87 leto XVI / št. 2 / december 2012 ONKOLOGIJA / novosti Izvleček Na Oddelku za molekularno diagnostiko Onkološkega inštituta Ljubljana smo uvedli testiranje mutacij v tumorskem supresorskem genu von Hippel-Lindau (VHL). Mutacije v tem genu povečajo verjetnost za nastanek rakastih bolezni, povezanih s sindromom »von Hippel-Lindau« (VHL), kakor tudi z nastankom sporadičnega raka ledvic. Testiranje dednih mutacij pri bolnikih s sumom na sindrom VHL omogoča zgodnjo pravilno diagnozo bolezni. Prisotnost mutacije v genu VHL je dovolj za potrditev diagnoze sindroma VHL tudi ob odsotnosti značilnih tumorjev. Za testiranje prisotnosti mutacij v genu VHL uporabljamo metodo neposrednega sekvenciranja in metodo MLPA (ang. multiplex ligation-de- pendent probe amplification). S sekvenciranjem odkrivamo točkovne mutacije in manjše delecije ter insercije. Z metodo MLPA pa prisotnost večjih delecij in insercij v genu oziroma delecijo celotnega gena. Pravočasno odkrivanje mutacij v genih, povezanih z nastankom raka, je za nosilce mutacij pomembno, saj je dokazana mutacija razlog za prilagojeno klinično spremljanje in/ali preventivne ukrepe pri nosilcih mutacije. Posledično so zaradi tega povečane možnosti za preprečevanje ali zgodnejše odkrivanje raka. Uvod Mutacije v genu VHL povzročajo nastanek sindroma von Hippel-Lindau (VHL, MIM št. 193300). Gre za redek deden neoplastičen sindrom s številnimi benignimi in malignimi tumorji, predvsem hemangioblastomi mrežnice in osrednjega živčevja (CNS), rakom ledvičnih celic (RCC) in feokromo- citomi. Sindrom VHL naj bi bil vzrok za nastanek približno tretjine hemangioblastomov CNS, več kot 50 odstotkov angi- omov mrežnice, enega odstotka RCC ter polovico družinsko povezanih in 11 odstotkov sporadičnih feokromocitomov. V sklopu tega sindroma se pojavljajo tudi ciste ledvic in trebu- šne slinavke ter cistadenomi obmodka ali širokega ligamenta maternice. Sindrom VHL se deduje avtosomalno dominantno in ima značilno fenotipsko variabilnost in starostno odvisno penetranco. Po veljavnih kliničnih diagnostičnih kriterijih je za potrditev sindroma von Hippel-Lindau, ob potrjeni družinski anamnezi, pri ogroženem sorodniku potrebno najti en tumor, značilen za VHL (npr. hemangioblastom retine ali CNS). Ker se tumorji, značilni za sindrom VHL, lahko pojavljajo tudi sporadično, je za natančnejšo opredelitev sindroma VHL pri posamezniku, ki ne izhaja iz dokazano ogrožene družine, potrebno najti dva tumorja (npr. dva hemangioblastoma ali hemangioblastom in visceralni tumor) [1]. Ključno pri poznavanju sindroma VHL je bilo odkritje, da bolezen povzroča mutacija v tumorskem supresorskem genu VHL [2]. Mutacije v genu VHL najdemo pri vseh bolnikih s sin- dromom VHL. Prisotnost zarodne mutacije v genu VHL tako zadostuje za diagnozo sindroma VHL tudi pri posameznikih, ki še nimajo kliničnih znakov bolezni [2]. Ker je povprečna starost pojavljanja tumorjev pri bolnikih s sindromom VHL ve- liko nižja kot pri bolnikih s sporadičnimi tumorji (~29 let pri hemangioblastomih CNS in 44,8 leta pri RCC), je podatek o prisotnosti mutacije pri testirani osebi izredno pomemben za klinično spremljanje nosilca mutacije. Z rednim spremljanjem odpiramo možnost za zgodnje odkrivanje bolezni in ustrezno zdravljenje. To v praksi pomeni boljše in kakovostnejše preži- vetje bolnikov ter manj stroškov za zdravljenje. Po podatkih za vzhodno Anglijo je bila pred uvedbo določanja mutacij v genu VHL incidenca sindroma VHL ocenjena na 1/36.000 živih rojstev, prevalenca pa na 1/53.000 ter 1/39.000 v jugozahodni Nemčiji [3]. Za slovensko populacijo podatkov o tem ni na voljo. Molekularna genetika