Originalni znanstveni œlanki – Scientific articles
Sprememba specifiœnosti imunoglobulinov razreda G pod vplivom elektro-oksidacije
Changes in specificity of class G immunoglobulins after electro-oxidation
Jasna Omersel, Borut Boæiœ
Povzetek Oksidacija protiteles povzroœi spremembe tudi v hipervariabilni regiji, kar lahko vodi do spremenjenih vezalnih sposobnosti protiteles - njihove afinitete in specifiœnosti. V naøi raziskavi elektro-oksidacije IgG frakcije serumov 21 krvodajalcev in 9 bolnikov z anti-fosfolipidnim sindromom smo ugotovili, da 1./ se specifiœnost protiteles spremeni iz naravnih v patogena proti b2-glikoproteinu I, 2./ povzroœi elektro-oksidacija protiteles proti b2-glikoproteinu I zmanjøanje imunoreaktivnosti, in 3./ podaljøana oksidacija povzroœi izgubo imunoreaktivnosti zaradi denatu-racije. Naøi rezultati odpirajo moæno razlago, da do avtoimunskih odzivov ne pride samo zaradi sprememb v antigenih ampak tudi zaradi oksi-dacijskih sprememb v protitelesih.
Kljuœne besede: protitelesa, elektro-oksidacija, specifiœnost, imunoreaktivnost
Abstract Oxidation of antibodies causes changes in the hypervariable region also leading to altered binding properstis of antibodies – their affinity and specificity. In our research of electro-oxidation of IgG fraction from sera of 21 blood donors and 9 patients with antiphospholipid syndrome we found out that 1./ specificity of IgG has been changed from normal to pathogenic anti-b2-glycoprotein I antibodies, 2./electro-oxi-dation has caused decrease in immunoreactivity of anti-b2-glycoprotein I antibodies, and 3./ prolonged oxidation has lead to loss of immunore-activity due to denaturation. Our results have opened the possibility that autoimmune reactions could also appear in consequence of oxidative changes in antibodies.
Key words: antibodies, electro-oxidation, specificity, avidity, immunoreactivity
1.Uvod
1.1. Oksidacija proteinov
Oksidacija proteinov je dobro poznan proces kemiœne nestabilnosti peptidov in tekoœih ter trdnih proteinskih farmacevtskih pripravkov. Spremembe v kovalentnih vezeh lahko povzroœijo spremembo terciarne in kvartane strukture proteina, kar najpogosteje vodi do izgube njegove bioloøke aktivnosti (1). Oksidacija lahko poteœe pod vplivom neradikalskih ali radikalskih oksidantov. Posledica je nastanek in sproøœanje novih reaktivnih snovi, spremenjena regulacija in ekspresija genov, modulacija celiœnega signaliziranja, indukcija nekroze ali apoptoze (2). Dvig znotrajceliœne koncentracije teh oksidirajoœih spojin in kopiœenje pod njihovim vplivom spremenjenih bioloøkih molekul vodi v organizmu do stanja oksidativnega stresa (3).
Veœina radikalov ima elektrofilni znaœaj, zato reagirajo z aminokislinami, ki imajo v stranski verigi veliko elektronsko gostoto (2). Med najlaæje oksidirajoœe aminokisline tako spadajo aromatske
(tirozin, triptofan, fenilalanin) in æveplo vsebujoœi aminokislini metionin in cistein (4).
1.2 Oksidacija protiteles
Enostavno protitelo sestavljata po dve identiœni lahki in dve teæki verigi, med seboj povezane z nekovalentnimi hidrofobnimi in kovalentnimi disulfidnimi vezmi. Na N-terminalnem koncu molekule se nahaja variabilni predel. Z rentgensko difrakcijsko spektroskopijo je bilo ugotovljeno, da so aminokisline v tem predelu organizirane v tri hipervariabilne zanke, v katerih je le 5-10 aminokislin odgovornih za vezavo z imunogenom, t.j. molekulo, ki sproæi imunski odziv (5, 6).
