Acta agriculturae Slovenica, 116/2, 369–381, Ljubljana 2020 doi:10.14720/aas.2020.116.2.1949 Review article / pregledni znanstveni članek Tradicionalne in molekularne metode za determinacijo ščitkarjev (Aleyrodidae) Maja DOBRAJC 1 , Sebastjan RADIŠEK 1 , Jernej JAKŠE 2 , Stanislav TRDAN 2, 3 Received November 04, 2020; accepted December 01, 2020. Delo je prispelo 04. novembra 2020, sprejeto 01. decembra 2020. 1 Inštitut za hmeljarstvo in pivovarstvo Slovenije, Žalec 2 Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo, Ljubljana, Slovenija 3 Korespondenčni avtor, e-naslov: stanislav.trdan@bf.uni-lj.si Tradicionalne in molekularne metode za determinacijo ščitkarjev (Aleyrodidae) Izvleček: Ščitkarji (Aleyrodidae) so vrstno manj pestra skupina žuželk, ki obsega okoli 1500 vrst iz 160 rodov. Za- radi prehranjevanja z rastlinskimi sokovi so pomembni škodl- jivci kmetijskih in okrasnih rastlinskih vrst, kjer povzročajo neposredno in posredno škodo. Večina vrst izvira iz tropskih območij, pri nas pa so najpogostejši v rastlinjakih. Z vse po- gostejšim vnosom ščitkarjev na nova območja in njihovih in- vazivnim delovanjem, je determinacija teh žuželk pomemben sestavni del varstva rastlin. Identifikacija ščitkarjev v stadiju odraslega osebka je zahtevna in problematična. Za morfolo- ško determinacijo in taksonomsko določitev je primerna le razvojna stopnja puparija, zato so določevalni ključi redki in pomanjkljivi. Oblika puparija je odvisna od gostiteljskih rastlin in abiotskih vplivov, zato sta nabiranje in nadaljnja determina- cija pogosto težavni. Razvoj modernih metod determinacije in genetska diagnostika je omogočila natančnejšo determinacijo, preučitev filogenetskih povezav med vrstami ščitkarjev in pri- pravo načrtov za biotično zatiranje teh škodljivcev. Najpogos- teje se v modernem pristopu determinacije ščitkarjev uporabl- jajo računalniški programi za analizo fotografije, molekularne metode izolacije DNA in sekvenciranje. Ključne besede: morfološka determinacija; mtCOI; programska oprema proposed sistem; ščitkarji; škodljivci Traditional and molecular methods for the identification of whitefly (Aleyrodidae) species Abstract: Whiteflies (Aleyrodidae) is small group of in- sects (Insecta) that comprises around 1500 species from 160 genera. Whiteflies damage important cultivated and orna- mental plants by sucking plants juice. Most of the species are from tropical area, in our region they are the most common in greenhouses. Because worldwide transport, whiteflies become invasive all around the world. The identification of whiteflies species in adult stage is problematic. Morphological differen- tiation of pupae is one of the better methods for determining identity of species, but it may vary depending on the host plant on which they develop which can lead to misidentifications and erroneous naming of new species. The application of ge- netic diagnostics under the umbrella of classical taxonomy was imperative for successful development and delivery of the biological control program, phylogenetics and plans for biological control. The most common modern techniques for whiteflies determination are computer programs for photogra- phy analysis, molecular methods with DNA isolation and se- quencing. Key words: morphological determination; mtCOI; pro- posed system; whitefly; pests Acta agriculturae Slovenica, 116/2 – 2020 370 M. DOBRAJC et. al. 1 UVOD Ščitkarje (Aleyrodidae) (slika 1) uvrščamo v podred prsokljuncev (Sternorrhyncha), red polkrilcev (Hemip- tera) in razred žuželk (Insecta). Družina ščitkarjev (Aley- rodidae) obsega dve poddružini. Poddružina Aleurodici- nae je endemična na območju centralne in južne Amerike in je glede na kompleksno zgradbo žilnega sistema kril taksonomsko primitivna. Zapletena zgradba žilnega sis- tema kril je lahko posledica velikosti predstavnikov pod- družine Aleurodicinae (večji od 2 mm), saj so le-ti precej večji od poddružine Aleyrodinae. Poddružina Aleyrodi- nae je globalno razširjena in ima večje število vrst (Byrne in Bellows Jr., 1991). Do danes je v svetu opisanih več kot 1500 vrst ščitkarjev (Hodges in Evans, 2005), ki jih uvr- ščamo v 161 rodov. Odrasli osebki so veliki 2–3 mm in spominjajo na manjše molje, saj imajo zaradi voščenega poprha telo bele barve. Okončine so dobro razvite. Na glavi so členjene antene s sedmimi členi in ustni aparat za sesanje in bodenje (Perring in sod., 2018). Nimfe in odrasli osebki imajo pogosto vzorce različnih oblik, ki so strokovnjakom v pomoč pri determinaciji vrst (Botha in sod., 2000). Ščitkarji se razmnožujejo spolno, le redko tudi par- tenogenetsko. Samice jajčeca oddajo na površje različnih rastlinskih organov, pogosto na spodnjo stran listov, ne- katere samice predstavnikov poddružine Aleurodicinae pa odlagajo jajčeca tudi na plodove in zgornjo ali spodnjo stran listov. Jajčeca odložijo v polpravilnem ali pravilnem krogu, saj so medtem prisesane na stalno mesto. Ličinke prve stopnje so mobilne, gibljejo se na krajše razdalje. Na trajno mesto se prisesajo po prvi levitvi, ki ga do tretje stopnje ne zapustijo. Zadnja stopnja ličink so pupariji; na njihovi morfološki zgradbi je temeljila sistematika celo- tne družine (Gill, 1990). Ščitkarji so polifagni ali oligo- fagni. Prehranjujejo se s sesanjem floemskega soka, pri čemer bodalo vstavijo v tkivo rastlin. Zadržujejo se na toplih in vlažnih prostorih. Številne vrste so gospodarsko pomembne (Milevoj, 2003). Ščitkarji so pomembni škodljivci, saj imajo na kme- tijske rastlinske vrste neposredni in posredni vpliv. Med hranjenjem z rastlinskimi sokovi vbrizgavajo v zdrave rastline številne toksine (Watson, 2007), ki povzročijo venenje, slabšo rast in odmiranje rastlin (Botha in sod., 2000). Nimfe povzročijo fiziološke spremembe vegeta- tivnih delov, kot so nepravilno zorenje plodov in sivenje listov (Hoddle, 2004). Nekatere vrste ščitkarjev so tudi vektorji prenosa gospodarsko pomembnih virusov (Tr- dan, 2015). Medena rosa ščitkarjev je medij gliv sajavosti (Capnodium spp.) (Byrne in Bellows Jr., 1991). Največjo gospodarsko škodo in izgubo pridelka povzročata toba- kov ščitkar (Bemisia tabaci [Gennadius, 1889]) in rastli- njakov ščitkar (Trialeudores