POMURSKA OBZORJA Vol. 16, No. 1, pp. 35–44, marec 2022 https://doi.org/10.18690/po.16.1.35-44.2022 Besedilo © Škerget, 2022 KVALITETNO DELO V GENETSKEM DIAGNOSTIČNEM LABORATORIJU Sprejeto 10. 11. 2021 Izdano 31. 3. 2022 ALENKA ERJAVEC ŠKERGET Univerzitetni klinični center Maribor, Klinika za ginekologijo in perinatologijo, Laboratorij za medicinsko genetiko, Maribor, Slovenija. E-pošta: alenka.erjavec@guest.arnes.si DOPISNI AVTOR alenka.erjavec@guest.arnes.si Ključne besede: kontrola kvalitete, kontrola kakovosti, genetski laboratorij, humana genetika Povzetek V genetskem diagnostičnem laboratoriju UKC Maribor se zavedamo, da je kakovost preiskav, ki se v laboratoriju izvajajo, pomemben člen in pomoč zdravnikom pri postavljanju diagnoz, spremljanju in zdravljenju bolezni naših pacientov. Zato uporabnikom nudimo storitve, ki izpolnjujejo cilj našega sistema kakovosti v skladu s Pravilnikom o pogojih, ki jih morajo izpolnjevati laboratoriji za izvajanje preiskav na področju laboratorijske medicine izdanim v UL. Št. 64, 11. 6. 2004. Laboratorij za medicinsko genetiko UKC Maribor je pridobil dovoljenje za delo, za izvajanje preiskav na področju laboratorijske medicinske genetike. Kakovost preiskav zagotavljamo z vsakodnevnim in sprotnim izvajanjem notranje kontrole kakovosti posameznih postopkov in analizatorjev. Sodelujemo v obvezni mreži zunanjih evropskih kontrol kakovosti EMQN, EQA, CEQAS, GENQA. Z uvajanjem in preverjanjem novih metod med laboratorijsko kontrolo zagotavljamo primerljivost rezultatov analiz v procesih validacije in verifikacije. Udeleženi smo tudi pri izvajanju in obnavljanju ISO standarda ISO9001: 2015. Od leta 2019 UKC Maribor sodeluje v shemi Sistem International Accreditation Standards AACI Vers.5.0. Delo s pacientovim biološkim materialom, ravnanje z izvidi, spremljanje zdravstvenih stanj naših bolnikov, kot tudi raziskovalno delo na pacientovem materialu, zahteva specifično deontološko znanje, ki ga vršimo s spoštovanjem Kodeksa deontologije v laboratorijski medicini. 36 POMURSKA OBZORJA. 1 Uvod Cilj vsake medicinske kvalitetne obravnave je dosegati največjo možno mero KAKOVOSTNIH oz. kvalitetnih storitev za pacienta. Za zagotovitev najvišje kakovosti v genetskem smislu to pomeni zagotovitev preverjenosti (validacija in verifikacija), zagotovitev pravilnosti in tako omogočiti klinično uporabnost rezultata. Kvalitetna genetska laboratorijska obravnava tako zajema analitsko validacijo, ki omogoča zanesljivost rezultata, zajema tudi klinično validacijo (kar omogoča povezavo analize s specifično boleznijo) ter oceno oz. ovrednotenje klinične uporabnosti testa, kar omogoča povezavo analize z upravljanjem diagnosticirane bolezni. V ta namen obstajajo različne organizacije oz. združenja, ki zagotavljajo in spremljajo tovrstne obravnave. Na temo kvalitetne obravnave vzorcev v genetskem laboratoriju je bilo v letu 2020 opravljeno srečanje v okviru Združenja za medicinsko genetiko Slovenije, kjer smo vsi genetski laboratoriji pripravili prispevke in poročali o dosedanjem genetskem delu v laboratoriju. Srečanje je bilo namenjeno diskutiranju in pripravi novih smernic in priporočil za delo ter poenotenju pravil na področju izboljšave kvalitetnega dela genetskih laboratorijev v Sloveniji. 