Hipervariabilne regije so hkrati tudi najbolj izpostavljen in zato najobœutljivejøi del molekule protitelesa, saj aminokisline tam niso dodatno stabilizirane s hidrofobnimi interakcijami (5, 6). Oksidacija aminokislin v hipervariabilnih regijah protiteles tako lahko vodi do spremembe v zgradbi same regije in s tem poslediœno do spremembe imunoreaktivnosti, afinitete ali celo specifiœnosti molekule
Jasna Omersel, mag.farm., Kliniœni center, Kliniœni oddelek za revmatologijo, Vodnikova 62, Ljubljana
prof.dr. Borut Boæiœ, mag.farm., Kliniœni center, Kliniœni oddelek za revmatologijo, Vodnikova 62, Ljubljana; Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo,
Aøkerœeva 7, Ljubljana
farm vestn 2006; 57 311
Originalni znanstveni œlanki – Scientific articles
protitelesa. Ker je specifiœno razlikovanje med lastnim in tujim osnova imunskega sistema, vpliva sprememba v specifiœnosti protiteles tudi na (ne)zmoænost tolerance do posameznikovih lastnih antigenov. Slednje pa predstavlja zaœetek procesa, ki lahko vodi v razliœne sistemske ali organsko specifiœne avtoimunske bolezni (5, 6).
2.Namen raziskave
Z raziskavo smo nameravali ugotoviti, ali lahko z elektro-oksidacijo povzroœimo spremembo v specifiœnosti naravnih ali protimikrobnih protiteles, ki so prisotna v serumu kliniœno zdravih ljudi in protiteles proti b2-glikoproteinu I iz seruma bolnikov z antifosfolipidnim sindromom. Preverjali smo vpliv napetosti in œasa izpostavitve protiteles elektro-oksidaciji na imunoreaktivnost vzorcev in specifiœnost protiteles razreda G.
3.Materiali in metode
3.1 Imunoglobulinske frakcije
Protitelesa razreda G smo izolirali iz 21 serumov zdravih krvodajalcev in 9 serumov bolnikov z dokazanim antifosfolipidnim sindromom (7). Predhodna analiza je potrdila, da so bili vsi serumi krvodajalcev negativni na prisotnost protiteles proti b2-glikoproteinu I, serumi bolnikov pa pozitivni primerjano s koncentracijo monoklonskih protiteles HCAL (8).
Slika 1.    Shema aparature za elektro-oksidacijo Figure 1.   Scheme of electro-oxidation instrument
3.2   Afinitetna kolonska kromatografija
Izolacijo protiteles razreda G iz seruma smo izvedli z uporabo analiznega kompleta ImmunoPure (G) IgG Purification Kit, po predpisanem postopku proizvajalca (9). Sama izolacija temelji na afinitetni kromatografiji, pri kateri je na matriks (premreæena agaroza) kot ligand kovalentno vezan protein G. To je protein, izoliran iz celiœne stene bakterij Streptococcus, ki se veæe preteæno na konstantne predele teæke verige (Fc predel) protiteles in omogoœa uœinkovito izolacijo protiteles razreda G, vkljuœno z vsemi podrazredi. Eluirane frakcije IgG smo nanesli øe na razsoljevalno kolono, kjer je po principu izkljuœitvene kromatografije potekla zamenjava acetatnega pufra s fosfatnim (pH= 7,4).
3.3   Elektro-oksidacija
Izolirane frakcije IgG smo izpostavili elektriœnemu toku pri napetosti 4,5 V in 1,5 V (vzorci krvodajalcev) ali 1,5 V (vzorci bolnikov) (Preglednica I). Primerljive pogoje smo dosegli z uporabo enakega volumna, enake razdalje med elektrodama, enake dolæine potopljenega dela elektrode in hlajenjem. Z ampermetrom smo merili œasovno odvisnost toka (Slika 1).
3.4   Indirektna encimsko imunska metoda
Spremembo v imunoreaktivnosti in specifiœnosti protiteles smo doloœali z encimsko imunsko metodo (ELISA), ki se rutinsko uporablja v laboratorijski diagnostiki antifosfolipidnega sindroma. Antigen je predstavljal b2-glikoprotein I, kot kontrolni material pa smo uporabili himerna monoklonska protitelesa razreda IgG (HCAL) (8).
Na visokovezavne mikrotitrske ploøœe smo kot antigen nanesli po 50 mL b2-glikoproteina I v koncentraciji 1mg/mL. Po inkubaciji in spiranju s PBS-0,05% Tween 20 smo na ploøœe nanesli a/ vzorce (serume), b/ izolirane neoksidirane in c/ pripadajoœe oksidirane IgG frakcije. Zaradi redœenja vzorcev kot posledice izolacije IgG in razsoljevanja je bilo potrebno uvesti korekcijska faktorja, ki sta omogoœila izraœun volumna IgG frakcije s primerljivo koncentracijo protiteles, kot bi jih sicer vseboval predpisani volumen seruma (4 mL).
