Pregledni œlanki - Review Articles
Uporaba celiœnih kultur parenhimskih jetrnih celic (hepatocitov) pri razvoju novih zdravil
The use of primary hepatocyte cultures in drug discovery and development
Tina Batista Napotnik, Irena Mlinariœ-Raøœan
POVZETEK: Celiœne kulture jetrnih celic (hepatocitov) uporabljamo v predkliniœnih øtudijah novih zdravilnih uœinkovin kot vmesni œlen med biokemiœnimi in in vivo poskusi. In vitro modeli so enostavni, dajo hitre rezultate v strogo nadzorovanih pogojih, omogoœajo dobro ponovljivost in lahko kvantifikacijo. Tako dobimo øtevilne informacije o molekularnem mehanizmu, biotransformaciji, farmakokinetiki in toksiœnosti preiskovanih snovi ter zmanjøamo øtevilo ærtvovanih æivali in prostovoljcev v kliniœnih testiranjih. Z uporabo primarnih œloveøkih hepatocitov lahko ugotavljamo tudi dejavnike starosti, spola in okolja ter individualne razlike v odzivanju na uœinkovine. Ker so primarni œloveøki hepatociti teæko dostopni, celice razliœnih darovalcev shranjujemo z zamrzovanjem. Hepatocitne celiœne linije imajo sposobnost delitve celic in so tako na voljo v neomejenem øtevilu, vendar pa so fenotipske lastnosti slabøe izraæene kot v primarnih hepatocitih, zato je treba biti pazljiv pri interpretaciji rezultatov.
KLJUŒNE BESEDE: jetra, hepatocit, celiœna kultura, celiœna linija, predkliniœne øtudije
ABSTRACT: Cultured hepatocytes are used in preclinical studies of drugs as a link between biochemical and in vivo assays. The in vitro models are simple, with quick acquisition of data in a highly controlled environment. The data can easily be quantified and reproduced. Primary hepatic cultures are suitable for investigating molecular mechanisms, the biotransformation, the pharmacokinetics and the toxicity of novel compounds, therefore the number of laboratory animals and volunteers in clinical trials can be reduced. Primary human hepatocytes are used to study the effects of age, sex and environment factors, and the interindividual variability in response to drugs. Human hepatocytes are very scarce thus the cells derived from the different donors are cryopreserved. Hepatic cell lines are immortalized and therefore available at a large number of cells, but the expression of hepatic functions is lower than in primary hepatocytes so the prediction to in vivo data is always prone to some degree of uncertainty.
KEY WORDS: liver, hepatocyte, cell culture, cell line, preclinical studies
1 Uvod
Odkrivanje in optimizacija novih zdravilnih uœinkovin zahteva hitre in ponovljive teste. V predkliniœnih øtudijah se je tako pojavila nova stopnja testiranja – uporaba in vitro modelov (1).
Biotransformacija ksenobiotikov ima poslediœno terapevtske ali pa toksiœne uœinke. Proces biotransformacije sicer poteka v razliœnih tkivih, vendar so jetra najaktivnejøi organ pri doloœanju usode kseno-biotikov. Z razvojem metod izolacije in kultivacije parenhimskih jetrnih celic (hepatocitov) je mogoœe v strogo nadzorovanih in vitro pogojih ugotavljati mehanizme uœinkovanja in biotransformacije snovi na celiœnem in molekularnem nivoju (2).
Med in vitro modele jeter øtejemo oœiøœene jetrne frakcije in enoencimske sisteme, izolirane jetrne celice in hepatocitne celiœne kulture, jetrne rezine, pretoœne sisteme celotnih izoliranih jeter in raœu-nalniøke modele. Prednosti in slabosti in vitro modelov jeter so zbrane v preglednici 1. Najpogosteje uporabljamo izolirane in kultivirane hepatocite (1, 3, 4), ki delujejo kot vmesni œlen med biokemiœnimi in in vivo poskusi. Œeprav in vitro modeli ne morejo v celoti nadomestiti in vivo poskusov, imajo pred njimi øtevilne prednosti. Modele hitro postavimo, mogoœe jih je avtomatizirati, dajo hitre rezultate, pogoje lahko strogo nadzorujemo, omogoœajo dobro ponovljivost in lahko kvantifikacijo,  so  ekonomiœni.  Izloœimo  tudi  æivœne  dejavnike  ter
Dr. Tina Batista Napotnik, univ. dipl. biol., Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Aøkerœeva 7, 1000 Ljubljana Doc. dr. Irena Mlinariœ-Raøœan, mag. farm., Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Aøkerœeva 7, 1000 Ljubljana
farm vestn 2005; 56 103
Pregledni œlanki - Review Articles
dejavnike krvnega obtoka. Tako dobimo øtevilne koristne informacije o delovanju, biotransformaciji, farmakokinetiki in toksiœnosti preiskovanih snovi. Zmanjøamo tudi øtevilo ærtvovanih æivali in prostovoljcev v kliniœnih testiranjih ter laæje doloœimo primerno æivalsko vrsto za in vivo testiranja. Vse to pa omogoœi racionaliziracijo in pospeøitev selekcije testiranih potencialnih farmakoloøkih molekul (1, 3, 4).