Kot vzrok za razvoj sindroma VHL je Latif s sod. leta 1993 identificiral gen VHL. To je vodilo do pojasnitve celičnih mehanizmov nastanka tega sindroma. Gen VHL se nahaja na kromosomski regiji 3p25, dolg je približno 11 kb in se močno izraža tako v zarodkih kot tudi v tkivih odraslih [2]. Kodirajoče zaporedje gena VHL sestavljajo trije eksoni, ki nosijo zapis za dva različna proteina VHL: 213 aminokislin dolg protein (pVHL30) [4] in krajši protein (pVHL19), ki mu manjka prvih 53 aminokislin [5]. Obe izoobliki delujeta kot zaviralki tumorske rasti. Pri tem se naj bi pVHL30 nahajal pretežno v citoplazmi, medtem ko se naj bi pVHL19 nahajal pretežno v jedru [6]. Posamezniki s sindromom VHL so heterozigoti za gen VHL. Razvoj tumorja ali ciste je tako povezan s somatsko inak- tivacijo ali izgubo še delujočega gena VHL [7]. Poleg tega pa najdemo bialelno inaktivacijo gena VHL tudi pri večini primerov sporadičnega RCC, kar ustreza klasičnemu Kundso- novemu modelu nastanka in razvoja raka [8]. Dvajset do 37 odstotkov bolnikov s sindromom VHL ima velike ali delne delecije v genu VHL (0,5 - 250 kb), pri čemer približno 30 odstotkov delecij zajame celoten gen VHL. Tride- set do 38 odstotkov je drugačno smiselnih mutacij in 23 do 27 odstotkov je nesmiselnih mutacij ali mutacij s premikom bralnega okvirja [7]. Za sindrom VHL je značilna zapletena povezava genotipa s fenotipom, pri čemer tip mutacije vpliva na izražanje kliničnih znakov bolezni. Klinično se obolele družine deli glede na prisotnost (tip 2) ali odsotnost (tip 1) feokromocito- mov. Podtipi (A, B in C) pa so označeni glede na tveganje ob pojavljanju drugih vrst tumorjev (Preglednica 1) [9]. Zanimivo je, da je izguba gena HSPC300 (ang. haematopoietic stem/ progenitor cell protein 300) v kombinaciji z izgubo gena VHL povezana z zmanjšanim tveganjem za RCC, kot če je okvarjen le gen VHL [10]. Maša Milatović, Uršula Prosenc Zmrzljak in Srdjan Novaković Odkrivanje dednega sindroma von Hippel-Lindau: določanje mutacij v genu VHL 88 leto XVI / št. 2 / december 2012 ONKOLOGIJA / novosti Molekularni mehanizmi in vloga tumorskega supresorske- ga gena VHL Produkta gena VHL, izoforma pVHL30 in pVHL19, imata številne funkcije in se vključujeta v različne celične procese. V tem prispevku bomo opisali le njun pomen pri razvoju sindroma VHL. Izoforma proteina pVHL uravnavata raz- gradnjo α-podenot transkripcijskih faktorjev HIF-1 in HIF-2 (hipoksija inducibilni faktor 1 in 2), ki sprožita odgovor celice na pomanjkanje kisika [11]. Sestavljata del ubikvitin-ligaznega kompleksa, ki se preko dveh hidroksiliranih prolinov poveže z α-podenotama HIF-1 in HIF-2 in ju tako označi za ubi- kvitinacijo oz. razgradnjo v proteasomu [12]. Hidroksilacijo prolinov α-podenot, HIF-1 in HIF-2, ki je nujna za vezavo na izoforme proteina pVHL, omogoča encim prolin hidroksilaza, ki za svoje delovanje potrebuje tako kisik kot kofaktor. Pri normalnem delovanju produktov gena VHL in ob prisotnosti kisika se podenote HIF-α hitro razgradijo. Ob pomanjkanju kisika, ali zmanjšani aktivnosti produktov gena VHL, pa se HIF-1 in HIF-2 nakopičita in sprožita prepisovanje številnih tarčnih genov, vpletenih v odgovor celice na hipoksijo. Med tarčne gene HIF-1 in HIF-2 spadajo VEGF, PDGFβ, TGFα, ciklin D1 in drugi geni, ki so povezani s procesi angiogeneze, proliferacije, apoptoze in metabolizma [13]. Okvara pVHL v celici sproži celični odgovor, značilen za hipoksijo, kar se odraža v stimulaciji tvorbe tumorskega ožilja (angiogeneza) in s hitrejšo rastjo tumorske mase (Slika 1). Metode za zaznavanje mutacij v genu VHL Na Oddelku za molekularno diagnostiko Onkološkega inšti- tuta