vaporariorum Westwood, 1856). V Sloveniji se na kapusnicah pogosto pojavlja in posredno povzroča škodo tudi kapusov ščitkar (Aleyro- des proletella [Linnaeus, 1758]) (Trdan in sod., 2003). Na območju Evrope ščitkarji povzročajo škodo na zelenja- dnicah in okrasnih rastlinah, gojenih v rastlinjakih, kjer lahko povzročijo tudi do 50 % uničenja rastlin. So tudi škodljivci citrusov, različnih drugih sadnih dreves in gr- mov (Šimala in sod., 2015). Sistematika poddružin ščitkarjev temelji na mor- fološki determinaciji četrte stopnje nimfe, imenovane puparij (Martin in sod., 2000). Za puparij je značilna fe- notipska plastičnost, kot odgovor na zgradbo lista rastli- ne in abiotskih dejavnikov okolja (Guershon in Gerling, Slika 1: 1-Ščitkar Aleurocanthus spiniferus; 2-levo odrasla samica, desno odrasel samec; 3-ovalna, ledvičasto oblikovana jajčeca; 4-jajčeca in mlade nimfe v 1. in 2. stopnji; 5-odrasle nimfe v 3. in 4. stopnji; 6-pupariji (Radonjić in sod., 2014). Figure 1: 1-Aleurocanthus spiniferus; 2-female left, male right; 3-elongate-oval to kidney-shaped eggs; 4-eggs and young nymphs - 1st and 2nd instars; 5-lder nymphs 3rd and 4th instars and sooty mould; 6-4th instars - puparia (Radonjić in sod., 2014). Acta agriculturae Slovenica, 116/2 – 2020 371 Tradicionalne in molekularne metode za determinacijo ščitkarjev (Aleyrodidae) 2001). Zato je determinacija pogosto otežena. Morfolo- ška determinacija odraslih osebkov je mogoča le za pod- družino Aleurodicinae, saj določevalni ključi za ostali poddružini še niso enotni in v uporabi (Ghahari in sod., 2009). Moderne molekularne tehnike omogočajo na- tančnejšo determinacijo vrst ščitkarjev (Oliveira in sod., 2000; Calvert in sod., 2001; Shatters in sod., 2009). Za fi- logenetske povezave in determinacijo se uporablja mito- hondrijska DNK (mDNK), saj pojasnjuje polimorfizem med bližnjimi vrstami (Brown in sod., 1979; Lunt in sod., 1996). Akumulacija sprememb nukleotidov in polimor- fizem vplivata na izgube ali dodajanja restrikcijskih mest, brez bistvene spremembe v velikosti genoma (Hebert in sod., 2003). Spremembe znotraj mitohondrijskega gena citokrom oksidaze I (COI), so primeren kazalnik za upo- rabo DNK barkodiranega sistema determinacije na ravni določanja vrst (Hebert in sod., 2003; Kress in Erickson, 2008). Osnova molekularnega pristopa določanja ščit- karjev so specifični PCR začetni oligonukleotidi, ki se prilegajo COI genu, njegovo pomnoževanje in razrez z restrikcijskimi encimi (polimorfizem dolžin restrikcij- skih fragmentov) (Vidigal in sod., 2002; Caldeira in sod., 2003; Thyssen in sod., 2005). Znane COI sekvence (preko 150 000) so zbrane v GenBank in The Barcode of Life Data System (BOLD) zbirkah ter so temelj za taksonomi- jo in filogenijo žuželk (Kwong in sod., 2012; Ptaszynska in sod., 2012; Smith in sod., 2012). 2 MORFOLOŠKA IDENTIFIKACIJA Odrasli osebki ščitkarjev iz družine Aleyrodidae so podobni manjšim moljem, zato so jih v prvih mor- foloških študijah mnogokrat zamenjevali s pritlikavimi listnimi zavrtači (Nepticulidae). Jajčeca so na spodnji strani listov gostiteljih rastlin na dolgih ali kratkih pe- cljih. Površje jajčec je pogosto gladko ali v obliki satovja. Številne vrste ležejo jajčeca v polkrožnih ali krožnih vr- stah. Larvalne stopnje so štiri, pogosto je četrta larvalna stopnja puparij. Prva larvalna stopnja ima dobro razvite okončine in antene, je blede do prosojne barve in edina mobilna larvalna stopnja, ki lahko izbere stalno mesto za razvoj nadaljnjih larvalnih stopenj. Pri številnih vrstah je za puparij značilno izločanje voskastih sekretov iz papil ali enostavnih oziroma sestavljenih por. Odrasli osebek zapusti zadnjo larvalno stopnjo na območju zadka iz od- prtine v obliki črke T. Pri mnogih vrstah se odrasli osebki začnejo pre- hranjevati takoj po izleganju, še pred aktivacijo kril. Oba spola odraslih osebkov imata dva para membranskih kril brez prečnih žil. Spolni dimorfizem se kaže le na obmo- čju razlik v genitalijah, številu ventralnih abdominalnih voščenih ploščic, anten in manjšemu telesu samcev. Ne- katere vrste imajo več kot en rod letno. Morfološka de- terminacija poteka s preučevanjem juvenilnih osebkov v različnih stopnjah razvoja pod mikroskopom. Deter- minacija specifičnih značilnosti je vezana na število, ve- likost in lokacijo por, odprtin, papil ter set (Perring in sod., 1993). Identifikacija se začne z zbiranjem osebkov iz listov gostiteljskih rastlin s pomočjo lupe. Liste rastlin je po- trebno posušiti in shraniti do njihove preparacije. Iden- tifikacija in klasifikacija zbranih žuželk na ravni vrste se določi na podlagi morfoloških lastnosti odraslih žuželk in ličink, pri čemer so v uporabi klasične identifikacijske metode, kot so morfološki ključi. Ličinke in puparije ščit- karjev se določi z mikroskopiranjem v kanadskem balza- mu po prilagojenih metodah Wilkey (1962) ali Watson in Chandler (1999). Standardizirani postopek po Wilkey (1962) je sledeč: vzorce potopimo v 10 % kalijev hidro- ksid (KOH), kjer jih lahko shranjujemo od 12 do 24 ur. Nato jih vzamemo iz KOH in jih za 10–15 min potopi- mo v destilirano vodo. V destilirano vodo dodamo eno ali dve kapljici kontrastnega barvila. Vzorce pustimo v raztopini 15 min. Osebke nato vzamemo iz barvila in jih potopimo v 75 % etanol (EtOH) za 10 min, kar razbarva vse nesklerotizirane regije. Osebke iz 75 % EtOH prene- semo v 95 % etanol (EtOH) za 10–15 min. Vzorce poto- pimo v olje nageljnovih žbic za 30 min ali več. Na objek- tno stekelce nanesemo kanadski balzam in vanj položimo vzorec, ki ga označimo in pokrijemo z drugim objektnim stekelcem. Vzorce sušimo v sušilni napravi tri tedne pri 35 °C (Hodges in Evans, 2005). Za identifikacijo so v uporabi določevalni ključi Takahashi (1952; 1954), Mo- und (1966), Habib in Farag (1970), Martin (1985; 1978; 1999), Bink-Moenen in Gerling (1990), Mifsud (1995) in Martin in sod. (2000). Natančna identifikacija se izvaja s stereomikroskopom in svetlobnim mikroskopom. 