2 Primarni hepatociti
2.1 Izolirani hepatociti
V 50. in 60. letih prejønjega stoletja, v œasu bliskovitega razvoja celiœnih kultur, so poskuøali izolirati tudi glodalske jetrne celice in sicer z mehanskim delovanjem na jetrno tkivo. Metode so bile neuspeøne, ker so hepatociti v tkivu trdno speti s stiœnimi kompleksi (5). Øele encimatske tehnike so dale vzpodbudne rezultate: z in situ perfuzijo jeter z raztopino kolagenaze so uœinkovito izolirali tudi do 50 % celic podganjih jeter (6). Metodo so kasneje izpopolnjevali in danes izoliramo hepatocite z dvostopenjsko in situ perfuzijo jeter: jetra najprej perfundiramo s pufrom, ki vsebuje kelator EGTA, ki odstrani kalcijeve ione in tako razbije od kalcija odvisne medceliœne povezave in sicer poruøi strukturo kadherinov. Sledi perfuzija z raztopino kolagenaze, ki razgradi zunajceliœni matriks v nekaj minutah (7). Metoda je bila prirejena tudi za druge æivali pa tudi za œloveka (8, 9, 10).
Izolirani hepatociti v suspenziji obdræijo veœino metabolnih funkcij, sistem je tehniœno nezahteven in omogoœa dostop preiskovanih molekul do vseh celic. Slabost modela je kratkotrajna uporaba, saj celice lahko uporabljamo za preiskave le 2-4 ure, nato priœne aktivnost jetrnih encimov in viabilnost celic moœno upadati (3, 4).
2.2 Primarna kultura jetrnih celic
Za daljøe raziskave moramo hepatocite gojiti v celiœni kulturi. S cen-trifugiranjem pri nizkem øtevilu obratov (50 g) odstranimo neparen-himatske celice (endotelne, Kupfferjeve, stelatne celice in celice NK), v suspenziji ostanejo le hepatociti, ki vrøijo veliko veœino jetrnih funkcij (11). Hepatociti rastejo pritrjeni na podlago v posodicah, pre-vleœenih s kolagenom, v gojiøœu William’s z 10 % teleœjega seruma pri 37 °C in 5 % CO2/95 % zraka (6). Celice po nasaditvi v posodice potrebujejo nekaj œasa, da si opomorejo od øoka zaradi izolacije, zato priœnemo s poskusi najmanj 24 ur po nasaditvi (12). Celice se v kulturi ne delijo, zato jih nasadimo v visoki koncentraciji, da doseæejo konfluentnost – se staknejo med seboj (3) (slika 1).
Celice v kulturi zadræijo veliko veœino jetrnih funkcij, kot jih vrøijo in vivo: presnavljajo ogljikove hidrate, seœnino, lipide, æolœne kisline, sintetizirajo plazemske proteine, se odzivajo na hormone in vrøijo biotransformacijo oziroma razstrupljanje snovi z encimi I. in II. stopnje in so zato primeren model za raziskave øtevilnih bioloøkih uœinkovin (2). Tako lahko ugotavljamo mehanizme delovanja preiskovanih snovi v razliœnih koncentracijah (3). Ker so kulture enostavnejøi sistem od organizmov, laæje preuœujemo interakcije med zdravili (13, 14).