3.5   Protitoœna imunoelekroforeza
Moæno spremembo imunoreaktivnosti protiteles proti b2-glikoproteinu I smo preverjali z uporabo protitoœne imunoelektroforeze (8). S slednjo odkrivamo prisotnost predvsem protiteles proti znotrajceliœnim antigenom (Ro, La, Sm, Jo-1, Scl-70…) (10, 11). Na stekleno ploøœo z agaroznim gelom (1%) smo v izrezane luknjice nanesli vzorce, t.j. serume, izolirane neoksidirane in pripadajoœe oksidirane IgG frakcije, izolirane iz seruma zdravih krvodajalcev. Kot antigen smo uporabili kunœji timusni ekstrakt in v laboratoriju pripravljen ekstrakt iz œloveøke vranice (11).
Preglednica I: Œas trajanja elektro-oksidacije pri razliœnih vzorcih in napetostih. Table I: Duration of electro-oxidation in different samples using different potencial.
4,5 V	IgG krvodajalcev	15 s	30 s	1 min	5 min			
1,5 V	IgG krvodajalcev in bolnikov	15 s	30 s	1 min	5 min	10 min	15 min	20 min
312 farm vestn 2006; 57
Sprememba specifiœnosti imunoglobinov razreda G pod vlplivom elektro-oksidacije
4.Rezultati in razprava
Oblikovanje mnoæice razliœnih protitelesnih veziøœ razlagamo na genski ravni s preurejanjem genskih segmentov za variabilni del teæke in lahke verige protiteles, z nenatanœnostjo rekombinacij, dodajanjem nukleotidov, s somatskimi mutacijami, na proteinski ravni pa s konformacijskimi prilagoditvami. Post-translacijske spremembe protiteles so vezane predvsem na glikozilacijo, vendar pa v to skupino sodijo tudi neæelene spremembe proteina zaradi oksidacije. Obseæna oksidacija proteinov praviloma vodi v izgubo njihove bioloøke aktivnosti, omejena oksidacija pa ne. Posebnost je oksidacija aminokislin v veziøœu protiteles, ki lahko teoretiœno vodi v spremenjene vezalne sposobnosti protitelesa do razliœnih antigenov in celo v spremembo specifiœnosti protitelesa. McIntyre je s sodelavci poroœal o spremembah imunoreaktivnosti in specifiœnosti protiteles v pripravku za intravensko aplikacijo po oksidacijsko-redukcijskih procesih (12). Ugotovili so, da je oksidacija potekla pod vplivom ene izmed komponent i.v. pripravka, in sicer hemina (derivat hemoglobina, ki vsebuje Fe3+ ione). Dokazali so, da se pod vplivom nekaterih oksidantov (hemin, KMnO4) kot tudi pri uporabi enosmerne napetosti (4,5 V in 9 V) v i.v. pripravkih lahko pojavijo mnoga avtoprotitelesa, ki jih pred tem z istimi laboratorijskimi metodami niso zaznali (13).
V okviru naøe øtudije smo preverjali, ali je moæno z elektro-oksidacijo pri niæjih napetostih in poslediœno niæjih tokovih spremeniti specifiœnost naravnih protiteles v diagnostiœno pomembna (patogena) in obratno. Osredotoœili smo se izkljuœno na izolirana protitelesa, saj smo æeleli izkljuœiti moæne vplive serumskih sestavin, ki bi lahko spremenile ali prepreœile potek oksidacije protiteles (12). Elektro-oksidacijo smo izbrali zato, ker z njo lahko ponazarjamo oksidacijsko redukcijske reakcije in vivo, ne da bi v sistem uvajali dodatne snovi. Med samim potekom elektro-oksidacije smo merili spremembe toka. Ugotovili smo, da je pri vseh vzorcih, oksidiranih pri napetosti 4,5 V, tok v odvisnosti od œasa naraøœal. Razpon vrednosti izmerjenega toka je bil od 5,93-14,65 mA. Pri vzorcih, oksidiranih pri napetosti 1,5 V, je tok s œasom ostajal konstanten in je, glede na vzorec, zavzemal vrednosti od 0,012-0,025 mA.