3 MODERNE TEHNIKE IDENTIFIKACIJE ŠČITKARJEV 3.1 PROGRAMSKA OPREMA PROPOSED SISTEM Za identifikacijo bolezni in škodljivcev na rastlinah in njihovih škodljivcev so v uporabi številni moderni pristopi zaznavanja, prepoznavanja in taksonomskega uvrščanja posameznih vrst. Z razvojem tehnologije in računalniških sistemov, so se razvili tudi programi za prepoznavanje škodljivcev in obdelavo velike količine podatkov. Računalniški program, imenovan Proposed system, je programska oprema za detekcijo in klasifika- cijo bolezenskih znamenj na listih rastlin ali rastlinskih škodljivcev. Shema programske opreme sestoji iz štirih ključnih korakov. Prvi korak je izdelava barvne strukture Acta agriculturae Slovenica, 116/2 – 2020 372 M. DOBRAJC et. al. Table 1: Vrste ščitkarjev, njihova razširjenost in gostitelji (Martin in sod., 2000) Table 1: Whiteflies, their extent and hosts (Martin et. al., 2000) Vrsta Metoda determinacije Osnovni ključ Razširjenost Gostitelj Reference Acaudaleyrodes rachipora (Singh, 1931) Morfološki ključ Opis in skica; Martin in sod., 2000 Kreta, Ciper, Egipt, Izrael, Jordanija, Portugalska, Rodos, Španija, Sirija, Turčija Lesne rastline, občasni škodljivci na citrusih (Citrus sp.), granatnem jabolku (Punica granatum L.), gvajava (Psidium guajava L.) Singh, 1931 Aleurocanthus zizyphi (Priesner & Hosny, 1934) Morfološki ključ Opis in skica; Martin in sod., 2000 Egipt, Izrael, Jordanija Lalob (Balanites aegyptiaca (L.) Delile), Terminalia laxiflora Engl. & Diels, Phyllanthus mullerianus Ktze, Dalbergia sp., Detarium microcarpum Guill. & Perr., kana (Lawsonia inermis L.), Ficus capensis Forssk., Ochna afzelii Hoffm., Ziziphus spinachristi L., Paullinia pinnata L. Priesner in Hosny, 1943 Aleurochiton acerinus (Haupt, 1934) Morfološki ključ Opis in skica; Martin in sod., 2000 Avstrija, Bolgarija, Češka, Slovaška, Anglija, Francija, Nemčija, Madžarska, Italija, Poljska, Romunija, Sar- dinija, Sicilija, Slovenija, Hrvaška, Srbija, Črna Gora, Bosna in Hercegovina, Kosovo, Severna Makedonija Maklen (Acer campestre L.) Haupt, 1934 Aleurochiton aceris (Modeer, 1778) Morfološki ključ Opis in skica; Martin in sod., 2000 Avstrija, Bolgarija, Češka, Slovaška, Danska, Anglija, Finska, Francija, Nemčija, Madžarska, Italija, Litva, Nizozemska, Norveška, Poljska, Romunija, Švedska, Švica, Slovenija, Hrvaška, Srbija, Črna Gora, Bosna in Hercegovina, Kosovo, Severna Makedonija Ostrolistni javor (Acer platanoides L.), Acer tatari- cum L. Modeer, 1966 Aleurochiton pseudoplatani (Visnya, 1936) Morfološki ključ Opis in skica; Martin in sod., 2000 Avstrija, Češka, Slovaška, Francija, Nemčija, Madžarska, Italija, Nizozemska, Poljska, Romunija, Sicilija, Švica Trokrpi javor (Acer monspessulanum L.), italijanski javor (Acer opalus Mill.), beli javor (Acer pseudopla- tanus L.) Visnya, 1936 Aleuroclava similis (Takahashi, 1938) Morfološki ključ Opis in skica; Martin in sod., 2000 Avstrija, češka, Slovaška, Finka, Nemčija, Nizozemska, Norveška, Poljska, Švedska Bodika (Ilex spp.), Pieris japonieum (Thunb.) D. Don ex G. Don, rododendron (Rhododendron sp.), brusnica (Vaccinium vitis-idaea L.), Eurya japonica Thunb. Takahashi, 1938 Aleurolobus marlatti (Quaintance, 1903) Morfološki ključ Opis in skica; Martin in sod., 2000 Egipt, Jordanija, Malta, Sicilija, Lesnate rastline Quaintance, 1914 Aleurolobus olivinus (Silvestri, 1911) Morfološki ključ Opis in skica; Martin in sod., 2000 Korzika, Kreta, Ciper, Francija Grčija, Izrael, Italija, Jordan, Majorka, Maroko, Portugalska, Sardinija, Španija, Sicilija, Sirija, Turčija Erica arborea L., oljka (Olea europaea L.), ozkolistna zelenika (Phillyrea angustifolia L.), širokolistna zelenika (Phillyrea latifolia L.) Silvestri, 1915 Aleurolobus wunni (Ryberg, 1938) Morfološki ključ Opis in skica; Martin in sod., 2000 Avstrija, Bolgarija, Češka, Slovaška, Finska, Francija, Nemčija, Madžarska, Italija, Latvija, Litva, Poljska, Romunija, Švedska, Švica, Slovenija, Hrvaška, Srbija, Črna Gora, Severna Makedonija, Kosovo, Bosna in Hercegovina Navadni kopitnik (Asarum europaeum L.), Linnaea borealis L., dišeči kovačnik (Lonicera fragrantis- sima Lindl. & Paxton), črno kosteničevje (Lonicera nigra L.), tatarsko kosteničevje (Lonicera tatarica L.), bisernik (Symphoricarpos albus (L.) S. F. Blake), Symphoricarpos racemosus Michx., Phlomis sp., grozdnata svetilka (Cimicifuga sp.) navadni srobot (Clematis vitalba L.), Spiraea sp. Ryberg, 1978 Aleurotrachelus globulariae (Goux, 1942) Morfološki ključ Opis in skica; Martin in sod., 2000 Francija, Izrael, Maroko Globularia alypum L. Goux, 1942 Acta agriculturae Slovenica, 116/2 – 2020 373 Tradicionalne in molekularne metode za determinacijo ščitkarjev (Aleyrodidae) Nadaljevanje tabele 1 Continued table 1 Aleurotrachelus rhamnicola (Goux, 1940) Morfološki ključ Opis in skica; Martin in sod., 2000 Korzika, Kreta, Francija, Grčija, Italija, Majorka, Malta, Maroko, Portugalska, Sicilija, Španija Češmin (Berberis sp.), navadna jagodičnica (Arbutus unedo L.), hrast (Quercus sp.), marakuja (Passiflora edulis Sims.), navadni srobot, Rhamnus alaternus L., Rhamnus sp., navadna robida (Rubus fruticosus agg. L.), Ampelopsis sp. Goux, 1996 Aleurotuba jelinekii (Frauenfeld, 1867) Morfološki ključ Opis in skica; Martin in sod., 2000 Krf, Kreta, Anglija, Francija, Nemčija, Grčija, Italija, Maroko, Portugalska, Sicilija, Španija, Turčija, Slovenija, Hrvaška, Srbija, Črna Gora, Severna Makedonija, Ko- sovo, Bosna in Hercegovina Nepravi lovor (Viburnum tinus L.), brogovita (Vibur- num spp.), navadna jagodičnica, vednozeleni gornik (Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng.), mirta (Myrtus communis L.) Frauenfeld, 1867 Aleuroviggianus adanaensis (Bink-Moenen, 1992) Morfološki ključ Opis in skica; Martin in sod., 2000 Izrael, Rodos, Sirija, Turčija Quercus calliprinos Webb., hrast prnar (Quercus coc- cifera L.) Bink Moenen, 1992 Aleuroviggianus graecus (Bink-Moenen, 1992) Morfološki ključ Opis in skica; Martin in sod., 2000 Krf, Kreta Hrast prnar Bink Moenen, 1992 Aleuroviggianus halperini (Bink-Moenen, 1992) Morfološki ključ Opis in skica; Martin in sod., 2000 Izrael, Rodos, Turčija Quercus calliprinos, hrast prnar, Quercus ithaburensis Decne. Bink Moenen, 1992 Aleuroviggianus polymor- phus (Bink-Moenen, 1992) Morfološki ključ Opis in skica; Martin in sod., 2000 Francija, Maroko, Španija Quercus coccifera, Quercus ilex L., Quercus rotundifolia Lam., hrast plutovec (Quercus suber L.) Bink Moenen, 1992 Aleuroviggianus zonalus (Bink-Moenen, 1992) Morfološki ključ Opis in skica; Martin in sod., 2000 Albanija, Krf, Kreta, Kos, Rodos, Turčija Hrast prnar Bink Moenen, 1992 Aleyrodes asari (Schrank, 1801) Morfološki ključ Opis in skica; Martin in sod., 2000 Albanija, Avstrija, Češka, Slovaška, Nemčija, Madžarska, Litva, Poljska, Romunija Navadni kopitnik Schrank, 1932 Aleyrodes elevatus (Silvestri, 1934) Morfološki ključ Opis in skica; Martin in sod., 2000 Korzika, Francija, Izrael, Italija, Rodos, Sicilija, Španija, Turčija Enoletni golšec (Mercurialis annua L.), figa (Ficus carica L.), navadna krišina (Parietaria officinalis L.) Silvestri, 1934 Aleyrodes lonicerae (Walker, 1952) Morfološki ključ Opis in skica; Martin in sod., 2000 Avstrija, Korzika, Češka, Slovaška, Danska, Anglija, Finska, Francija, Nemčija, Madžarska, Izrael, Italija, Maroko, Nizozemska, Norveška, Poljska, Romunija, Sicilija, Švedska, Švica, Turčija, Slovenija, Hrvaška, Srbija, Črna Gora, Bosna in Hercegovina, Kosovo, Severna Makedonija Zelnate in lesne rastline iz družin kovačnikovke (Caprifoliaceae) in rožnice (Rosaceae) Walker, 1852 Aleyrodes proletella (Linnaeus, 1758) Morfološki ključ Opis in skica; Martin in sod., 2000 Vse evropske in mediteranske države Večina zelnatih rastlin Linnaeus, 1801 Aleyrodes singularis (Danzig, 1964) Morfološki ključ Opis in skica; Martin in sod., 2000 Jordanija, Sirija, Izrael Canarina canariensis (L.) Vatke., Lactuca serriola L., navadna škrbinka (Sonchus oleraceus (L.) Wall.), Crambe sp., mleček (Euphorbia spp.) Danzig, 1964 Asterobemisia carpini (Koch, 1857) Morfološki ključ Opis in skica; Martin in sod., 2000 Avstrija, Bolgarija, Češka, Slovaška, Danska, Anglija, Finska, Francija, Nemčija, Grčija, Madžarska, Italija, Nizozemska, Poljska, Romunija, Španija, Švedska, Slovenija, Hrvaška, Srbija, Črna Gora, Kosovo, Bosna in Hercegovina, Severna Makedonija Drevesne in grmičaste vrste Koch, 1857 Acta agriculturae Slovenica, 116/2 – 2020 374 M. DOBRAJC et. al. Nadaljevanje tabele 1 Continued table 1 Asterobemisia obenbergeri (Zahradník, 1961) Morfološki ključ Opis in skica; Martin in sod., 2000 Albanija, Bolgarija, Češka, Slovaška, Francija, Grčija, Madžarska, Poljska, Slovenija, Hrvaška, Srbija, Črna Gora, Bosna in Hercego- vina, Kosovo, Severna Makedonija Srčastolistna mračica (Globularia cordifolia L.), kraški šetraj (Satureja montana L.), timijan (Thymus spp.) Zahradnik, 1978 Asterobemisia paveli (Zahradník, 1961) Morfološki ključ Opis in skica; Martin in sod., 2000 Češka, Slovaška, Nemčija, Madžarska, Izrael, Romunija, Španija Mleček (Euphorbia spp.), dlakava košeničica (Genista pilosa L.), Daphne gnidium L. Zahradnik, 1978 Bemisia afer (Priesner & Hosny 1934) Morfološki ključ Opis in skica; Martin in sod., 2000 Korzika, Egipt, Anglija, Francija, Grčija, Izrael, Italija, Malta, Rodos, Sicilija, Španija, Turčija Polifagi Priesner in Hosny, 1970 Bemisia tabaci (Gennadius, 1889) Morfološki ključ Opis in skica; Martin in sod., 2000 Vse evropske in mediteranske države, večinoma s kontinentalnim podnebjem, predvsem v rastlinjakih Ekstremno polifagni Gennadius, 1936 Bulgarialeurodes cotesii (Maskell, 1896)  Morfološki ključ Opis in skica; Martin in sod., 2000 Bolgarija, Madžarska, Romunija, Turčija, Slovenija, Hrvaška, Srbi- ja, Črna Gora, Bosna in Hercegovina, Kosovo, Severna Makedonija Damaščanska vrtnica (Rosa damascena Mill.), vrtnica (Rosa sp.) Maskell, 1960 Calluneyrodes callunae (Ossiannilsson, 1947) Morfološki ključ Opis in skica; Martin in sod., 2000 Češka, Slovaška, Finska, Portugalska, Švedska Jesenska vresa (Calluna vulgaris (L.) Hull.), vresa (Calluna sp.), Erica arborea L., resa (Erica sp.) Ossiannilsson, 1961 Dialeurodes chittendeni (Laing, 1928) Morfološki ključ Opis in skica; Martin in sod., 2000 Belgija, Češka, Slovaška, Danska, Anglija, Finska, Nemčija, Italija, Nizozemska, Švedska, Švica Rododendron (Rhododendron spp.) Laing, 1928 Dialeurodes citri (Ashmead, 1885) Morfološki ključ Opis in skica; Martin in sod., 2000 Alžirija, Korzika, Egipt, Francija. Grčija, Izrael, Italija, Libanon, Malta, Maroko. Sardinija, sicilija, Španija. Tunizija. Turčija, Slove- nija, Hrvaška, Srbija, Črna Gora, Bosna in Hercegovina, Kosovo, Severna Makedonija Kritosemenke Ashmead, 1916 Dialeurodes kirkaldyi (Kotinsky, 1907) Morfološki ključ Opis in skica; Martin in sod., 2000 Ciper, Egipt, Izrael, Libanon, Portugalska, Sirija Lesnate vrste Kotinsky, 1914 Dialeurodes setiger (Goux, 1939) Morfološki ključ Opis in skica; Martin in sod., 2000 Krf, Korzika, Francija, Italija, Maroko, Španija Nepravi lovor, navadna jagodičnica Goux, 1999 Dialeurolobus rhamni (Bink-Moenen, 1992) Morfološki ključ Opis in skica; Martin in sod., 2000 Izrael, Turčija Granatno jabolko, Rhamnus palaestina L. Bink Moenen, 1992 Neopealius rubi (Takahashi, 1954) Morfološki ključ Opis in skica; Martin in sod., 2000 Bolgarija, Finska, Francija, Madžarska, Poljska, Švedska, Turčija Večina lesnatih rastlin Takahashi, 1954 Parabemisia myricae (Kuwana 1927) Morfološki ključ Opis in skica; Martin in sod., 2000 Kreta, Ciper, Egipt, Grčija, Izrael, Italija, Sardinija, Sicilija, Španija, Tunizija, Turčija Večina lesnatih rastlin Kuwana, 1952 Pealius azaleae (Baker & Moles, 1920) Morfološki ključ Opis in skica; Martin in sod., 2000 Belgija, Anglija, Italija, Nizozemska, Škotska Rododendron (Rhododendron spp.) Baker in Moles, 1920 Pealius quercus (Signoret, 1868) Morfološki ključ Opis in skica; Martin in sod., 2000 Finska, Francija, Nemčija, Madžarska, Irska, Litva,Nizozemska, Poljska, Romunija, Škotska, Švedska, Wales Bukovke (Fagaceae), brezovke (Betulaceae) Signoret, 1939 Simplaleurodes hemisphaerica (Goux, 1945) Morfološki ključ Opis in skica; Martin in sod., 2000 Krf, Korzika, Kreta, Francija, Italija, Maroko, Španija Zelenika (Phillyrea spp.) Goux, 1945 Siphoninus immaculatus (Heeger, 1856) Morfološki ključ Opis in skica; Martin in sod., 2000 Avstrija, Češka, Slovaška, Anglija, Nemčija, Madžarska, Irska, Italija, Švedska, Švica, Wales Navadni bršljan (Hedera helix L.) Heeger, 1940 Acta agriculturae Slovenica, 116/2 – 2020 375 Tradicionalne in molekularne metode za determinacijo ščitkarjev (Aleyrodidae) Nadaljevanje tabele 1 Continued table 1 Siphoninus phillyreae (Haliday, 1835) Morfološki ključ Opis in skica; Martin in sod., 2000 Avstrija, Češka, Slovaška, Anglija, Nemčija, Madžarska, Irska, Italija, Švedska, Švica, Wales Navadni bršljan Haliday, 1940 Tetraleurodes bicolor (Bink-Moenen, 1992) Morfološki ključ Opis in skica; Martin in sod., 2000 Izrael, Turčija Mirta Bink Moenen, 1992 Tetraleurodes hederae (Goux, 1939) Morfološki ključ Opis in skica; Martin in sod., 2000 Francija, Italija, Malta, Sicilija Navadni bršljan Goux, 1939 Tetraleurodes neemani (Bink-Moenen, 1992) Morfološki ključ Opis in skica; Martin in sod., 2000 Ciper, Izrael, Libanon, Rodos, Sirija, Turčija Nepravi lovor, Arbutus andrachne L., navadni lovor (Laurus nobilis L.), navadni jedikovec (Cercis siliquastrum L.), mirta, Rhamnus alaternus, limona (Citrus limon (L.) Osbeck), vinska trta (Vitis sp.) Bink Moenen, 1992 Tetralicia ericae (Harrison, 1917) Morfološki ključ Opis in skica; Martin in sod., 2000 Avstrija, Korzika, Krf, Kreta, Češka, Slovaška, Danska, An- glija, Francija, Nemčija, Italija, Majorka, Malta, Nizozemska, Portugalska, Škotska, Sicilija, Španija, Švedska, Švica, Wales Resa (Erica spp.) Harrison, 1917 Tetralicia iberiaca (Bink-Moenen, 1989) Morfološki ključ Opis in skica; Martin in sod., 2000 Portugalska, Španija Erica arborea, Erica lusitanica Rudolphi Bink Moenen, 1989 Trialeurodes ericae (Bink-Moenen, 1976) Morfološki ključ Opis in skica; Martin in sod., 2000 Korzika, Kreta, Anglija, Francija, Italija, Majorka, Nizozem- ska, Portugalska, Španija Resa (Erica spp.) Bink Moenen, 1976 Trialeurodes lauri (Signoret, 1862) Morfološki ključ Opis in skica; Martin in sod., 2000 Francija, Grčija, Izrael, Italija, Malta, Sicilija, Turčija, Slovenija, Hrvaška, Srbija, Črna Gora, Bosna in Hercego- vina, Kosovo, Severna Makedonija Arbutus andrachne, navadni lovor Signoret, 1947 Trialeurodes packardi (Morrill, 1903) Morfološki ključ Opis in skica; Martin in sod., 2000 Madžarska Navadni jagodnjak (Fragaria vesea L.) Morrill, 1915 Trialeurodes ricini (Misra, 1924) Morfološki ključ Opis in skica; Martin in sod., 2000 Egipt Kritosemenke Misra, 1931 Trialeurodes sardiniae (Rapisarda, 1986) Morfološki ključ Opis in skica; Martin in sod., 2000 Sardinija Erica arborea Rapisarda, 1986 Trialeurodes vaporariorum (Westwood, 1856) Morfološki ključ Opis in skica; Martin in sod., 2000 Večina evropskih in mediteranskih držav Ekstremno polifagni Westwood, 1856 Acta agriculturae Slovenica, 116/2 – 2020 376 M. DOBRAJC et. al. in jo nato prenesti v program za predpripravo (slika 2), segmentacijo in SVM (angl. support vector ma- chines) klasifikacijo. Raztezanje kontrasta (slika 3) je tehnika, ki izboljša kontrast vhodne fotografije, saj je potrebno pred izvedbo k-algoritma izboljšati kvalite- to fotografije (Uma Rani in Amsini, 2016). 3.1.2 K-vrednost grozdenje Segmentacija fotografije je klasifikacija obmo- čij na fotografiji v posamezne skupine. K-vrednostni algoritem omogoča grozdenje podatkov in segmen- tiranje primernih objektov od ozadja. K-vrednost grozdenje je metoda vektorske kvantizacije. Grozd je zbirka podobnih objektov, ki se razlikujejo od groz- da ostalih objektov. Grozdenje (slika 4) je posledica vhodne RGB fotografije, v drugem koraku se ustvari- jo zelene slikovne točke v procesu segmentacije foto- grafije, tretji korak je statistična obdelava uporabnih segmentov fotografije in v četrtem koraku izbrani deli fotografije preidejo v proces klasifikacije. Uspešnost algoritmov pri detekciji rastlinskih bolezni je kar 94 %. Posebna pozornost je namenjena tudi prepoznava- nju škodljivcev za namen determinacije in biotičnega varstva rastlin. Metoda temelji na barvnem hologra- mu, prepoznavanju robov in ekstrakciji pomembnih elementov (Uma Rani in Amsini, 2016). 3.1.1 Predpriprava fotografije za obdelavo V sklopu priprave fotografije je potrebno posneti fotografijo poškodovanega lista rastline ali škodljivca Slika 2: Vhodna fotografija škodljivca (Uma Rani in Amsini, 2016). Figure 2: A sample leaf image with whiteflies (Uma Rani in Amsini, 2016). Slika 3: Raztezanje kontrasta (Uma Rani in Amsini, 2016) Figure 3: The leaf image after preprocessing (Uma Rani in Amsini, 2016). Acta agriculturae Slovenica, 116/2 – 2020 377 Tradicionalne in molekularne metode za determinacijo ščitkarjev (Aleyrodidae) statistične analize, prepoznavanja in obdelave vhodne fotografije ter medsebojno podobnih območij. Zaradi enostavnosti in učinkovitosti je ena izmed prvih teh- nik segmentacije fotografij. Za takšno obliko analize je potreben program Mat Lab. Kvaliteta analize se odraža v večjem številu grozdov. V kolikor je število grozdov manjše, je kvaliteta analize vprašljiva (Uma Rani in Amsini, 2016). 3.1.3 SVM klasifikator SVM (angl. support vector machine) je močno orodje v binarni klasifikaciji, ki hitro generira prido- bljene podatke. Regresijske in klasifikacijske analize so osnova za SVM klasifikator. Ocena klasifikatorja temelji na vhodnem območju, ki se generira kot »pra- vilno« in »nepravilno« (slika 5), kar predstavlja bi- narno klasifikacijo fotografije (Uma Rani in Amsini, 2016). 3.1.4 Natančnost ocene poškodovanega območja in parametri ocene Škodljivci, kot so ščitkarji, so manjših velikosti in napadajo liste rastlin. Samice izležejo do 150 jaj- čec, okoli 25 na dan. Življenjski krog ščitkarjev traja 21–36 dni. Regija poškodovanega in napadenega lista ali škodljivca se tako izračuna s SVM klasifikatorjem. Parametri k-vrednosti klasifikacijske metode so pov- prečje, standardna deviacija, entropija, RMS, varian- ca, gladkost podlage, kontrast, korelacija in homoge- nost vzorca (Uma Rani in Amsini, 2016). Slika 4: Grozdenje medsebojno podobnih območij (Uma Rani in Amsini, 2016). Figure 4: Clustering process diagram (Uma Rani in Amsini, 2016). Slika 5: Binarna klasifikacija pridobljenih podatkov (Uma Rani in Amsini, 2016). Figure 5: SVM binary classification (Uma Rani in Amsini, 2016). Acta agriculturae Slovenica, 116/2 – 2020 378 M. DOBRAJC et. al. 3.1.5 Rezultati Vhodna fotografija nastane z digitalnim fotoapa- ratom in je popolnoma neobdelana, zato jo je potrebno pripraviti na statistično analizo s k-povprečjem barv in tehniko segmentacije. Nato lahko s SVM klasifikator- jem natančno izračunamo območje poškodovane regije ali škodljivca (slika 6) (Uma Rani in Amsini, 2016). 