Encimi biotransformacije v kultiviranih jetrnih celicah so aktivni, zato lahko z njimi ugotavljamo presnovo potencialnih zdravil (3, 15). To je za razvoj uœinkovine zelo pomembna stopnja, saj presnova uœinkovine vpliva na oœistek in odstranjevanje zdravila iz telesa, klin-iœno uœinkovitost, individualne farmakokinetiœne razlike, razliœno koncentracijo na tarœnem mestu in toksiœnost zdravila (2). Ugotovili so, da se veœina snovi v kulturi podobno presnavlja kot in vivo – glavne presnovke najdemo v obeh sistemih, pogoste pa so razlike v
Slika 1: Fazno-kontrastna mikrografija primarnih hepatocitov v kulturi. Levo: podganji hepatociti, desno: œloveøki hepatociti. 200-kratna poveœava, merilo: 25 µm (35). Figure 1: Phase-contrast micrograph of primary cultured hepatocytes. Left: rat hepatocytes, right: human hepatocytes. 200x magnification, bar: 25 µm (35).
104 farm vestn 2005; 56
Uporaba celiœnih kultur parenhimskih jetrnih celic (hepatocitov) pri razvoju novih zdravil
Preglednica 1: In vitro modeli jeter, njihove prednosti in slabosti. Povzeto po: 1, 3, 4. Table 1: In vitro liver models, their advantages and disadvantages. Summarized from: 1, 3, 4.		
Model	Prednosti	Slabosti
Celiœne frakcije (mikrosomi, mitohondriji) in enoencimski sistemi	Molekularni mehanizmi, izolirani encimski sistemi	Odsotnost citosolnih encimov, kratkotrajnost
Izolirane jetrne celice v suspenziji	Funkcije podobne in vivo celicam, tehniœno nezahteven, lahka dostopnost preiskovanih molekul do vseh celic, moænost krioprezerviranja, medvrstne raziskave	Kratkotrajnost (2-4 ure), ni æolœnih kanalœkov
Primarne kulture hepatocitov	Funkcije ohranjene veœ dni, raziskava procesov biotransformacije, medvrstne raziskave	Pod standardnimi pogoji omejeno trajanje (nekaj dni), fenotipiœne spremembe, ni celiœnih delitev
Hepatiœne celiœne linije	Neomejeno øtevilo (nesmrtne - se delijo), øtevilne jetrne funkcije ohranjene	Jetrne funkcije manj izraæene kot v normalnih hepatocitih, nekatere celo odsotne
Jetrne rezine	Ohranjena lobularna struktura, dostopni humani vzorci	Kratkotrajnost (do 10 ur), celice niso enakomerno funkcionalne, zbiranje æolœa ni mogoœe
Pretoœni sistemi celotnih izoliranih jeter	Podobno in vivo stanju, 3D struktura, funkcionalni æolœni kanalœki, mogoœe zbiranje æolœa, kinetiœne øtudije	Tehniœno zahteven model, kratkotrajnost (nekaj ur), preiskovanje veœ snovi ni moæno, œloveøki organi niso dostopni
Raœunalniøki modeli	zmanjøamo øtevilo prostovoljcev in poskusnih æivali	Ne moremo predvideti vseh okoliøœin poskusa
koliœini posameznih produktov (13, 14, 17). Podobno kot in vivo lahko tudi v kulturi z induktorji in inhibitorji spreminjamo aktivnost citokromov P450. Tako ugotavljamo, kako preiskovane snovi vplivajo na presnovo drugih ksenobiotikov (15, 16). V kultiviranih hepatoc-itih se ohranijo tudi encimi II. stopnje biotransformacije, ki vrøijo kon-jugacijo razliœnih skupin na izhodne produkte redoks reakcij I. stopnje biotransformacije (2).
