmalu po njegovem odkritju. Dve leti po njegovi uvedbi v klinično prakso so že poročali o prvih izolatih S. aureus, odpornih proti meticilinu (angl. methicillin-resistant S. aureus, MRSA). Po letu 1961 je MRSA postal najbolj pogost povzročitelj bolnišničnih okužb in epidemij širom po svetu. S. aureus, ki je odporen proti meticilinu, je odporen tudi proti vsem drugim betalaktam-skim antibiotikom (vsem protistafilokoknim penicilinom, kombinaciji amoksicilina s klavu-lansko kislino in ampicilina s sulbaktamom, cefalosporinom, monobaktamom in karba-penemom). Odpornost MRSA proti vsem betalaktamom onemogoča učinkovito zdravljenje okužb s temi antibiotiki in zožuje izbor učinkovitih protimikrobnih sredstev (3). Vzrok za odpornost številnih izolatov S. aureus proti omenjeni skupini antibiotikov je prisotnost novega tipa penicilin vezujoče beljakovine, PBP2a (angl. penicilin binding protein).
Večina sevov MRSA je danes (poleg be-talaktamov) odpornih tudi proti številnim drugim skupinam antibiotikov, zdravljenje okužb z MRSA pa večinoma omejeno na gliko-peptide, vankomicin in teikoplanin. V zadnjem času za zdravljenje okužb z MRSA uporabljajo tudi tri nove antibiotike in sicer oksazolidinon linezolid, streptogramin daptomicin in ciklični lipopeptid kvinupristin-dalfopristin. Čeprav sevi MRSA niso bolj virulentni od na meticilin občutljivih S. aureus (angl. methicillin-sensitive S. aureus, MSSA), okužbe z MRSA povzročajo večjo smrtnost zaradi počasnejšega bakteri-cidnega delovanja razpoložljivih antibiotikov. V zadnjem času raste tudi delež izolatov MRSA, ki kažejo zmanjšano občutljivost na še edine preostale antibiotike (glikopeptide), s katerimi že več kot 30 let uspešno zdravimo okužbe, povzročene s sevi MRSA. Zaskrbljujoč je tudi podatek, da je večina novih antibiotikov, izdelanih med leti 1975 in 1999 bore malo
doprinesla k izboljšanju učinkovitosti zdravljenja stafilokoknih okužb (1).
Beljakovina PBP2a
Beljakovino PBP2a kodira gen mecA, ki je prisoten na kromosomu številnih proti meti-cilinu odpornih sevov stafilokoknih vrst. PBP2a je po svoji funkciji transpeptidaza, ki katalizira nastanek prečnih povezav v pepti-doglikanskem delu celične stene MRSA. Za razliko od ostalih PBP-jev (S. aureus ima 4 skupine PBP), ima PBP2a nizko afiniteto vezave za betalaktame in je sposobna učinkovite sinteze celične stene tudi takrat, ko so vsi ostali PBP zavrti. Vezava betalaktamov na beljakovine PBP MSSA povzroči njihovo inak-tivacijo, kar se odraža v zaviranju sinteze celične stene, spremembi zgradbe celice in celičnih procesov, povezanih s celično steno in delitvijo celice. Posledica motnje normalnega delovanja in zgradbe celične stene je razpad bakterijske celice. Visoko stopnjo odpornosti proti meticilinu (in večini betalak-tamov) dosežejo le stafilokoki, ki izražajo zapis za mecA, medtem ko so ostale oblike odpornosti (t. i. nizka stopnja odpornosti) posledica prekomernega izražanja betalakta-maz (angl. borderline oxacillin-resistant
S. aureus, sevi BORSA), povečanja količine obstoječih PBP ali zmanjšanje njihove afini-tete (angl. modified normal PBPs of S. aureus, sevi MODSA) (4).