2 Laboratorij za medicinsko genetiko v UKC Maribor Laboratorij za medicinsko genetiko v UKC Maribor je bil ustanovljen v sklopu diagnostičnih dejavnosti v takratni Splošni bolnišnici Maribor leta 1991. Svojo dejavnost od takrat opravlja v prostorih današnjega UKC Maribor, kjer je zasnovan kot diagnostično - raziskovalni laboratorij. Laboratorij nudi genetske preiskave na področju podedovanih in pridobljenih genetskih sprememb in prenatalne genetske diagnostike ter genetike raka. Strokovno usposobljen kader opravlja analize kromosomskih in genskih mutacij, variabilnosti ter presežkov in primanjkljajev genetskega materiala v humanem genomu. Genetske analize se opravljajo pri preiskovancih s sumom na genetsko obolenje ali sindrom ter pri preiskovancih s sumom na genetsko predispozicijo za določene kompleksne bolezni. Laboratorij za medicinsko gentiko v UKC Maribor je organizacijsko uvrščen pod Skupne službe Klinike za ginekologijo in perinatologijo. A. Erjavec Škerget: Kvalitetno delo v genetskem diagnostičnem laboratoriju 37. 3 Kakovost v UKC Maribor Sistem vodenja kakovosti je na nivoju UKC Maribor pod nadzorom Centra za kakovost, ki posreduje navodila, napotke in vzdržuje celotno področje kakovosti. V Sloveniji je v veljavi sicer več mednarodnih akreditacijskih standardov za zdravstvene organizacije; od leta 2017 je UKC MB pridobil standard ISO9001: 2015 in v okviru tega smo kot Laboratorij za medicinsko genetiko bili preverjani tudi mi. Od leta 2019 UKC Maribor sodeluje v shemi Sistem International Accreditation Standards AACI Vers.5.0, v okviru tega standarda imamo vsakoletne presoje tudi v Laboratoriju za medicinsko genetiko. Krovni dokument sistema kakovosti v UKC Maribor je Poslovnik kakovosti poslovanja UKC Maribor. Na njega imamo vezane dokumente sistema kakovosti, ki se nanašajo na delovanje laboratorija. LMG: Organizacijski predpis z naslovom Proces medicinske genetike ter pripadajoči obrazci OB Organizacijska struktura v LMG in Poslovnik kakovosti s splošnimi informacijami LMG. Preko teh dokumentov podajamo načela delovanja, urejamo in povezujemo sistem kakovosti Laboratorija za medicinsko genetiko, skladno z zahtevami statuta UKC MB, standardi ISO 9001:2015 in Pravilnika o pogojih, ki jih morajo izpolnjevati laboratoriji za izvajanje preiskav na področju laboratorijske medicine (UL RS, št. 64/2004 in 01/16). Vsa dokumentacija sistema kakovosti je v UKC MB organizirana v obliki hierarhične strukture po nivojih: prvi, najvišji nivo predstavlja krovni dokument ustanove: Poslovnik kakovosti UKC MB; na 2. nivoju so predstavljeni posamezni organizacijski procesi, ki potekajo v UKC MB; tretji nivo predstavljajo organizacijska navodila oz. Pravilniki po posameznih področjih. Četrti nivo predstavlja dokumentacija v obliki NAV (navodil) in SOP (standardni operativni postopek), 5. nivo pa dokumentacija v obliki OBR (obrazci ) in PRIL (priloge) znotraj posameznega procesa. Dokumentacija v Laboratoriju tako obsega osnovni krovni dokument, ki predstavlja 2. nivo, gre za organizacijski proces z imenom Proces medicinske genetike. V dokumentu je predstavljeno področje dela, ki je razdeljeno na dva dela: citogenetsko področje in molekularno genetsko področje. Nadaljnja dokumentacija laboratorija je organizirana na naslednjih nivojih (3. 4. in 5. nivo in trenutno predstavlja 63 izdanih SOP-ov, 27 izdanih navodil in 71 izdanih obrazcev. Obvladujemo 202 aparaturnih map, ki jih imajo vse aparature, od katerih predstavljajo avtomatske pipete približno tretjino. 38 POMURSKA OBZORJA. 4 Metodologija dela 4.1 Nadzor in zagotavljanje kakovosti dela v laboratoriju V LMG zagotavljamo nadzor izvajanja nad postopki in procesi pred, med in po preiskavi posameznega vzorca preko sistema kakovosti s spremljanjem posameznih analiz, zabeležk in zapisov na delovne liste, v Laboratorijske dnevnike ali zabeležimo spremembe v SOP-ih. Vso delo temelji na najnovejših evropskih smernicah, ki jih spremljamo in jih upoštevamo. 