Problem potencialnih zdravil so obiœajno nepredvideni stranski uœinki, ki so toksiœni za razliœna tkiva in organe. Najpogostejøa tarœa so obiœajno jetra, saj hepatotoksiœnost velikokrat povzroœijo produkti biotransformacije (1, 3). Biotransformacija je obiœajno detoksifikacijski proces, vœasih pa presnovki zdravil postanejo bolj toksiœni kot osnovna uœinkovina, npr. øtevilni intermediati so elek-trofilni in nepovratno alkilirajo celiœne makromolekule, kar vodi v poøkodbe tkiva (1, 2). S pomoœjo razliœnih kvalitativnih in kvantitativnih metod lahko s hepatocitnimi kulturami ugotavljamo toksiœne vplive preiskovanih snovi na delovanje jetrnih celic (sintezo DNA in proteinov, na homeostazo kalcija, znotrajceliœni K+, vsebnost ATP in AMP, nivo glutationa, glukoneogenezo, ureagenezo, sintezo holesterola in lipoproteinov, sintezo in sekrecijo albumina, serumske encime, transport konjugiranih æolœnih kislin in bilirubina, membranski transport, iztekanje citosolnih encimov ob poøkodbi membrane), spremembe morfologije celic (na citoskelet, celiœni volumen, celiœno membrano), genotoksiœnost (poøkodbe DNA, formacija adduktov z DNA, spremembe popravljalnih mehanizmov), celiœno smrt (nekrozo, apoptozo) (1, 3). Kulture so tudi zelo uporabne za doloœanje kemoprotektivnih sredstev, ki jetra oziroma organizem zaøœitijo pred økodljivimi vplivi uœinkovin (16).
Kot vse metode imajo tudi primarne kulture jetrnih celic svoje slabosti Najveœja je ta, da izraæanje specifiœnih jetrnih funkcij s œasom upada, kar vodi v fenotipske spremembe hepatocitov in v dediferenciacijo (3). Tudi aktivnosti encimov druæine citokromov P450 (CYP450) v primarnih hepatocitih s œasom upadajo. Vzrok je v zmanjøanem prepisu CYP mRNA, zato je v celicah vse manj encimov in celotna CYP450 aktivnost v celici upade (2, 15)
Na ohranjanje specifiœnih jetrnih funkcij vplivajo øtiri skupine dejavnikov: topni dejavniki gojiøœa, zunajceliœni matriks, interakcije med celicami in dejavniki replikacije (2). S spreminjanjem teh dejavnikov so razvili tehnike gojenja hepatocitov, ki vzdræujejo funkcionalnost dlje œasa. Zelo uspeøno je gojenje hepatocitov v ko-kulturi, torej skupaj z drugo vrsto celic, npr. linijskimi epitelnimi, ste-latnimi in drugimi neparenhimskimi jetrnimi ter celo nehepatiœnimi celicami (18). Te celice sproøœajo v kulturo snovi, ki omogoœijo okolje, ki bolje posnema pogoje in vivo, zato hepatociti aktivneje vrøijo specifiœne funkcije. Drugi naœin je tridimenzionalna kultura v obliki kola-genskega sendviœa ali sferoidov, ki lahko vsebujejo tudi druge celice. V teh kulturah hepatociti zadræijo tridimenzionalno kuboidalno obliko, kar vpliva tudi na izraæanje jetrnih funkcij (19). Med celicami nastanejo celo æolœni kanalœki (12)
2.3 Primarna kultura œloveøkih jetrnih celic
Najpogosteje uporabljamo podganje hepatocite, saj je njihova izolacija in kultivacija najlaæje izvedljiva in podganja jetra so relativno lahko dostopna. Napovedovanje uœinkov bioloøko aktivnih snovi na œloveka na osnovi raziskav na poskusnih æivali pa je zaradi medvrstnih razlik vedno pod-
farm vestn 2005; 56 105
Pregledni œlanki - Review Articles
vræeno doloœenemu tveganju. Zato so za preuœevanje potencialnih zdravilnih uœinkovin primernejøi hepatociti humanega izvora. Pridobimo jih lahko s perfuzijo celih ali dela jeter darovalcev organov, iz ostankov terapevtskih hepatektomij ali manjøih kirurøkih biopsij (2). Perfuzija je prav tako dvostopenjska, uporabljamo kolagenazo, lahko pa tudi druge encime (npr. dispazo, liberazo), metode pa so precej uspeøne, saj je via-bilnost celic nad 85 % (2) (slika 1).
Tudi œloveøki hepatociti v kulturi zadræijo veœino jetrnih funkcij. So celo bolj stabilni kot glodalski, saj svojo diferenciranost ohranjajo dlje œasa (nekaj tednov) (17). Za daljøo funkcionalnost pa jih moramo tako kot æivalske gojiti v ko-kulturah ali tridimenzionalnih kulturah (19).