Po elektro-oksidaciji smo z ELISA preverjali spremembo specifiœnosti oksidiranih protiteles. V vseh 21 oksidiranih vzorcih krvodajalcev so se protitelesa vezala na b2GPI, œeprav vezave pred elektro-oksidacijo nismo zaznali. Kliniœno pomembno zviøanje imunoreaktivnosti je bilo prisotno kar pri 20/21 vzorcev. Pri IgG frakcijah krvodajalcev, oksidiranih pri napetosti 1,5 V je do nastanka protiteles proti b2GPI v kliniœno pomembnih koncentracijah priølo pri polovici testiranih vzorcev (4/8). Sama sprememba v specifiœnosti protiteles pod vplivom elektro-oksidacije se je izkazala kot dinamiœen in zelo raznolik proces, odvisen od œasa, napetosti in izvora vzorca. Ugotovili smo, da œas izpostavitve vzorca doloœeni napetosti vpliva tudi na spremembo imunoreaktivnost protiteles proti b2GPI. Imunoreaktivnost je izraæena kot koncentracija monoklonskih protiteles, ki so izkazovala øtevilœno enako absorbanco kot doloœani vzorci. Krivulje na sliki 2 ponazarjajo øtiri skupine, v katere smo lahko razdelili oksidirane vzorce krvodajalcev, ki so bili izpostavljeni enaki napetosti in so imeli podoben potek sprememb v imunoreaktivnosti. Vsem 21 vzorcem zdravih krvodajalcev, oksidiranih pri 4,5 V, je skupen izrazit padec imunoreaktivnosti po 5 min v primerjavi z maksimalno vrednostjo,
doseæeno pri enem od merjenih œasov. Devetnajstim vzorcem je imunoreaktivnost po 5 min padla pod kliniœno pomembno vrednost. Do kliniœno pomembnega poviøanja imunoreaktivnosti pa je priølo tudi po oksidaciji vzorcev krvodajalcev z napetostjo 1,5 V, in sicer pri 4-ih od 8-ih vzorcev. Manjøe spremembe, ne pa tudi pomembnega poviøanja imunoreaktivnosti, smo zaznali po oksidaciji (1,5 V) IgG frakcij, izoliranih iz seruma bolnikov z antifosfolipidnim sindromom.
Slika 2: Spremembe imunoreaktivnosti pri razliœnih skupinah vzorcev krvodajalcev, oksidiranih pri 4,5 V
Figure 2: Changes of immunoreactivity in different groups of healthy-donors samples, oxidized with 4,5 V
Spremembe v imunoreaktivnosti po kratki izpostavitvi oksidacije so posledica preoblikovanja v hipervariabilnih regijah, kar utemeljujemo z naslednjimi opaæanji: prviœ, zaœetne spremembe imunoreaktivnosti so bile prisotne v obeh smereh (poveœanje in zmanjøanje), torej ni ølo zgolj za »okvaro« protiteles; drugiœ, v primeru poveœevanja nefunkcionalnosti protiteles zaradi oksidacije, bi priœakovali zmanjøevanje imunoreaktivnosti vzorcev bolnikov s œasom izpostavitve elektriœnemu toku – pa temu ni bilo tako. Celo veœ, v vzorcih zdravih oseb so se pojavila protitelesa proti b2GPI, ki imajo diagnostiœni pomen za avtoimunsko trombozo. Tega pojava ne moremo pripisati zgolj nespecifiœnim vezavam, saj so bila zaznana z metodo, ki se uporablja v rutinski laboratorijski diagnostiki in je redno medlaboratorijsko primerjana (14, 15). Po daljøem œasu, sploh pri viøjih napetostih (4,5 V), pa verjetno pride tudi do prestrukturiranja oz. poruøitve interakcij med aminokislinami øe v drugih delih protitelesa in s tem do znatnega zniæanja imunoreaktivnosti ter konœno do denaturacije.
V sami hipervariabilni regiji so kemiœne in strukturne lastnosti posamezne aminokisline odloœilne pri oblikovanju antigen vezavnega mesta in za interakcije z antigenom. Najbolj zastopana aminokislinska ostanka v samem vezavnem mestu pa sta tirozin (25%) in triptofan (10,2%) (16). Sposobnost tvorbe vodikovih vezi, hidrofobnih interakcij in privlaœnih elektrostatskih sil med pozitivno nabitimi skupinami in samim aromatskim obroœem ter fleksibilnost obroœa, omogoœajo, da tirozin in triptofan tvorita interakcije s strukturno zelo razliœnimi antigeni (16). Prav ti dve aminokislini oz. njuni stranski verigi, sta tudi najbolj dovzetni za oksidacijo.