4.2 Organizacija notranje kontrole kakovosti Notranja kontrola kakovosti v LMG je organizirana v skladu z navodili v posameznem SOP-u za določeno preiskavo opisano v točki 5.7 (kontrolni postopek). Za področje citogenetike (CGL) izvajamo notranje preverjanje zaradi subjektivno pridobljenih rezultatov, ki so kvalitativne narave (gre za vizualno vrednotenje preko mikroskopiranja) preko naslednjih kontrolnih točk: • vzpostavitev vzporednih celičnih kultur, • neodvisna subjektivna analiza dveh analitikov, • pregled supervizorja, • pravilno vzdrževana organizacija in kalibracija merilne opreme, • usposobljenost kadra, • zagotovitev sledljivosti in identifikacije vzorca. Za področje molekularne genetike (MGL) je notranja kontrola prisotna pri vsakokratnem izvajanju določene diagnostične analize, kar pomeni sprotno uporabo pozitivne, negativne in ničelne kontrole pri vsaki analizi. Poleg tega izvajamo notranjo kontrolo še preko potrditve patoloških oz. kritičnih rezultatov z drugo vrsto analize, če je to možno. Vse rezultate pregleda in ovrednoti še supervizor, opravljamo pa še občasne nenamenske kontrole glede sledljivosti in identifikacije vzorca. A. Erjavec Škerget: Kvalitetno delo v genetskem diagnostičnem laboratoriju 39. 4.3 Sodelovanje v zunanji oceni kakovosti LMG vsako leto sodeluje še v zunanji oceni kakovosti preko evropske genetske mreže (EMQN, GENQA). Za področje citogenetike smo v evropskih shemah preverjanja sodelovali od leta 2010 do 2019 v t.i. shemi CEQAS. Od leta 2019 z naborom citogenetskih preiskav vključeni v mrežo GENQA . Od nabora preiskav s citogenetskega področja, ki jih izvajamo, gre za kariotipizacije iz periferne krvi, amnijske tekočine, horionskih resic in kostnega mozga, sodelujemo v shemah izmenjaje, po letih (Tabela 1). V okviru molekularno-citogenetske diagnostike, ki pretežno zaobjema zaobjema analizo s FISH tehniko, imamo pridobljen certifikat na dveh vrstah tkiv: kostni mozeg in amnijske celice s hitro prenatalno analizo. Sicer opravljamo še druge vrste FISH analiz: subtelomerne kromosomske spremembe, mikrodelecijski sindromi, amplifikacija gena Her2, uroVysion test pri raku mehurja. Genomsko diagnostiko, kjer uporabljamo dve tehnologiji, primerjalno genomsko hibridizacijo in novo generacijo sekvenciranja, testiramo vsakoletno. Tabela 1: Predstavitev shem zunanje kontrole v LMG za citogenetsko področje v letih 2009 do 2020 Leto Shema datum izdaje/evropska mreža Certifikat 2010 CEQA 2010 - amnijske celice Online 31.08.2010/CEQA EQA pridobljen 2011 CEQA 2011 - perif.venska kri 31.08.2011/CEQA EQA pridobljen 2012 CEQA 2012 - horionske resice 29.08.2012/CEQA EQA pridobljen 2013 CEQA 2013 - per.venska kri 31.08.2013/CEQA EQA pridobljen 2014 CEQAS 2014 - konstitucijske mikromreže (postnatalno) 31.12.2014/CEQAS EQA pridobljen 2015 CEQAS 2015 - horionske resice (Online) 31.12.2015/CEQAS EQA pridobljen 2016 CEQAS 2016 - mieloidne preureditve 01.03.2017/CEQAS EQA pridobljen 2017 CEQA 2017 - mikromreže postnatalno EQA 2017 - molekularna hitra aneuploidija 31.03.2018/CEQAS EQA 31.03.2018/CEQAS EQA pridobljen pridobljen 2018 GENQA 2018 - prenatalne konstitucijske mikromreže za CNV 30.03.2019/GENQA pridobljen 2019 GENQA 2019 - postnatalne konstitucijske mikromreže 31.03.2020/GENQA EQA pridobljen 2020 GENQA 2020 - patogenost germinalne linije pri postnatalnih CNV z mikromrežami 31.03.2020/GENQA EQA pridobljen 2021 GENQA 2021 - kronična limfocitna levkemija (CLL) 31.03.2021/GENQA EQA pridobljen 40 POMURSKA OBZORJA. Preiskave s področja MGL potekajo v skladu z evropskimi smernicami za laboratorijsko molekularno genetiko