Ljubljana določamo mutacije v genu VHL pri bolnikih, za katere obstaja sum, da so nosilci dedne mutacije. Pri teh bolnikih določimo morebitno prisotnost mutacij v genu VHL v vzorcu DNA iz periferne krvi. Poleg tega lahko določamo prisotnost somatskih mutacij tudi v vzorcu tumorske DNA, izolirane iz tumorskega tkiva, fiksiranega v formalinu in vklopljenega v parafin. Velike delecije v genu VHL določamo z metodo MLPA (metoda hkratnega pomnoževanja od ligacije odvisnih sond), s kompletom SALSA® MLPA® P016-C2 (MRC-Holland) [15]. Z metodo MLPA lahko v genu zaznamo insercije in delne ter popolne delecije. V prvem koraku hibridiziramo MLPA-sonde na tarčno sekvenco in sprožimo postopek zlepljanja dveh sosednjih sond z ligazo. Do ligacije pride le med sondami, ki so si dovolj blizu. Med sondami, ki so predaleč (insercija) ali pa ene od sond ni v bližini (delecija), do zlepljanja ne more priti. Sonde, ki jih uporabljamo, imajo na navzven orientiranih končnih delih enotna zaporedja, kamor naležejo univerzalni PCR-začetni oligonukleotidi. To nam omogoča, da z enim parom oligonukleotidnih začetnikov v PCRreakciji pomnožimo le uspešno hibridizirane in zlepljene sonde. Ta pomnožena zaporedja so dolga od 130 do 480 nukleotidov. Produkte PCR-reakcije ločimo na kapilarni elektroforezi in jih analiziramo. Heterozigotne delecije enega ali več eksonov gena VHL so vidne kot 35- do 50-odstotno zmanjšanje relativne količine PCR-produktov, pomnoženih s specifičnimi sondami. Točkovne mutacije v genu VHL določamo z metodo neposre- dnega sekvenciranja vseh treh eksonov gena VHL. Dele gena VHL pomnožimo z metodo PCR, pri čemer uporabljamo specifične oligonuklotide začetnike za eksone 1, 2 in 3 gena Preglednica 1: Povezava genotipa s fenotipom pri sindromu VHL (povzeto po [9]). Tip fenotipa Vrsta mutacije v genu VHL Molekularne nepravilnosti Klinični znaki VHL sindroma Tip 1A Delecije celotnih eksonov in mutacije, ki skrajšajo protein. Povečanje delovanja HIF. Hemangiomi mrežnice in CNS, RCC. Nižje tveganje za nastanek feokromocitomov Tip 1B Delecije dela ali celega gena VHL in sosednjega gena HSPC300. Hemangiomi mrežnice in CNS, manjše tveganje za nastanek RCC. Tip 2A Drugačno smiselne mutacije. Povečanje delovanja HIF in nezmožnost stabilizacije mikrotubulov. Hemangiomi in feokromocitomi. Nižje tveganje za nastanek RCC. Tip 2B Povečanje delovanja HIF. Hemangiomi, feokromocitomi. Večje tveganje za nastanek RCC. Tip 2C Določene drugačno smiselne mutacije. pVHL obdrži zmožnost zaviranja HIF, zmanjšana sposobnost vezave na fibronektin, nepravilna izgradnja fibronektinske mreže. Le feokromocitomi. Slika 1: Prikaz delovanja produktov normalnega in mutiranega gena VHL. Ko protein pVHL deluje normalno in je v celici prisoten kisik, se α-podenote transkripcijskih faktorjev HIF povežejo s pVHL v ubikvitinazni kompleks. Podenote HIF-α se ubikvitinirajo in razgradijo v proteasomu. Ko je protein pVHL okvarjen (mutiran) se v celicah kopičijo α-podenote transkripcijskih faktorjev HIF in sprožijo prepisovanje tarčnih genov, kot so VEGF, PDGF, TGFα idr. Tirozin kinazni inhibitorji, kot sta sorafenib in sunitinib, inhibirajo receptorje za VEGF in PDGF ter tako zmanjšajo posledice mutacij v genu VHL [13, 14]. 