Sestava mecA-genskega kompleksa
Genski kompleks mecA nosi zapis za induci-bilno odpornost proti meticilinu. Sestavljen je iz insercijskih sekvenc (IS), genov za uravnavanje izražanja mecA (mecI, mecR1) in zapisa za beljakovino PBP2a. Glede na kombinacijo naštetih elementov delimo genski kompleks mecA v štiri osnovne razrede (slika 1). Genotip razreda A mecI-mecR1-mecA-IS431mec predstavlja prototipsko strukturo genskega kompleksa mecA. V ostalih razredih sta gena mecI in mecR1 delno ali popolnoma izbrisana na račun integracije dveh dodatnih insercij-skih zaporedij, IS1272 (razred B) ali IS431 (razred C). Razred D ima najenostavnejšo zgradbo, sestavljeno samo iz gena mecA in IS431 (AmecR1-mecA-IS431mec). Pri izola-tih MRSA sta bila dokazana le razreda A in B, medtem ko sta razreda C in D omejena na CNS: S. haemolyticus, S. hominis in S. caprae (5, 6). MecA kompleksa A in B sta pogosta tudi pri ostalih stafilokoknih vrstah (7).
m4
I I mecRI l-T
mecA
\S43h
IS431^ mej[
A	—I I mecRI H	meA
AIS1272 ^ ^AmecRI _
B »	H	mecA
IS43K
IS43K
C1 C2
IS431w ^AmecRI

IS431 AmecRI
mecA
mecA
IS431
IS431
D
mecA razred
AmecRI
» l-T
mecA
IS431
1 kb
A
Slika 1. Različice genskega kompleksa mecA (7).
Izražanje gena mecA je zelo zapleteno. Poleg običajnih regulatorjev izražanja MecI in MecRl na njegovo sintezo (verjetno) vplivajo beljakovine, ki sodelujejo pri uravnavanju izražanja betalaktamaz, regulacijska pot genov fem, ki kodirajo peptidoglikan modificirajoče encime, ter delecije oziroma mutacije samega gena za represor MecI (1, 8).
Genetski mobilni element SCCmec
Kompleks mecA je del 21-60 kb velikega genetskega elementa, SCCmec (angl. staphylococcal cassette chromosome mec). SCCmec predstavlja nov razred mobilnih genetskih elementov in je sestavljen iz dveh neodvisnih delov, genskega kompleksa mecA in kompleksa genov ccr (3, 9). Konce t. i. genske kasete SCCmec sestavljajo obrnjene in neposredne ponovitve, ki so mesta delovanja mestno specifičnih encimov rekombinaz CcrA in CcrB iz družine invertaz/resolvaz. Obe rekombinazi sta sestavni del SCCmec in sodelujeta pri integraciji in izrezu elementa iz/v bakterijskega kromosoma (attB mesto v odprtem bralnem
__v scc	1
414 okvirju orfX) in sta tako posredno odgovorni za njegovo gibljivost (6, 10).
Glede na kombinacijo alelnih različic genov ccr (tip 1, 2, 3) in strukturnih razredov genskega kompleksa mecA (A-D) delimo SCCmec na štiri tipe: tip I SCCmec (ccr-1 + razred B), tip II SCCmec (ccr-2 + razred A), tip III SCCmec (ccr3 + razred A) in tip IV SCCmec (ccr2 + razred B). Tipi genskih kaset SCCmec se razlikujejo po velikosti, genetski organizaciji in številu oziroma tipu genov (gibljivih genetskih elementov), ki jih nosijo (6).