3.2 MOLEKULARNA IDENTIFIKACIJA Zaradi dolgotrajnega in omejenega morfološke- ga določanja vrst ščitkarjev, kjer je za le-to ustrezna le stopnja puparija, so se razvile številne molekularne me- tode, kjer vzorec predstavlja odrasla žuželka ščitkarja. Identifikacija odraslih osebkov ščitkarjev je zapletena, pri čemer pa je omejena na gostiteljske rastline dolo- čene vrste, kar pogosto privede do zapletov pri pre- poznavanju novih vrst. Za določanje vrst ščitkarjev je v uporabi analizna metoda na osnovi mitohondrijske citokrom oksidaze I (COI). Gen COI je eden izmed tri- najstih genov, ki kodirajo proteine znotraj mitohondrij- skega genoma. Gradi ga 512 aminokislin, ki so urejene iz konca 5‘ tRNA-Trp-Tyr-Cys in na 3‘ koncu tRNK-Cys (Hajibabaei in sod., 2007). Po sekvenciranju pridoblje- ne rezultate vnesemo v bazo podatkov GenBank, EMBL ali BOLD. Informacije iz posamezne baze so omogo- čile določitev vrste ščitkarja (Ovalle in sod., 2014). Na osnovi pridobljenih sekvenc in znanih aminokislinskih zaporedij je mogoče izdelati taksonomsko drevo, iz ka- terega je razvidna filogenetska povezava posameznih vrst ščitkarjev. Izdelano taksonomsko drevo je pogosto v veliko pomoč morfološki determinaciji posamezne vrste (Ovalle in sod., 2014). Pri nekaterih vrstah ščitkarjev je mogoče določiti tudi posamezne biotipe. T obakov ščitkar je vrsta ščitkar- ja, za katero velja izrazita genetska raznolikost, ki pa je ni moč zaznati morfološko, zato je determinacija posa- meznega biotipa mogoča le z molekularno tehnologijo. Genetski polimorfizem so sprva proučevali na omenje- ni vrsti na osnovi vzorcev esteraz (Brown in sod., 1995). Ta metoda ima še vedno veliko vrednost pri določanju biotipov, predvsem zaradi zgodovinskih povezav. Z na- menom prepoznavanja posameznih biotipov vrste to- bakov ščitkar so v uporabi številni biokemijski in mole- kularni markerji (Frohlich in sod., 1999), ki omogočajo prepoznavo polimorfizma znotraj vrste. Med številnimi nekodirajočimi in kodirajočimi regijami, ki predstavlja- jo molekulske markerje, ima mtCOI sekvenca največjo variabilnost pri posamezni vrsti, kar doprinese največje število informacij o raznolikosti posameznih biotipov znotraj vrste. Z napredkom molekularne tehnologije je v zadnjem obdobju v uporabi PCR v realnem času, to je implementacija 5‘ nukleaznega fluorogenega testa, zna- nega kot TaqMan PCR v realnem času. TaqMan analiza temelji na sekvenci specifično označene oligonukleoti- dne sonde, ki se pripne na tarčno DNK znanih začetnih oligonukleotidov. Metoda TaqMan temelji na hidrolizi sond. Pri podaljševanju verige se sonda odcepi od tarče, poročevalec se loči od dušilca, pri čemer nastane fluore- scenca, ki se za vsak cikel prikazuje na zaslonu naprave PCR v realnem času. Fluorescenčni signal je enak koli- čini proučevanega produkta v vzorcu. Prednosti upo- rabe TaqMan metode in analize PCR v realnem času je izredna občutljivost, natančnost, specifičnost in upora- ba splošnih generičnih nastavitev za posamezni cikel. Rezultati so grafični prikaz občutljive detekcije biotipov znotraj vrste tobakov ščitkar (slika 7) (Papayiannis in sod., 2009). Slika 6: Segmentacija škodljivca (Uma Rani in Amsini, 2016). Figure 6: Segmentation of leaf pest (Uma Rani in Amsini, 2016). Acta agriculturae Slovenica, 116/2 – 2020 379 Tradicionalne in molekularne metode za determinacijo ščitkarjev (Aleyrodidae) 4 SKLEPI V primerjavi z listnimi ušmi (Aphidoidea) in ce- lotnim razredom žuželk, so ščitkarji vrstno manj pestra skupina. Eden izmed razlogov je kompleksna in nena- tančna morfološka determinacija, pomanjkljivi in pod- družinsko specifični določevalni ključi ter problematična zgodovina taksonomije. Pomanjkljiva sistematika in ta- ksonomija temelji predvsem na morfološki determinaciji ščitkarjev le na podlagi značilnosti puparija, ki ima velik potencial filogenetske variabilnosti tudi znotraj vrst. Prav to je vodilo v večkratno opisovanje istih vrst (Martin in Mound, 2007). Zaradi omejene in otežene morfološke determinacije so se razvile številne moderne tehnike de- terminacije ščitkarjev, med katerimi sta najpogosteje v uporabi programska oprema Proposed system in mole- kularne analize specifičnih genov ter PCR v realnem času. Računalniško procesiranje fotografije je pomembna teh- nika zgodnjega odkrivanja in prepoznavanja škodljivcev na rastlinah in pripomore k nadaljnjim ukrepom varstva rastlin (Uma Rani in Amsini, 2016). COI sekvenčna ana- liza je natančna in učinkovita metoda vrstne identifikaci- je ščitkarjev. Molekularne metode so pomemben element hitrega in natančnega določanja vrste ter uporabne pri identifikaciji domačih vrst in napovedi invazivnih vrst po vdoru na novo območje. Molekularna diagnostika omogoča identifikacijo intraspecifičnih sprememb zno- traj vrste, spremljanje širjenja posamezne vrste, napoved pojava naravnih sovražnikov ščitkarjev in s tem načrto- vanje biotičnega zatiranja tega škodljivca (Ovalle in sod., 2014). Primer kriptične vrste je B. tabaci, saj bioloških in genetskih variacij te vrste ni mogoče morfološko ločiti med seboj. Pri tem imajo pomembno vlogo molekularne metode, ki omogočajo določitev posameznih markerjev, na podlagi katerih lahko razlikujemo posamezne biotipe in polimorfizem vrste. Med številnimi nekodirajočimi in kodirajočimi markerji, se največja variabilnost kaže znotraj gena mtCOI, kar doprinese veliko količino in- formacij o razlikah znotraj vrste in posameznega biotipa (Papayiannis in sod., 2009). Pomembnost in natančnost molekularnih pristopov se izraža tudi pri določanju se- znama karantenskih organizmov. Zaradi zgolj morfolo- ške determinacije, ščitkarji pogosto niso uvrščeni na se- znam karantenskih organizmov, saj je glede na določitev na območju zastopana le ena, neinvazivna vrsta. Moleku- larne metode so pogosto potrdile zastopanost dveh vrst na določenem območju, kjer je bila morfološko določena le ena vrsta, kar je omogočilo prepoznavanje in uvrsti- tev invazivnih vrst na seznam karantenskih organizmov (Malumphy in sod., 2009). 