Primarni œloveøki hepatociti veljajo danes za zlati standard preuœevanja metabolizma œloveøkih jeter. Primerni so za raziskave biotransformacije zdravil (prek CYP450 in encimov II. stopnje), saj obstaja dobra povezava metabolizma in vitro/ in vivo (13, 17). Ksenobiotiki se v œloveøkih jetrih v I. stopnji biotransformacije pretvarjajo predvsem s citokromom P450 3A4, pa tudi z 1A2, 2A6, 2B6, 2C, 2D6 in 2E1, ti pa so v kultiviranih celicah dobro izraæeni (2). Njihova aktivnost tudi v œloveøkih hepatocitih upada s œasom. Nekateri CYP450 encimi (CYP3A4, CYP2C9 in CYP 2D6) po 72-96 urah kulture aktivnost obnovijo, drugi (CYP1A2, CYP2E1) pa ne (2). To je tudi razlog, da imajo transformirane spojine podobne metabolne profile kot in vivo, razlikujejo pa se kvantitativno (13, 14, 17). Drugi razlog za kvantitativne razlike je sistemski: in vivo se uœinkovina lahko slabo absorbira ali pa se veæe na molekule v drugih tkivih, torej ne doseæe jeter v tolikøni koncentraciji kot jetrne celice v kulturi (20).
Primarne œloveøke hepatocite v kulturi uporabljamo tudi za øtudije molekularnih mehanizmov, toksiœnosti, biokinetike in interakcije med zdravili. Ugotavljamo lahko dejavnike starosti, spola in okolja (13, 14). Pomembni so pri ugotavljanju individualnih razlik v odzivanju na uœinkovine, saj obstaja veliko genetskih polimorfizmov genov, ki se izraæajo v jetrih (21, 22). Najveœje razlike so opazne v druæini citokromov P450, kar lahko precej vpliva na presnovo snovi in tako na potek zdravljenja (13, 22). Preuœujemo lahko tudi idiosinkratiœno (nenaœrtovano) hepatotoksiœnost, pri kateri so prizadeti le redki posamezniki, verjetno pa je povezana z neo-biœajno presnovo ali imunoalergijskim fenomenom (3, 23).
V metabolizmu vsake snovi lahko obstajajo kvalitativne ali kvantitativne razlike med æivalskimi vrstami in œlovekom. S primerjavo uœinkov na celice razliœnega izvora lahko doloœimo æivalski model, ki bo deloval podobno kot œloveøke celice, torej je najprimernejøi za nadaljnje raziskave (13).
2.4 Zamrzovanje hepatocitov
Najveœji problem pri vzpostavitvi primarne kulture œloveøkih hepatoci-tov je legalna in etiœna omejenost dostopa do œloveøkih celic. Potrebna je tudi vsakokratna izolacija sveæih celic, ker je kultura kratkotrajna in se celice v njej ne delijo. Pri vsaki izolaciji dobimo veliko øtevilo celic, ki jih obiœajno sproti ne moremo porabiti, zato je priporoœljivo celice shraniti. Z metodo zamrzovanja je to moæno. Kritiœni elementi za uspeøno zamrzovanje hepatocitov so protokol zamrzovanja, izbira kri-opotektivnega sredstva in odstranitev mrtvih celic po odmrzovanju. Izolirane hepatocite v suspenziji moramo zamrzniti v krioprotektivnem sredstvu, obiœajno je to 10 % DMSO, z nadzorovano hitrostjo zamrzo-vanja (-1,9 °C/min od +4 do -30 °C ter -30 °C/min od -30 °C do -150 °C) (8, 9). Celice nato prenesemo v tekoœi duøik, kjer jih lahko obdræimo tudi veœ let. Odmrzovanje pa mora potekati œim hitreje, v vodni kopeli na 37 °C, hitro tudi odstranimo DMSO (8, 9).
Proces zamrzovanja in odtajanja celic sicer zmanjøa njihovo viabil-nost, predvsem zaradi poøkodb celiœne membrane, vpliva na membranski transport in sintezo proteinov (24). Vendar pa so z izboljøe-vanjem metode dosegli, da po odmrzovanju celice vrøijo svoje funkcije skoraj v enaki meri kot sveæe izolirane (25). Torej je zamrzovanje pri-poroœljivo za vzpostavljanje banke hepatocitov, izoliranih iz razliœnih pacientov ali æivalskih vrst, ki so primerni za raziskave. To nam omogoœa ugotavljati individualne razlike v enem samem poskusu.