CA-MRSA
Večina izolatov MRSA, ki so razširjeni v bolnišničnem okolju (angl. hospital acquired-MRSA, H-MRSA), ima enega od obstoječih zapisov za gensko kaseto SCCmec tipa I, II, ali III. Molekularne analize izolatov MRSA, ki se vse pogosteje širijo v izvenbolnišničnem okolju (angl. community acquired-MRSA, CA-MRSA), kažejo na prisotnost novega tipa SCCmec, opredeljenega kot tip IV. Kot kaže, je ta tip zelo razširjen med CA-MRSA, ki so začeli resno ogrožati izvenbolnišnične populacije, predvsem majhne otroke in ljudi, ki živijo
v tesnem stiku (zaporniki, ekipe športnikov ipd.) (11). Po nekaterih poročilih naj bi bil omenjeni tip SCCmec pogost tudi pri sevih H-MRSA oziroma se ta pojavlja znotraj petih filogenetsko različnih linij MSSA, ki krožijo v bolnišnicah. Njegova pogostost v bolnišničnem okolju naj bi v prihodnosti naraščala kot posledica klonalnega sprejemanja SCCmec tipa IV (glej naprej) (12). Teorija o prenosu MRSA iz bolnišničnega v izvenbolnišnično okolje je zelo priročna, vendar številne lastnosti, značilne za izolate H-MRSA in CA-MRSA, nakazujejo, da gre po vsej verjetnosti za horizontalno širjenje mecA (SCCmec IV) med klone, ki krožijo znotraj posameznega okolja (5, 12-14).
PRENOS mecA
Analize stafilokoknih genomov nakazujejo, da poteka prenos gena mecA iz CNS na seve S. aureus s pomočjo genske kasete SCCmec. Prvi proti meticilinu odporen S. aureus (izoliran v zgodnjih 60-ih) se je verjetno razvil iz epidemične linije MSSA po sprejetju genske kasete SCCmec tipa I od neznanega CNS. CNS predstavljajo verjeten rezervoar gena mecA, ki se preko horizontalnega genskega prenosa širi na seve S. aureus. Prenos mecA iz CNS na MSSA poteka z do sedaj še nepojasnjenim mehanizmom, po vsej verjetnosti pa gen mecA ostaja znotraj kasete SSCmec. Različne tipe (ali različice obstoječih tipov) SCCmec pogosto najdemo tudi pri proti meticilinu odpornih CNS (angl. methiciHin-resistant CNS, MRCNS) (A-, B-razred), prav tako pri proti meticilinu občutljivih CNS (angl. met-hicillin-sensitive CNS, MSCNS) najdemo SCC-ju podobne strukture (6, 7, 10, 15, 16). Vse to nakazuje, da je med stafilokoki prenos gena mecA možen, vendar ni znano, kako pogosto se to dogaja. Kot enega možnih donorjev gena mecA omenjajo S. epidermidis, ki je najpogostejši proti meticilinu odporen CNS (16). Genetski gibljivi element SCC je verjetno namenjen tudi izmenjavi ostalih genetskih informacij in ni omejen le na prenos gena mecA. Najverjetneje obstaja cela družina kaset SCC in SCCmec je ena od tistih, ki je specializirana za prenos odpornosti proti meticilinu (6). Znanim tipom genske kasete SCCmec se bodo v kratkem verjetno pridružili novi, saj obstoječi
PCR (angl. polymerase chain reaction) oligo-nukleotidni začetniki za tipizacijo SCCmec ne pokrivajo vseh kliničnih izolatov MRSA (14).
Z medvrstnim prenosom specifičnih genov stafilokokne vrste premagujejo stresne situacije, kot je prisotnost antibiotikov, težkih kovin, pomanjkanje hranil in gostiteljev imunski odziv. Genski kaseti SCCmec tipa II in III sta pogosti pri klonih MRSA (dominirali sta v 1980-ih), ki poleg običajne odpornosti proti meticilinu izkazujejo tudi odpornost proti različnim drugim skupinam antibiotikov. Poleg zapisa za mecA imata ti dve kaseti vgrajene transpozone Tn554, Tn554), kopije plazmidov pUB110 in pT118 ter gen za odpornost proti živemu srebru (mer). Ti dodatni genetski elementi kodirajo odpornost proti kadmiju in nebetalaktamskim antibiotikom: eritromicinu, tobramicinu/bleomicinu in tetraciklinu (5,10). V nasprotju z ostalimi člani skupine SCCmec je novi tip IV manjši in ima samo zapis za gen mecA. Pri obstoječih tipih genske kasete SCCmec so prisotni tudi nekateri geni, katerih vloga ni povsem jasna, vendar ni povezana z odpornostjo proti antibiotikom (6).