5 VIRI Andreason, S. A., Arif, M., Brown, J. K., Ochoa-Corona, F., Fletcher, J., Wayadande, A. (2017). Single-target and multi- plex discrimination of whiteflies (Hemiptera: Aleyrodidae) Bemisia tabaci and Trialeurodes vaporariorum with modi- fied priming oligonucleotidet. Journal of Economic Ento- mology, 1–10. https://doi.org/10.1093/jee/tox125 Bink-Moenen, R. M. & Gerling, D. (1990). Aleyrodidae of Is- rael. Bollettino del Laboratorio di zoologia generale e agraria della R. Scuola superiore d‘agricoltura in Portici (Filippo Sil- vestri), 47, 3–39. Brown, J. K., Coats, S. A., Bedford, I. D., Markham, P . G., Bird, J., Frohlich, D. R. (1995). Characterization and distribution Slika 7: Prikaz občutljivosti metode PCR v realnem času glede na RT-PCR za biotip B vrste tobakov ščitkar (Papayiannis in sod., 2009). Figure 7: Sensitivity of the qPCR assay for B. tabaci biotype B detection compared with conventional PCR (Papayiannis in sod., 2009). Acta agriculturae Slovenica, 116/2 – 2020 380 M. DOBRAJC et. al. of esterase electromorphs in the whitefly Bemisia tabaci (Genn.) (Homoptera: Aleyrodidae). Biochemical Genetics, 33, 205–214. https://doi.org/10.1007/BF02401851 Botha, J., Hardie, D., Power, G. (2000). Spiraling whitefly Aleu- rodicus dispersus: Exotic threat to Western Australia. Fact Sheet. Brown, W. M., George, M., Wilson, A. C. (1979). Rapid evo- lution of animal mitochondrial DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences, 76, 1967–1971. https://doi. org/10.1073/pnas.76.4.1967 Byrne, D. N.& Bellows, Jr. T. S. (1991). Whitefly biology. An- nual Review of Entomology, 36, 431–457. https://doi. org/10.1146/annurev.en.36.010191.002243 Caldeira, R. L., Carvalho, O. S., Mendonca, C. L., Graeff-Teixei- ra, C., Silva, M. C. F ., Ben, R., Maurer, R., Lima, W . S., Lenzi, H. L. (2003). Molecular differentiation of Angiostrongylus costaricensis, A. cantonensis, and A. vasorum by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz, 98, 1039–1043. htt- ps://doi.org/10.1590/S0074-02762003000800011 Calvert, L. A., Cuervo, M., Arroyave, J. A., Constantino, L. M., Bellotti, A., Frohlich, D. (2001). Morphological and mito- chondrial DNA marker analyses of whiteflies (Homoptera: Aleyrodidae) colonizing cassava and beans in Colombia. Annals of the Entomological Society of America, 94, 512–519. https://doi.org/10.1603/0013-8746(2001)094[0512:MAMD MA]2.0.CO;2 Campbell, B. C., Duffus, J. E., Baumann, P ., Bartlett, A. C., Gaw- el, N. J., Perring, T . M., Farrar, C. A., Cooper, A. D., Bellows, Jr. T. S., Rodriguez, R. J. (1993). Determining whitefly spe- cies. Science, 261, 1333–1335. https://doi.org/10.1603/0013- 8746(2001)094[0512:MAMDMA]2.0.CO;2 Frohlich, D. R., Torres-Jerez, I., Bedford, I. D., Markham, P. G., Brown, J. K. (1999). A phylogeographic analysis of the Bemisia tabaci species complex based on mitochondrical DNA markers. Molecular Ecology, 8, 1683–1691. https:// doi.org/10.1046/j.1365-294x.1999.00754.x Francis, A. W., Stocks, I., Smith, T. R., Boughton, A. J., Man- nion, C. M., Osborne, L. S. (2016). Host plants and natural enemies of rugose spiraling whitefly (Hemiptera: Aleyro- didae) in Florida. Florida Entomologist, 99(1), 150–153. https://doi.org/10.1653/024.099.0134 Ghahari, H., Abd-Rabou, S., Zahradnik, J., Ostovan, H. (2009). Annotated catalogue of whiteflies (Hemiptera: Sternor- rhyncha: Aleyrodidae) from Arasbaran, Northwestern Iran. Journal of Entomology and Nematology, 1, 7–18. Gill, R. (1990). The morphology of whiteflies. Intercept LTD, United Kingdom, 13–46. Guershon, M. & Gerling, D. (2001). Effect of foliar tomentosity on phenotypic plasticity in Bemisia tabaci (Hom., Aleyrodi- dae). Journal of Applied Entomology, 125, 449–453. https:// doi.org/10.1046/j.1439-0418.2001.00571.x Habib, A., Farag, F. A. (1970). Studies on nine common aleuro- dids of Egypt. Bulletin de la Société Entomologique d’Egypte, 54, 1–41. Hajibabaei, M., Singer, G. A. C., Hebert, P. D. N., Hickey, D. A. (2007). DNA barcoding: how it complements taxon- omy, molecular phylogenetics and population genetics. Trends in Genetics, 23, 167–172. https://doi.org/10.1016/j. tig.2007.02.001 Hebert, P . D. N., Cywinska, A., Ball, S. L., de W aard, J. R. (2003). Biological identifications through DNA barcodes. Proceed- ings of the Royal Society B: Biological Sciences, 270, 313–321. https://doi.org/10.1098/rspb.2002.2218 Hebert, P. D., Ratnasingham, S., de Waard, J. R. (2003). Bar- coding animal life: cytochrome c oxidase subunit 1 diver- gences among closely related species. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences, 270, 96–99. https://doi. org/10.1098/rsbl.2003.0025 Hoddle, M. S. (2004). The biology and management of silverleaf whitefly, Bemisia argentifolii Bellows and Perring (Homop- tera: Aleyrodidae) on greenhouse grown ornamentals. Ap- plied Biological Control Research. Hodges, G. S. & Evans, G. A. (2005). An identification guide to the whiteflies (Hemiptera: Aleyrodidae) of southeastern united states. Florida Entomologist, 88, 518–534. https://doi. org/10.1653/0015-4040(2005)88[518:AIGTTW]2.0.CO;2 Kress, W. J. & Erickson, D. L. (2008). DNA barcodes: genes, genomics, and bioinformatics. Proceedings of the Na- tional Academy of Sciences, 105, 2761–2762. https://doi. org/10.1073/pnas.0800476105 Kwong, S., Srivathsan, A., Meier, R. (2012). An update on DNA barcoding: low species coverage and numerous uni- dentified sequences. Cladistics, 28, 639–644. https://doi. org/10.1111/j.1096-0031.2012.00408.x Lunt, D. H., Zhang, D. X., Szymura, J. M., Hewltt, O. M. (1996). The insect cytochrome oxidase I gene: evolution- ary patterns and conserved primers for phylogenetic studies. Insect Molecular Biology, 5, 153–165. https://doi. org/10.1111/j.1365-2583.1996.tb00049.x Malumphy, C., Walsh, K., Suarez, M. B., Collins, D. W ., Boon- ham, N. (2009). Morphological and molecular identifica- tion of all developmental stages of four whitefly species (Hemiptera:Aleyrodidae) commonly intercepted in quar- antine. Zootaxa, 2118, 1–29. https://doi.org/10.11646/ zootaxa.2118.1.1 Martin, J. H. (1985). The whitefly of New Guinea (Homoptera: Aleyrodidae). Bulletin of the British Museum (Entomology), 50(3), 