3 Celiœne linije
Alternativa teæko dostopnim primarnim hepatocitom so jetrne celiœne linije. Njihova prednost je v tem, da se delijo in so zato na voljo v neomejenem øtevilu. Hepatocitne linije so pridobili na veœ naœinov: 1.) iz primarnih tumorjev jeter [humani liniji Hep G2 (26) in Mz-Hep-1 (27), podganja H4IIE (28)], 2.) SV40-transformirani normalni primarni hepa-tociti [humani liniji THLE-2 in THLE-3 (29)], 3.) iz embrionalnih jetrnih celic [miøja linija BNL CL.2 (30)], 4.) iz TGF-a transgenih miøi [linija AML12 (31)] in 5.) s fuzijo dveh razliœnih tipov celic [hibrid fibroblas-tov in hepatomskih celic WIF12-1 (32)].
Slabost hepatocitnih linij je v tem, da so fenotipske lastnosti jetrnih celic slabøe izraæene, zato se lahko na ksenobiotike odzivajo drugaœe kot primarni hepatociti. V raziskavah najveœkrat uporabljamo linijo Hep G2, ki izvira iz hepatocelularnega karcinoma (26). To je precej
Slika 2: Laserska konfokalna fluorescenœna mikrografija primarnega œloveøkega hepatocita, 3 ure po dodatku 50 nM mikrocistina-LR. Aktinski filamenti (rdeœe) zaœenjajo potovati proti srediøœu celice, jedro se krœi. Aktinski filamenti so oznaœeni z rodamin faloidinom (rdeœe), jedro pa s Sytox Green (zeleno). Merilo: 5 µm (34, 35).
Figure 2: Laser-scanning confocal fluorescent micrograph of primary human hepatocyte, the cells were treated with 50 nM microcystin-LR for 3 hours. Actin filaments (shown in red) start to move towards the center of the cell, the nucleus condense. Actin filaments are stained with rhodamin-phalloidin (red) and nuclei with Sytox Green (green). Bar: 5 µm (34, 35).
farm vestn 2005; 56
Uporaba celiœnih kultur parenhimskih jetrnih celic (hepatocitov) pri razvoju novih zdravil
stabilna celiœna linija, ki izraæa 96 % genov primarnih hepatocitov in vrøi øtevilne jetrne funkcije (23, 26).
Vrøi tudi øtevilne procese biotransformacije I in II stopnje, vendar v manjøi meri kot primarni hepatociti (23). Aktivnost citokromov P450 v celicah je precej niæja kot v primarnih, CYP 2E1 je celo nezaznaven. Vzrok je manjøe prepisovanje mRNA, kar je posledica niæjega nivoja transkripcijskih faktorjev v hepatiœnih linijah (15). Zaradi odsotnosti CYP 2E1 in alkoholdehidrogenaze je linija Hep G2 odporna proti cito-toksiœnim in lipogenim uœinkom etanola (23). Celice Hep G2 so idealen model za øtudije mitohondrijske toksiœnosti zaradi velikega øtevila mitohondrijev in mitohondrijske DNA (33).
Hepatiœne linije uporabljajo v øtevilnih øtudijah, vendar se moramo ves œas zavedati, da drugaœne aktivnosti encimov v linijah lahko privedejo do razlik v odgovoru na preiskovano uœinkovino, zato je potrebna pazljivost pri interpretaciji rezultatov (23).
4  Primer uporabe hepatocitov v toksikologiji
Primarni hepatociti v kulturi so zelo primerni za øtudij toksiœnih vplivov na celiœnem in biokemiœnem nivoju. Primer uporabe je ugotavljanje uœinkov mikrocistinov (cianobakterijskih hepatotoksinov) na obliko celic, citoskelet in jedra, sproæanje apoptoze in aktivnost citokroma P450 1A. Ugotovili smo, da mikrocistini v primarnih podganjih in œloveøkih hepatocitih povzroœajo skrœenje in brstenje celic, prerazporeditev aktinskih filamentov v srediøœe celice, kar je posledica sproæitve apoptoze. Uporabljali smo laserski konfokalni mikroskop, kjer smo opazovali fluorescenœno oznaœene hepatocite (slika 2). Pri tem se aktivirajo kaspaze, vendar je vzorec aktivacije kaspaz pri podganjih in œloveøkih hepatocitih drugaœen. Œloveøki hepatociti so tudi bolj obœutljivi na delovanje mikrocistinov, kar moramo upoøtevati pri napovedovanju rezultatov z æivalskih modelov na œloveka. Uporaba hepatocitov veœ pacientov pa nam je omogoœila ugotavljanje razlik med posamezniki (34, 35).