EVOLUCIJSKI IZVOR MRSA
Evolucijski izvor poglavitnih klonov MRSA je še vedno slabo poznan. Pomanjkanje univerzalnega poimenovanja, izbor različnih metod in nestrinjanje glede števila poglavitnih klo-nov so vzroki, ki raziskave močno zapletajo. Začetne analize izolatov, ki so temeljile zgolj na sistemu polimorfizma dolžin restrikcijskih fragmentov (angl. restriction fragment length polymorphism, RFLP), so utemeljevale hipotezo, da je izvor MRSA verjetno klonalni. Po tej hipotezi naj bi v preteklosti gen mecA vstopil v populacijo S. aureus, pri čemer je nastal en sam klon MRSA, ki se je nato razširil po svetu (17,18). Druga hipoteza predpostavlja, da so se sevi MRSA razvili večkrat v smislu horizontalnega prenosa gena mecA v filoge-netsko oddaljene, proti meticilinu občutljive seve S. aureus (9, 19). Slednjo hipotezo potrjujejo tudi rezultati tipizacije mednarodne zbirke kliničnih izolatov MRSA (N = 359) in MSSA (N = 553), zbranih v 20 državah v letih 1961-1999 (12, 14). Z določitvijo tipa genske kasete SCCmec z metodo PCR in
nukleotidnega zaporedja nekaterih intrinzič-nih (angl. housekeeping gene) genov S. aureus z metodo MLST (angl. multilocus sequence typing) je bilo zaključeno:
•	večino okužb povzročajo maloštevilni pan-demični kloni,
•	odpornost proti meticilinu se je pojavila v petih filogenetsko različnih linijah MSSA; nastalo je 5 poglavitnih linij MRSA: CC5, CC8, CC22, CC30 in CC45,
•	obstaja 11 poglavitnih epidemičnih klonov MRSA (angl. epidemic MRSA, EMRSA), ki pripadajo omenjenim 5 linijam in so odgovorni za večino svetovnih bolnišničnih okužb,
•	znotraj določene linije se je odpornost proti meticilinu pojavila večkrat; poglavitni kloni EMRSA so se razvili iz uspešnih epi-demičnih sevov MSSA (klonov MSSA, ki so že bili prisotni v bolnišnicah) s sprejemanjem različnih tipov genskih kaset SCCmec (slika 2, klon ST8-MSSA) ali po genetskih spremembah prvotnih klonov EMRSA (slika 2, klon ST8-MRSA-III). V različnih časovnih intervalih je lahko isti sev MSSA sprejel različne SCCmec ter tako botroval nastanku klonov EMRSA z različnimi SCCmec (slika 2, klon ST8-MSSA). Obstaja tudi možnost, da je specifičen klon MRSA po prejetju genske kasete SCCmec zamenjal obstoječi tip SCCmec z novim (angl. replacement of the SCCmec type). Ta pojav naj bi bil manj pogost od sprejemanja tipov SCCmec s strani sevov MSSA.
Ce povzamemo na kratko: večina klonov EMRSA se genetsko ujema s poglavitnimi kloni MSSA, razlikujejo se le v prisotnosti oziroma odsotnosti in tipu genske kasete SCCmec, kar nakazuje na možen horizontalni prenos gena mecA med obstoječimi linijami MSSA. Do podobnega zaključka so prišli tudi Wielders in sodelavci (9). Kot kaže, so sevi MSSA, ki so prisotni v bolnišničnem okolju, dobro prilagojeni na (večkratni) sprejem gena mecA, kar je v primeru uvedbe metici-lina omogočilo nastanek številnih klonov MRSA (EMRSA). Zaradi povečane uporabe vankomicina v klinični praksi tudi kloni EMRSA postajajo vse manj občutljivi na glikopeptide oziroma se pojavljajo različice obstoječih klonov EMRSA, ki so tudi GISA
415
ST8-MRSA-II
ST239-MRSA-III i arcC I rekombinacija ST8-MRSA-III
SCCmec tip IV
ST8-MRSA-IV
yqil
to~kasta mutacija SCCmec tip I
ST8-MRSA-I
SCCmec tip I
>■ ST250-MSSA -
Potomci klona ST250
i	gmk
^ to~kasta mutacija
ST247-MRSA-I
Slika 2. Razvoj poglavitnih klonov MRSA vfilogenetski skupini CC8.