in so opisana/predstavljena na straneh EuroGenTest. V okviru evropske mreže so tako predstavljene smernice na treh področjih: (1) smernice, ki vključujejo genetske spremembe, specifične za bolezni; (2) smernice, ki vključujejo genetske spremembe, ki NISO specifične za določeno bolezensko področje (so pa lahko v povezavi z določeno boleznijo); (3) klinično pomembne smernice. Seznam preiskav, ki jih izvajamo s področja molekularne genetike je predstavljen v Tabeli 2. Tabela 2: Seznam preiskav MGL z opravljenimi zunanjimi kontrolami v letih 2009 do 2021 1. Določanje HLA-DQB1 genotipa – genetska diagnostika celiakije 2. Določanje mutacije Leiden in polimorfizma v genu za protrombin 3. Določanje mutacij v genu HFE – genetska diagnostika hemokromatoze 4. Določanje mutacij v genu NOD2/CARD15 5. Določanje mikrodelecij na kromosomu Y 6. Določanje mutacij v genu MTHFR – genetska diagnostika hiperhomocisteinemije 7. Določanje mutacij v genu PMP22 – genetska diagnostika HMSN tip 1a/HNPP 8. Določanje HLAB27 9. Določanje mutacij v genu za alfa1-antitripsin 10. Določanje mutacij genov SMN1 in SMN2 – gen.diagnostika spinalne mišične atrofije 11. Določanje mutacij v genu za distrofin 12. Določanje spola – dokazovanje prisotnosti kromosoma Y 13. Določanje številčnih kromosomskih abnormalnosti - hitri test (QFPCR analiza) 14. Določanje mutacij v genu CFTR - genetska diagnostika cistične fibroze 15. Določanje mutacij v genu IT15 – genetska diagnostika Huntingtonove bolezni 16. Določanje ponovitev CAG v androgenske receptorju pri diagnostiki bolezni Kennedy 17. Določanje subtelomernih strukturnih genomskih variabilnosti – MLPA analiza 18. Določanje mikrodelecijskih sindromov – MLPA analiza 19. Določanje mutacij v genu FMR1 – genetska diagnostika sindroma fragilni X 20. Določanje mutacije v genu UGT1A1 – genetska diagnostika sindroma Gilbert 21. Določanje mutacij v genih MTND1, MTND4, MTND6 – Leberjeve optična atrofija 22. Določanje HLA B51 alela 23.Določanje mutacije V617F v genu JAK2 24. Inaktivacija kromosoma X 25. Določanje Uniparentalne disomije in PRT testiranje 27.Določanje mutacij v genu GJB2 pri naglušnosti 28. Določanje CalR/MPN pri mieloproliferativnih neotvorbah 29. Določanje hematoloških mutacij: Braf, Jak ex12; MYD88; C-KIT 30. Določanje fuzijskega gena bcr/abl z Xpert sistemom 31. Določanje mutacijskega statusa IgHV 32. Določanje mutacije CYP2C9*2* 33. Določanje FLT3 mutacije 34. Določanje PAI mutacije (inhibitor plazminogen aktivatorja 1) A. Erjavec Škerget: Kvalitetno delo v genetskem diagnostičnem laboratoriju 41. Od leta 2009 sodelujemo pri zunanjih kontrolah v shemah EMQN z različnimi nabori, z letom 2019 pa poleg teh še v shemah GENQA. V tabeli 3 so predstavljene diagnostične preiskave, po letih in vrsti sodelovanja. Tabela 3: Predstavitev shem zunanje kontrole za molekularno-genetsko področje v letih 2009 do 2020 Leto Shema datum izdaje/evropska mreža Certifikat 2009 Hereditary Haemochromatosis 2009/ EMQN pridobljen (1,97/2,00) 2010 Y -Chromosome Microdeletion 2010/ EMQN pridobljen (1,98/2,00) 2011 Huntington Disease 2011/ EMQN pridobljen (1,97/2,00) 2012 Spinal Muscular Atrophy 2012/ EMQN pridobljen (1,96/2,00) 2013/14 Duchenne/Becker MD (MLPA) 2013/ EMQN pridobljen 2015 Fra X (Pre-screen) 2014/ EMQN pridobljen (1,50/2,00) 2016 Hereditary Haemochromatosis 2016/ EMQN pridobljen 2017 Prader-Willi/Angelmann Sy. Molecular Rapid Aneuploidy (QFPCR / MLPA/ BoBs) 2017/ EMQN 2017/CEAQ+EQA pridobljen (2,00/2,00) pridobljen 2018 Deafness (DFNB1) 2018/ EMQN pridobljen (2,00/2,00) 2019 Cardiac (HCM) 2019/ EMQN pridobljen 2020 Cystic Fibrosis 2020/ GENQA pridobljen 2021 Chronic Lymphocytic Leukaemia (CLL) IGHV mutation status; TP53 status 2021/ GENQA v delu 5 Razprava z zaključkom V genetskem diagnostičnem laboratoriju UKC Maribor se zavedamo, da je kakovost preiskav, ki se v laboratoriju izvajamo, pomemben člen in pomoč zdravnikom pri postavljanju diagnoz, spremljanju in zdravljenju bolezni naših pacientov. Zato uporabnikom nudimo storitve, ki izpolnjujejo cilj našega sistema kakovosti. 