Naøi rezultati kaæejo tudi na to, da je imunoreaktivnost in z njo sprememba v specifiœnosti pod vplivom elektro-oksidacije odvisna od same strukture vezavnega mesta antigena. Vzorci, ki so pri 4,5 V
farm vestn 2006; 57
Originalni znanstveni œlanki – Scientific articles
izkazovali enako œasovno odvisnost in bili pozitivni, so se pri 1,5 V odzvali popolnoma razliœno (slika 2). V predhodnih raziskavah, ki so nakazovale celo na moænost elektro-oksidacije kot novega sinteznega pristopa, je bilo ugotovljeno, da je oksidacija posameznih aminokislin odvisna od uporabljene napetosti, s œimer je moæno zagotoviti tudi selektivnost oksidacije (17). Oœitno je, da v naøih poskusih tok, povzroœen z napetostjo 4,5 V, ni povzroœil enakih sprememb kot tok pri napetosti 1,5 V in da so se pri posamezni napetosti oksidirale le doloœene aminokisline v hipervariabilnih regijah protiteles iz razliœnih vzorcev. Repertoar prisotnih naravnih protiteles t.j. polireaktivnih protiteles prisotnih v serumu zdravih posameznikov brez predhodne imunizacije, je vsekakor dovolj raznolik, da to omogoœa (18).
Slika 3: Primerjava sprememb imunoreaktivnosti vzorcev krvodajalcev oksidiranih pri 4,5 V in 1,5 V.
Figure 3: Comparison of immunoreactivity changes between healthy-blood donors samples oxidized with 4,5 V and 1,5 V.
Pri preverjanju sprememb v specifiœnosti z metodo protitoœne imunoelektroforeze nismo dobili pozitivnega rezultata. Odsotnost oborine pomeni, da oksidirane IgG frakcije, izolirane iz seruma zdravih krvodajalcev, niso vsebovale protiteles, ki bi se vezala na znotrajceliœne antigene. Glede tega se naøi rezultati razlikujejo s poroœilom McIntyre in sodelavcev, ki so po oksidaciji IgG frakcije zdravih ljudi s heminom odkrili tudi protitelesa proti jedrnim antigenom (13). Ugotavljamo lahko, da vodi oksidacija protiteles do razliœnih rezultatov tako glede uporabljene napetosti (naøi rezultati: 4,5 V ali 1,5 V), kakor tudi glede uporabljenega oksidacijskega sredstva (npr. hemin).
Zakljuœimo lahko, da naravna protitelesa niso enako dovzetna za oksidacijo, kar poslediœno pomeni tudi razliœno dovzetnost posameznika za pojav avtoimunskih reakcij, ki ob prisotnosti øe nekaterih drugih dejavnikov vodijo v razvoj avtoimunske bolezni. Pogoji ob elektro-oksidaciji seveda niso enaki tistim in vivo, dejstvo pa je, da se v telesu vsakodnevno odvijajo oksidacijski procesi. S tem se ponovno odpira vpraøanje o pomenu dodatnega vnosa antioksidantov v telo, kar je lahko v pomoœ telesu lastnim antioksidativnim mehanizmom, da ob nastanku oksidativnega stresa prepreœijo oksido-redukcijske pretvorbe naravnih protiteles v avtoprotitelesa in s tem morebitni razvoj avtoimunskih bolezni pri dovzetnejøih posameznikih.
5.Sklep
Z naøimi raziskavami smo potrdili, da elektro-oksidacija vodi tudi do spremembe specifiœnosti protitelesa, kar je posledica strukturne
spremembe v molekuli protitelesa, predvsem v hipervariabilnih regijah. Pomembno je, da smo spremembo specifiœnosti zaznali tudi pri nizki napetosti (1,5 V). Sprememba specifiœnosti je odvisna tako od napetosti in œasa oksidacije, kot tudi od same sestave protiteles Ugotovili smo, da se pod vplivom elektriœne napetosti spremeni imunoreaktivnost v serumu prisotnih patogenih protiteles, vendar kliniœno pomembnih sprememb pri danih pogojih nismo dokazali. Dokazali pa smo, da naravno prisotna protitelesa z oksidacijo pridobijo sposobnost vezave z novimi, celo telesu lastnimi, antigeni, oziroma pridobijo lastnosti patogenih avtoprotiteles.