5  Zakljuœek
Celiœne kulture ne morejo nadomestiti raziskav na æivalih in prostovoljcih, dajo pa nam veliko koristnih informacij o presnovi zdravil na celiœnem in molekularnem nivoju. Z uporabo kultur v predkliniœnih øtudijah delujemo etiœno, saj zmanjøamo øtevilo poskusnih æivali in prostovoljcev v kliniœnih poskusih, in gospodarno, ker zmanjøamo øtevilo napaœnih odloœitev v razvoju zdravil. Za doseganje œim boljøih rezultatov pa bo øe naprej potrebno izboljøevati hepatocitne kulture, predvsem v smeri œim boljøega posnemanja in vivo celice, ter razviti hepatiœno celiœno linijo z visoko izraæenimi jetrnimi funkcijami.
6  Zahvala
Delo s primarnimi podganjimi in œloveøkimi hepatociti je bilo opravljeno na Inøtitutu za patoloøko fiziologijo Medicinske fakultete v Ljubljani pod mentorstvom prof. dr. Duøana Øuputa, ter v laboratoriju INSERM v Antibesu v Franciji pod mentorstvom prof. dr. Rogerja Rahmanija. Obema se iskreno zahvaljujem.
7 Literatura
1.      Davila JC, Rodriguez RJ, Melchert RB et al. Predictive value of in vitro model systems in toxicology. Annu Rev Pharmacol Toxicol 1998; 38: 63-96.
2.      Gómez-Lechón MJ, Donato MT, Castell JV et al. Human hepatocytes as a tool for studying toxicity and drug metabolism. Curr Drug Metab 2003; 4: 292-312.
3.      Guillouzo A, Morel F, Langouët S et al. Use of hepatocyte cultures for the study of hepatotox-ic compounds. J Hepatol 1997; 26: 73-80.
4.      Cross DM, Bayliss MK. A commentary on the use of hepatocytes in drug metabolism studies during drug discovery and development. Drug Metab Rev 2000; 32: 219-240.
5.      Berry MN, Simpson FO. Fine structure of cells isolated from adult mouse liver. J Biol Chem 1962; 15: 9.
6.      Berry MN, Friend DS. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells. J Cell Biol 1969; 43: 506-520.
7.      Williams GM, Bermudez E, Scaramuzzino D. Rat hepatocyte primary cell cultures III: Improved disociation and attachment techniques and the enhancement of survival by culture medium. In Vitro 1977; 13: 809-817.
8.      de Sousa G, Dou M, Barbe D et al. Freshly isolated or cryopreserved human hepatocytes in primary culture: Influence of drug metabolism on hepatoxicity. Toxic in Vitro 1991; 5: 483-486.
9.      Dou M, de Sousa G, Lacarelle B et al. Thawed human hepatocytes in primary culture. Cryobiology 1992; 29: 454-469.
10.    Freshney RI. Liver. In: Culture of animal cells. A manual of basic technique, 4th ed. New York-Chichester-Weinheim-Brisbane-Singapore-Toronto: Wiley-Liss, 2000: 357-358.
11.    Quistorff B, Dich J, Grunnet N. Preparation of isolated rat liver hepatocytes. In: Pollard JW, Walker JM. Animal cell culture. Clifton, New Jersey: Humana press, 1990; 151-160.
12.    Puviani AC, Ottolenghi C, Tassinari B et al. An update on high-yield hepatocyte isolation methods and on the potential use of isolated liver cells. Comp Biochem Physiol, Part A 1998; 121: 99-109.
13.    Rahmani R, de Sousa G, Marre F et al. Potential of freshly isolated and cryopreserved human hepatocytes in drug research and development. In: Rogiers V, Sonck W, Shephard E et al. Human cells in in vitro pharmaco-toxicology. Present status within Europe. Brussel: Vub press, 1993: 117-138.
14.    de Sousa G, Florence N, Valles B et al. Relationships between in vitro and in vivo biotransfor-mation of drugs in humans and animals: pharmaco-toxicological consequences. Cell Biol Toxicol 1995; 11: 147-153.