Klon ST8-MSSA predstavlja verjetnega prednika nekaterih (podčrtani) poglavitnih epidemičnih klonov MRSA (14,19).
(angl. glycopeptide intermediate resistant S. aureus) (14).
Na osnovi uporabe DNA-mikromrež (angl. DNA microarray) so dokazali prisotnost gena mecA v vsaj petih zelo različnih genet-416 skih skupinah MRSA, kar dokazuje, da je imel horizontalni prenos gena mecA verjetno poglavitno vlogo pri evoluciji MRSA (9). Tudi v raziskavi, objavljeni leta 2001, je bilo dokazano, da v svetu obstajajo najmanj trije različni kloni MRSA, ki nosijo različne zapise za element SCCmec (I—III) (10). Podobno je bil z uporabo elektroforeze v pulzirajočem električnem polju (angl. pulse field gel electrophoresis, PFGE) in ribotipizacije dokazan ponavljajoč se horizontalni prenos gena mecA v obstoječe (genetsko različne) linije MSSA - kloni MRSA ustrezajo svojim klonom MSSA (9).
MOLEKULARNA DIAGNOSTIKA MRSA
V večini rutinskih diagnostičnih laboratorijev poteka prepoznava S. aureus in določanje odpornosti proti meticilinu na osnovi klasičnih fenotipskih metod. Klasične identifikacijske metode (test DNaze, test proste koagulaze, aglutinacijski testi za površinske antigene in drugi) so počasne in lahko dajejo lažno pozitivne oziroma negativne rezultate. Tudi na
osnovi rezultatov različnih fenotipskih testov za ugotavljanje odpornosti proti meticilinu (disk difuzijska metoda z oksacilinom, prese-jalna plošča OXA, lateks aglutinacijski testi za PBP2a) je včasih nemogoče zaključiti, ali imamo opravka z odpornim izolatom ali ne. Napačna prepoznava bakterijskega izolata in/ali napačna opredelitev odpornosti proti meticilinu pa ima lahko hude klinične, epidemiološke in nenazadnje tudi ekonomske posledice.
V praksi se zato vse pogosteje uporabljajo različne molekularne hibridizacijske metode, metode razvejane DNA (angl. branched DNA, bDNA) in druge metode pomnoževanja (npr. PCR), s katerimi lahko hitro in zanesljivo ločujemo med izolati MSCNS, MRCNS, MSSA in MRSA. Za odkrivanje ribosomalne RNA S. aureus lahko uporabimo kolorimetričen hibridizacijski test AccuProbe (GenProbe, San Diego, CA, ZDA), za dokazovanje gena mecA pa metodološko podoben test Velogene Rapid MRSA (ID Biomedical Corporation, Vancouver, Canada). Razvili so tudi številne različice PCR, s katerimi lahko hkrati pomno-žujejo različne stafilokokne gene in odseke gena mecA, zato natančna opredelitev sta-filokoknih izolatov danes več ne bi smela predstavljati problema (4, 20-22). Dokaz prisotnosti gena mecA z metodo PCR velja za zlati standard dokazovanja odpornosti proti meti-cilinu (4). Kljub izredno visoki občutljivosti
in specifičnosti molekularnih metod jih večina laboratorijev uporablja le kot dopolnilo k razreševanju določenih nejasnih primerov, saj je visoka cena molekularnih metod in nezmožnost obdelave velikega števila vzorcev še vedno precejšnja ovira.