6.Zahvala
Raziskave so bile opravljene v okviru raziskovalnega programa Sistemske avtoimunske bolezni, ki ga sofinancira MZØØ Republike Slovenije (øt. P3-0314). Avtorja se zahvaljujeta dr. Tanji Kveder, dr. Saøi Œuœnik in Poloni Æigon za pomoœ pri delu.
7.Literatura
1.    Yoshioka S, Stella VJ. Stability of drugs and dosage forms. New York, Boston, Dordrecht, London Moscow: Kluwer Academic/Plenum Publishers, 2000: 187-203.
2.    Davies MJ. The oxidative environment and protein damage. Biochimica Biophysica Acta. 2005; 1703(2): 93-109.
3.   Pochernich CB, Sultana R, Mohmmad-Abdul H et al. HIVdementia, Tat-induced oxidative stress, and antioxidant therapeutic considerations. Brain Research Reviews 2005; 50: 14-26.
4.    Wang W. Instability, stabilization, and formulation of liquid protein pharmaceuticals. International Journal of Pharmaceutics 1999; 185: 129-188.
5.   Vozelj M. Temelji imunologije, Dræavna zaloæba Slovenije, Ljubljana, 2000: 53-54, 92-97, 275-304.
6.    Alberts B, Bray D, Lewis J et al. Molecular biology of the cell. 3rd ed. New York: Garland Publishing, 1994: 89-136, 1195-1251.
7.    Wilson WA, Gharavi AE, Koike T, Lockshin MD, Branch DW, Piette JC, et.al. International consensus statement on preliminary classification criteria for definite antiphospholipid syndrome: report on international workshop. Arthritis & Rheumatism 1999; 42 (7): 1309-11.
8.    Œuœnik Ambroæiœ A, Boæiœ B, Skitek M, Kveder T. Anti-beta2-glycoprotein I ELISA: methodology, determination of cut off values in 434 healthy Caucasians and evaluation of monoclonal antibodies as possible international standards. Clinical Chemistry Laboratory Medicine 2000; 38(8): 777-783.
9.    Pierce. Pierce Instructions- ImmunoPure (G) IgG Purification Kit
10.  Kveder T, Boæiœ B. The quality assurance and organization of autoantibody laboratory. The 5th FESCC Continuous Postgraduate Course in Clinical Chemistry, New trends in classification, monitoring and management of autoimune diseases 2005: 67-76.
11.    Bunn C, Kveder T. Counterimmunolelectrophoresis and immunodifusion fore the detection of antibodies to soluble cellular antigenes. In: vanVenrooij WJ, Maini RN (eds) Manual of Biological Markers of Disease. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 1996, A3:1-12.
farm vestn 2006; 57
Sprememba specifiœnosti imunoglobinov razreda G pod vlplivom elektro-oksidacije
12. McIntyre JA. The appearance and disappearance of antiphospholipid autoantibodies subsequent to oxidation-reduction reactions. Thrombosis Research 2004; 114: 579-587.
13. McIntyre JA, Wagenknecht DR, Page Faulk W. Autoantibodies unmasked by redox reactions. Journal of Autoimmunity 2005; 24: 311-317.
14. Reber G, Tincani A, Sanmarco M, de Moerloose P, Boffa MC. Proposals for the measurement of anti-beta2-glycoprotein I antibodies. Standardization group of the European Forum on Antiphospholipid Antibodies. Journal of thrombosis and haemostasis 2004; 2(10): 1860-1862.
15. Tincani A, Allegri F, Balestrieri G, Reber G, Sanmarco M, Meroni P, Boffa MC. Minimal requirements for antiphospholipid antibodies ELISAs proposed by the European Forum on
antiphospholipid antibodies Thrombosis Research 2004; 114 (5-6): 553-558.
16.  Mian I.S, Bradwell A.R, Olson A.J. Structure, Function and Properties of Antibody Binding Sites. Journal of Molecular Biology 1991; 217: 133-151.
17.  Walton DJ, Richards PG, Heptinstall J, Coles B. Electrosynthetic modification of proteins: electrooxidations at methionine and tryptophan in hen egg-white lysozyme. Electrochimica Acta 1997; 42: 2285-2294.
18. Lacroix-Desmazes S, Kaveri SV, Mouthon L, Ayouba A, Malanchère E, Coutinho A, Kazatchkine MD. Self-reactive antibodies (natural autoantibodies) in healthy individuals. Journal of Immunological Methods 1998; 216: (1-2) 117-137.
farm vestn 2006; 57