89 leto XVI / št. 2 / december 2012 ONKOLOGIJA / novosti VHL. PCR-produkte sekvenciramo s sekvenatorjem ABI3500 in odčitamo morebitne točkovne spremembe v primerjavi z referenčnim zaporedjem gena VHL (Slika 2). DNA iz vzorcev, vklopljenih v parafin, je bolj razgrajen, zato pri teh vzorcih uporabljamo več kompletov oligonukleotidnih začetnikov, s katerimi sekvenciramo krajše odseke DNA. S prekrivanjem robnih delov zaporedij zaznamo morebitne mutacije v celotnem genu. Zaključek Z metodo MLPA in sekvenciranjem celotnega gena VHL lahko temeljito preverimo prisotnost mutacij v kodirajočem delu nukleotidnega zaporedja gena. Mutacije gena VHL lahko določamo iz DNA, izolirane iz svežih in zmrznjenih vzorcev (krvi, tkiva …) ali iz tumorskega tkiva, vključenega v parafin. Z omenjenima metodama lahko potrdimo prisotnost germinalnih in/ali somatskih mutacij. Germinalne mutacije lahko določamo tudi pri osebah, ki nimajo razvitih kliničnih znakov sindroma VHL. Za dokazovanje somatskih mutacij v tumorskem tkivu, vključenega v parafin, je treba zagotoviti dele tkiva z največjim deležem tumorskih celic. Z določanjem germinalnih mutacij v genu VHL omogočamo evidentiranje nosilcev mutacij in ustrezno (zgodnje) klinično spremljanje. Rezultat tega je večja verjetnost, da tumorje odkrijemo v zgodnjih fazah razvoja in s tem omogočimo uspešnejše zdra- vljenje ter daljše in kakovostnejše preživetje. V zadnjem času je določanje mutacij v genu VHL smiselno tudi pri bolnikih s somatskimi mutacijami, kajti njihova prisotnost je napovedni dejavnik za zdravljenje s tirozin kinaznimi inhibitorji. Viri 1. Melmon, K.L. and S.W. Rosen, Lindau's Disease. Review of the Literature and Study of a Large Kindred. Am J Med, 1964. 36: p. 595-617. 2. Latif, F., et al., Identification of the von Hippel-Lindau disease tumor suppressor gene. Science, 1993. 260(5112): p. 1317-20. 3. Maher, E.R., H.P. Neumann, and S. Richard, von Hippel-Lindau disease: a clinical and scientific review. Eur J Hum Genet, 2011. 19(6): p. 617-23. 4. Iliopoulos, O., et al., Tumour suppression by the human von Hippel-Lindau gene product. Nat Med, 1995. 1(8): p. 822-826. 5. Schoenfeld, A., E.J. Davidowitz, and R.D. Burk, A second major native von Hippel-Lindau gene product, initiated from an internal translation start site, functions as a tumor suppressor. Proc Natl Acad Sci U S A, 1998. 95(15): p. 8817-22. 6. Duan, D.R., et al., Characterization of the VHL tumor suppressor gene product: localization, complex formation, and the effect of natural inactivating mutations. Proc Natl Acad Sci U S A, 1995. 92(14): p. 6459-63. 7. Stolle, C., et al., Improved detection of germline mutations in the von Hippel-Lindau disease tumor suppressor gene. Hum Mutat, 1998. 12(6): p. 417-23. 8. Kundson AG, S.L., Anderson DE, Heredity and cancer in man. Prog Med Genet, 1973. 9: p. 113-158. 9. Kim, W.Y. and W.G. Kaelin, Role of VHL gene mutation in human cancer. J Clin Oncol, 2004. 22(24): p. 4991-5004. 10. Cascón, A., et al., Loss of the actin regulator HSPC300 results in clear cell renal cell carcinoma protection in Von Hippel-Lindau patients. Human Mutation, 2007. 28(6): p. 613-621. 11. Maxwell, P.H., et al., The tumour suppressor protein VHL targets hypoxia-inducible factors for oxygen-dependent proteolysis. Nature, 1999. 399(6733): p. 271-5. 12. Iwai, K., et al., Identification of the von Hippel-lindau tumor-su- ppressor protein as part of an active E3 ubiquitin ligase complex. Proc Natl Acad Sci U S A, 1999. 96(22): p. 12436-41. 13. Kaelin, W.G., Jr., Treatment of kidney cancer: insights provided by the VHL tumor-suppressor protein. Cancer, 2009. 115(10 Suppl): p. 2262-72. 14. Rini, B.I., Metastatic renal cell carcinoma: many treatment options, one patient. J Clin Oncol, 2009. 27(19): p. 3225-34. 15. Schouten, J.P., et al., Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification. Nucleic Acids Res, 2002. 30(12): p. e57. Slika 2: Elektroferogram dela zaporedja gena VHL pri A - nemutiranem vzorcu in B - mutiranem vzorcu, s homozigotno delecijo nukleotida G.