15.    Rodriguez-Antona C, Donato MT, Boobis A et al. Cytochrome P450 expression in human hepatocytes and hepatoma cell lines: molecular mechanisms that determine lower expression in cultured cells. Xenobiotica 2002; 32: 505-520.
16.    Guillouzo A. Liver cell models in in vitro toxicology. Environ Health Perspect 1998; 106: 511-532.
17.    Guillouzo A, Morel F, Fardel O et al. Use of human hepatocyte cultures for drug metabolism studies. Toxicology 1993; 82: 209-219.
18.    Bhatia SN, Balis UJ, Yarmush ML et al. Effect of cell-cell interactions in preservation of cellular phenotype: cocultivation of hepatocytes and nonparenchymal cells. FASEB J 1999; 13: 1883-1900.
19.    Chen HL, Wu HL, Fon CC et al. Long-term culture of hepatocytes from human adults. J Biomed Sci 1998; 5:435-440
20.    Fautrel A, Chesné C, Guillouzo A et al. A multicentre study of acute in vitro cytotoxicity in rat hepa-tocytes: tentative correlation between in vitro toxicities and in vivo data. ATLA 1993; 21: 281-284.
21.    Miller III, MC, Mohrenweiser, Bell DA. Genetic variability in susceptibility and response to toxicants. Tox Lett 2001; 120: 269-280
22.    Ingelman-Sundberg M. Genetic variability and susceptibility and response to toxicants. Tox Lett 2001, 120: 259-268.
23.    Harris AJ, Dial SL, Casciano DA. Comparison of basal gene expression profiles and effects of hepatocyrcinogens on gene expression in cultured primary human hepatocytes and HepG2 cells. Mutat Res 2004; 549: 79-99.
24.    De Loecker P, Fuller BJ, Gruwez et al. The effects of cryopreservation on membrane integrity, membrane transport, and protein synthesis in rat hepatocytes. Cryobioloy 1990; 27: 143-152.
25.    Son JH, Kim KH, Nam YK et al. Optimization of cryoprotectants for cryopreservation of rat hepatocyte. Biotechnol Lett 2004; 26:829-833.
26.    Knowles BB, Howe CC, Aden DP. Human hepatocellular carcinoma cell lines secrete major plasma proteins and hepatitis B surface antigen. Science 1980; 209: 497-499.
27.    Dippold WG, Dienes HP, Knuth A et al. Hepatocellular carcinoma after thorotrast exposure: establishment of a new cell line (Mz-Hep-1). Hepatology 1985; 5: 1112-1119.
28.    Rau MA, Whitaker J, Freedman JH et al. Differential susceptibility of fish and rat liver cells to oxidative stress and cytotoxicity upon exposure to prooxidants. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol 2004; 137: 335-42.
29.    Pfeifer AM, Cole KE, Smoot DT et al. Simian virus 40 large tumor antigen-immortalized normal human liver epithelial cells express hepatocyte characteristics and metabolize chemical carcinogens. Proc Natl Acad Sci U S A. 1993; 90: 5123-7.
30.    Patek PQ, Collins JL, Cohn M. Transformed cell lines susceptible or resistant to in vivo surveillance against tumorigenesis. Nature 1978; 276: 510-511.
31.    Wu JC, Merlino G, Fausto N. Establishment and characterization of differentiated, nontrans-formed hepatocyte cell lines derived from mice transgenic for transforming growth factor alpha. Proc Natl Acad Sci U S A 1994; 91: 674-8.
32.    Cassio D, Hamon-Benais C, Guerin M et al. Hybrid cell lines constitute a potential reservoir of polarized cells: isolation and study of highly differentiated hepatoma-derived hybrid cells able to form functional bile canaliculi in vitro. J Cell Biol 1991; 115: 1397-408.
33.    Pinti M, Troiano L, Nasi M et al. Hepatoma HepG2 cells as a model for in vitro studies on mito-chondrial toxicity of antiviral drugs: which correlation with the patient? J Biol Regul Homeost Agents. 2003; 17: 166-171.
34.    Batista T, de Sousa G, Øuput JS, Rahmani R, Øuput D. Microcystin-LR causes the collapse of actin filaments in primary human hepatocytes. Aquat Toxicol 2003; 65: 85-91.
35.    Batista Napotnik T. Vpliv mikrocistina-LR na primarne œloveøke hepatocite in keratinocite. Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljani, Medicinska fakulteta, 2004.
farm vestn 2005; 56