303–351. Martin, J. H. (1987). An identification guide to common white- fly pest species of the world (Homoptera, Aleyrodidae). Tropical Pest Management, 33(4), 298–322. https://doi. org/10.1080/09670878709371174 Martin, J. H. (1999). The whitefly fauna of Australia (Sternor - rhyncha: Aleyrodidae). A taxonomic account and identifi- cation guide. Technical Paper, 38, 197. Martin, J. H. & Mound, L. A. (2007). An annotated check list of the world’s whiteflies (Insecta: Hemiptera: Aleyrodidae). Zootaxa, 1–84. https://doi.org/10.11646/zootaxa.1492.1.1 Martin, J., Mifsud, D., Rapisarda, C. (2000). The whiteflies (He- miptera: Aleyrodidae) of Europe and the Mediterranean basin. Bulletin of Entomological Research, 90, 407–448. ht- tps://doi.org/10.1017/S0007485300000547 Mifsud, D. (1995). Whiteflies of the Maltese Islands (Homop- tera, Aleyrodidae). Central Mediterranean Naturalist, 2(3), 61–78. Milevoj, L. (2003). Prsokljunci – Sternorryncha. V: Živalstvo Acta agriculturae Slovenica, 116/2 – 2020 381 Tradicionalne in molekularne metode za determinacijo ščitkarjev (Aleyrodidae) Slovenije. Sket B., Gogala M., Kuštor V. (ur.). Ljubljana. Tehniška založba Slovenije. 355–361. Mound, L. A. (1966). A revision of the British Aleyrodidae (He- miptera: Homoptera). Bulletin of the British Museum (Na- tional History), 17(9), 397–428. https://doi.org/10.5962/bhl. part.14809 Oliveira, M. R. Vd., Tigano, M. S., Aljanabi, S. (2000). Mole- cular characterization of whitefly (Bemisia spp.) in Brazil. Pesquisa Agropecuaria Brasileira, 35, 1261–1268. https:// doi.org/10.1590/S0100-204X2000000600023 Ovalle, T. M., Parsa, S., Hernandez, M. P., Becerra Lopez-La- valle, L. A. (2014). Reliable molecular identification of nine tropical whitefly species. Ecology and Evolution, 4(19), 3778–3787. https://doi.org/10.1002/ece3.1204 Papayiannis, L. C., Brown, J. K., Seraphides, N. A., Hadjistylli, M., Ioannou, N., Katis, N. I. (2009). A real time PCR assay to differentiate the B and Q biotypes of the Bemisia taba- ci complex in Cyprus. Bulletin of Entomological Research, 1–10. https://doi.org/10.1017/S0007485308006603 Perring, T. M., Farrar, C. A., Bellows, T. S., Cooper, A. D., Rodrigues, R. J. (1993). Evidence for a new species of whi- tefly: UCR findings and implications. California agriculture, 47(1), 7–8. https://doi.org/10.3733/ca.v047n01p7 Perring, T . M., Stansly, P A., Liu, T . X., Smith, A. H., Andreason, S. A. (2018). Whiteflies: Biology, Ecology, and Management. Sustainable Management of Arthropod Pests of Tomato. El- sevier, 73–110. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-802441- 6.00004-8 Ptaszynska, A. A., Le Ztowski, J., Gnat, S., Malek, W. (2012). Application of COI sequences in studies of phylogenetic relationships among 40 Apionidae species. Journal of Insect Science, 12, 1–14. https://doi.org/10.1673/031.012.1601 Radonjić, S., Hrnčić, S., Malumphy, C. (2014). First record of Aleurocanthus spiniferus (Quaintance) (Hemiptera Aleyro- didae) in Montenegro. Redia, 141–145. Shatters, R. G., Powell, C. A., Boykin, L. M., Liansheng, H., McKenzie, C. L. (2009). Improved DNA barcoding method for Bemisia tabaci and related Aleyrodidae: development of universal and Bemisia tabaci biotype-specific mitochon- drial cytochrome coxidase I polymerase chain reaction primers. Journal of Economic Entomology, 102, 750–758. https://doi.org/10.1603/029.102.0236 Smith, M. A., Bertrand, C., Crosby, K., Eveleigh, E. S., Fernan- dez-Triana, J., Fisher, B. L., Gibbs, J.,… Zhou, X. (2012). Wolbachia and DNA barcoding insects: patterns, potential, and problems. PLoS One. https://journals.plos.org/ploso- ne/article?id=10.1371/journal.pone.0036514. https://doi. org/10.1371/journal.pone.0036514 Šimala, M., Masten Milek, T., Pintar, M. (2015). The whitefly species (Hemiptera, Aleyrodidae) with dark puparium and pupal case recorded in Croatia. Natura Croatica, 24, 111– 125. https://doi.org/10.20302/NC.2015.24.6 Takahashi, R. (1952). Aleurotuberculatus and Parabemisia of Japan (Aleyrodidae, Homoptera). Miscellaneous Reports of the Research Institute for Natural Resources, 25, 17–24. Takahashi, R. (1954). Key to the tribes and genera of Aleyro- didae of Japan, with descriptions of three new genera and one new species (Homoptera). Insecta Matsumurana, 18, 47–53. Thyssen, P . J., Lessinger, A. C., Azeredo-Espin, A. M., Linhares, A. X. (2005). The value of PCR-RFLP molecular markers for the differentiation of immature stages of two necropha- gous flies (Diptera: Calliphoridae) of potential forensic im- portance. Neotropical Entomology, 34, 777–783. Trdan, S. (2015). Ščitkarji in prenos virusov s ščitkarji. V: Mavrič Pleško I. (ur.) Prenosi rastlinskih virusov. Ljubljana, Kmetijski inštitut Slovenije. 87–100. Uma Rani, R. & Amsini, P. (2016). Pest Identification in Leaf Images using SVM Classifier. International Journal of Com- putational Intelligence and Informatics, 6, 30–41. Trdan, S., Kač, M., Bobnar, A., Modic, Š. (2003). Research on the efficacy of the yellow sticky boards to control the cabbage whitefly (Aleyrodes proletella L., Aleyrodidae) on Brussels sprouts. Zbornik Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani, 81(1), 171–177. Vidigal, T. H., Montresor, L. C., Simpson, A. J., Carvalho, O. S. (2002). Polymerase chain reaction and restriction frag- ment length polymorphism of cytocrome oxidase subunit I used for differentiation of Brazilian Biomphalaria species intermediate host of Schistosoma mansoni. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz, 97, 47–52. https://doi.org/10.1590/ S0074-02762002000900011 Watson, G. W. (2007). Identification of whiteflies (Hemiptera: Aleyrodidae). APEC Re-entry workshop on whiteflies and mealybugs in Malaysia. International Journal of Advanced Research. Watson, G. W. & Chandler, L. R. (1999). Identification of Me- alybugs important in the Carribean Region with notes on preparation of whitefly pupae for identification. Com- monwealth Science and CAB International, 40. Wilkey, R. F. (1962). A simplified technique for clearing, stai- ning and permanently mounting small arthropods. Annals of the Entomological Society of America, 55, 606. https://doi. org/10.1093/aesa/55.5.606