MOLEKULARNE METODE ZA TIPIZACIJO MRSA
Trenutno obstaja kar nekaj tipizacijskih metod, ki temeljijo na analizi bakterijske DNA, s katerimi lahko razločujemo med različnimi sevi S. aureus. Uporabljamo jih lahko za raziskovanje epidemij bolnišničnih okužb z MRSA (klinične študije), so neprecenljive za nadzor in omejevanje znotraj- in medbolnišničnega širjenja klonov MRSA ter izredno pomembne za napovedovanje in obvladovanje izbruhov epidemij. Najbolj pogosto uporabljene metode so:
•	analiza plazmidnih profilov (angl. plasmid profile analysis),
•	analiza kromosomske DNA po razgradnji z restrikcijskimi encimi (angl. analysis of chromosomal DNA after enzymatic restriction, REA), REA z metodo prenosa po Souther-nu (angl. Southern blotting),
•	PFGE,
•	tehnike, ki vključujejo PCR in MLST,
• različne izvedbe PCR-ja: Rep-PCR (angl. repetetive palindromic extragenic elements PCR), AP-PCR (angl. arbitrarily primed PCR), RAPD (angl. random amplified polymorphic DNA), AFLP (angl. amplified fragment length polymorphism) oziroma njegova izvedenka s florokromi fAFLP.
Za globalne epidemiološke študije so primerne predvsem nove tipizacijske metode (npr. MLST), ki imajo večjo moč razločevanja (angl. discriminatory power) med posameznimi sevi MRSA, so visoko ponovljive in jih je lažje standardizirati. Čeprav sta PFGE in fAFLP pogosto uporabljeni in zanesljivi metodi z veliko močjo razločevanja, naj bi bili primerni zgolj za ugotavljanje sorodnosti izolatov MRSA, osamljenih pri posameznih epidemijah znotraj določene bolnišnice. Za primerjavo izolatov MRSA (MSSA, GISA) med laboratoriji in natančno uvrstitev izolatov med poglavitne epidemične klone EMRSA ali potencialno nove naj bi se uporabljala metoda MLST v kombinaciji z molekularno opredelitvijo tipa genske kasete SCCmec (14, 23-26). Čeprav precej kompleksna in počasna metoda PFGE zaenkrat ostaja zlati standard za tipizacijo izolatov MRSA. Morebitna pocenitev opreme in stroškov izvedbe pa napoveduje metodi MLST širšo in pogostejšo uporabnost.
ZAHVALA
Prof. dr. Mariji Gubina, dr. med., se zahvaljujemo za idejo in spodbudo za nastanek tega članka.
417
LITERATURA
1.	Livermore DM. Antibiotic resistance in staphylococci. Int J Antimicrob Agents 2000; 16 Suppl 1: S3-10.
2.	Seme K. Stafilokoki. In: Ihan L Gubina M editors. Medicinska bakteriologija z imunologijo in mikologijo. 1st ed. Ljubljana: Medicinski razgledi; 2002. p. 139-45.
3.	Katayama Y, Ito T, Hiramatsu K. A new class of genetic element, staphylococcus cassette chromosome mec, encodes methicillin resistance in Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother 2000; 44:1549-55.
4.	Fluit AC, Visser MR, Schmitz FJ. Molecular detection of antimicrobial resistance. Clin Microbiol Rev 2001; 14: 836-71.
5.	Hiramatsu K, Cui L, Kuroda M, Ito T. The emergence and evolution of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Trends Microbiol 2001; 9: 486-93.
6.	Katayama Y, Takeuchi F, Ito T, Ma XX, Ui-Mizutani Y, Kobayashi I et al. Identification in methicillin-susceptible Staphylococcus hominis of an active primordial mobile genetic element for the staphylococcal cassette chromosome mec of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. JBacteriol 2003; 185: 2711-22.
7.	Katayama Y, Ito T, Hiramatsu K. Genetic organization of the chromosome region surrounding mecA in clinical staphylococcal strains: role of IS431-mediated mecl deletion in expression of resistance in mecA-carrying, low-level methicillin-resistant Staphylococcus haemolyticus. Antimicrob Agents Chemother 2001; 45: 1955-63.
8.	McKinney TK, Sharma VK, Craig WA, Archer GL. Transcription of the gene mediating methicillin resistance in Staphylococcus aureus (mecA) is corepressed but not coinduced by cognate mecA and beta-lactamase regulators. JBacteriol 2001; 183: 6862-8.