42 POMURSKA OBZORJA. Kakovost preiskav zagotavljamo z vsakodnevnim in sprotnim izvajanjem notranje kontrole kakovosti posameznih postopkov in analizatorjev. Sodelujemo v obvezni mreži zunanjih evropskih kontrol kakovosti EMQN, EQA, CEQAS. Z uvajanjem in preverjanjem novih metod med laboratorijsko kontrolo zagotavljamo primerljivost rezultatov analiz v procesih validacije in verifikacije. V skladu s finančnimi zmožnostmi UKC MB sodelujemo letno z največ možnimi shemami, tako da pokrijemo delo na vseh področjih, ki jih izvajamo v laboratoriju: citogenetika, molekularna-genetika, NGS ter klinična genetika. Načrt izvedbe in sodelovanja v zunanjih kontrolah dogovorimo na laboratorijskih sestankih. Glede na število preiskav ki jih opravljamo v LMG UKCMB s področja citogenetike s sodelovanjem v zunanji kontroli pokrivamo vse vrste preiskav pri kariotipizacijah (100%), pri vrednotenju tehnike FISH pa pri 28.6% preiskav. Glede na to, da tehnično FISH predstavlja enako metodologijo povsod, je po naših izkušnjah tovrstno sodelovanje zadostno. Na področju MGL, kjer izvajamo 25 različnih diagnostičnih preiskav, sodelujemo v zunanji kontroli z cca 40% preiskav (10/25). Genomska diagnostika z metodologijo primerjalna genomska hibridizacija je pod zunanjo kontrolo vsako leto (100%). Enako genomska diagnostika z metodo nove generacije sekvenciranja (100%). Delo s pacientovim biološkim materialom, ravnanje z izvidi, spremljanje urgentnih stanj naših bolnikov, kot tudi raziskovalno delo na pacientovem materialu, zahteva specifično deontološko znanje, ki ga vršimo s spoštovanjem Kodeksa deontologije v laboratorijski medicini. Zahvala Avtorica prispevka se zahvaljujem kolektivu Laboratorija za medicinsko genetiko UKC Maribor, ki so kakorkoli pripomogli k uspešnemu delu, katerega rezultat je objava pričujočega prispevka. Literatura Dequeker, D. (2017). Molecular Diagnostics (Third Edition), Chapter 29: Quality Assurance in Genetic laboratories: p.493-500; Pridobljeno s https://doi.org/10.1016/B978-0-12-802971-8.00029-8 EMQN. (2022). Pridobljeno s https://www.emqn.org/ EuroGenTest. (2011). Pridobljeno s http://www.eurogentest.org/index.php?id=139 Pravilnik o dopolnitvah Pravilnika o pogojih, ki jih morajo izpolnjevati laboratoriji za izvajanje preiskav na področju laboratorijske medicine (Uradni list RS, št. 131/20 z dne 28. 9. 2020) Pravilnik o dopolnitvi Pravilnika o pogojih, ki jih morajo izpolnjevati laboratoriji za izvajanje preiskav na področju laboratorijske medicine (Uradni list RS, št. 56/19 z dne 17. 9. 2019) A. Erjavec Škerget: Kvalitetno delo v genetskem diagnostičnem laboratoriju 43. Pravilnik o pogojih, ki jih morajo izpolnjevati laboratoriji za izvajanje preiskav na področju laboratorijske medicine (Uradni list RS, št. 64/04 z dne 11. 6. 2004) Pravilnik o spremembah in dopolnitvah Pravilnika o pogojih, ki jih morajo izpolnjevati laboratoriji za izvajanje preiskav na področju laboratorijske medicine (Uradni list RS, št. 1/16 z dne 8. 1. 2016) Sistem International Accreditation Standards AACI Vers.5.0; TX 8-784-160. Pridobljeno s https://aacihealthcare.com/news/aaci-copyrighted-its-accreditation-standards-version-5-0/