9.	Wielders CL, Fluit AC, Brisse S, Verhoef J, Schmitz FJ. mecA gene is widely disseminated in Staphylococcus aureus population. J Clin Microbiol 2002; 40: 3970-5.
10.	Ito T, Katayama Y, Asada K, Mori N, Tsutsumimoto K, Tiensasitorn C et al. Structural comparison of three types of staphylococcal cassette chromosome mec integrated in the chromosome in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother 2001; 45: 1323-36.
11.	Ma XX, Ito T, Tiensasitorn C, Jamklang M, Chongtrakool P, Boyle-Vavra S et al. Novel type of staphylococcal cassette chromosome mec identified in community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains. Antimicrob Agents Chemother 2002; 46: 1147-52.
12.	Robinson DA, Enright MC. Evolutionary models of the emergence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother 2003; 47: 3926-34.
13.	Chambers HF. Tracking the spread of CMRSA. APUA Newsletter 2003; 21:1-5.
14.	Enright MC, Robinson DA, Randle G, Feil EJ, Grundmann H, Spratt BG. The evolutionary history of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99: 7687-92.
15.	Ito T, Katayama Y, Hiramatsu K. Cloning and nucleotide sequence determination of the entire mec DNA of pre-met-hicillin-resistant Staphylococcus aureus N315. Antimicrob Agents Chemother 1999; 43: 1449-58.
16.	Wisplinghoff H, Rosato AE, Enright MC, Noto M, Craig W, Archer GL. Related clones containing SCCmec type IV predominate among clinically significant Staphylococcus epidermidis isolates. Antimicrob Agents Chemother 2003; 47:3574-9.
17.	Kreiswirth B, Kornblum J, Arbeit RD, Eisner W, Maslow JN, McGeer A et al. Evidence for a clonal origin of methicillin resistance in Staphylococcus aureus. Science 1993; 259: 227-30.
18.	Ito T, Hiramatsu K. Acquisition of methicillin resistance and progression of multiantibiotic resistance in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Yonsei Med J1998; 39: 526-33.
19.	Robinson DA, Enright MC. Multilocus sequence typing and the evolution of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Clin Microbiol Infect 2004; 10: 92-7.
20.	Reischl U, Linde HJ, Metz M, Leppmeier B, Lehn N. Rapid identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus and simultaneous species confirmation using real-time fluorescence PCR. J Clin Microbiol 2000; 38: 2429-33.
21.	Grisold AJ, Leitner E, Muhlbauer G, Marth E, Kessler HH. Detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus and simultaneous confirmation by automated nucleic acid extraction and real-time PCR. J Clin Microbiol 2002; 40: 2392-7.
22.	Huletsky A, Giroux R, Rossbach V, Gagnon M, Vaillancourt M, Bernier M et al. New real-time PCR assay for rapid detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus directly from specimens containing a mixture of staphylococci. J Clin Microbiol 2004; 42:1875-84.
23.	Quelle LS, Corso A, Galas M, Sordelli DO. STAR gene restriction profile analysis in epidemiological typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus: description of the new method and comparison with other polymerase chain reaction (PCR)-based methods. Diagn Microbiol Infect Dis 2003; 47: 455-64.
24.	Trindade PA, McCulloch JA, Oliveira GA, Mamizuka EM. Molecular techniques for MRSA typing: current issues and perspectives. Braz J Infect Dis 2003; 7: 32-43.
25.	Tenover FC, Arbeit RD, Goering RV, Mickelsen PA, Murray BE, Persing DH et al. Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis: criteria for bacterial strain typing. J Clin Microbiol 1995; 33: 2233-9.
26.	Ip M, Lyon DJ, Chio F, Enright MC, Cheng AF. Characterization of isolates of methicillin-resistant Staphylococcus aureus from Hong Kong by phage typing, pulsed-field gel electrophoresis, and fluorescent amplified-fragment length polymorphism analysis. J Clin Microbiol 2003; 41: 4980-5.
Prispelo 1.6.2004