Nanodelci: sodobni dostavni sistem za uoinkovine in antigene celicam imunskega sistema Nanodelci: sodobni dostavni sistem za uoinkovine in antigene celicam imunskega sistema Nataoa Obermajer, Janko Kos, Julijana Kristl Povzetek Imunske celice se nahajajo v telesnih tekooinah in tkivih po celotnem organizmu in predstavljajo premikajooe taroe za ciljanje z uoinkovinami. Zaradi neoptimalnega klasionega naoina dostavljanja uoinkovin tem celicam, kjer bi le z visokimi vrednostmi proste uoinkovine v serumu dosegli zadovoljive uoinke, predstavljajo nanodelci privlaoen sistem za dostavo uoinkovin imunskim celicam. Nanodelce lahko uporabimo kot dostavne sisteme za bolj uoinkovit vnos antigenov v antigen predstavitve celice, kot tudi za dostavo uoinkovin dolooenim populacijam limfocitov. S tem doseaemo regulacijo imunskega delovanja ali pa imunski sistem izkoristimo za poveoanje uoinkovitosti vgrajenih uoinkovin v nanodelce pri zdravljenju okuaenih ali tumorskih celic. Kljuone besede: nanodelci, ciljanje, protitelesa, celice imunskega sistema Abstract As the immune cells are distributed in bodily fluids and tissues throughout the organism, they represent a moving target for drug delivery. In this case a classical approach applying high doses of the drug is not appropriate and, therefore, the use of nanoparticles represents a good alternative to avoid, or at least decrease its side effects and increase efficacy. Nanoparticles can be used as an efficient delivery system to enhance the uptake of antigens by antigen presenting cells as well as to target specific lymphocyte populations. With such approach we can regulate the immune function or merely exploit the function of immune cells to improve efficacy of drug loaded nanoparticles in treatment of infected or malignant transformed cells. Key words: nanoparticles, targeting, antibodies, immune cells 1 Uvod Imunski sistem je pomemben za prepoznavanje in odstranjevanje mikroorganizmov in tujih snovi iz organizma, torej eksogenih spojin, ki vstopajo iz okolja, kot tudi transformiranih endogenih celic in snovi. Pravilna in uoinkovita aktivacija imunskega odziva zagotavlja normalno delovanje organizma. Antigeni so lahko endogenega ali eksogenega izvora. Endogene antigene predstavljajo veoinoma spremenjeni celioni proteini, lahko tudi glikoproteini ali druge biolooke molekule, pri eksogenih antigenih pa gre za predstavitev fagocitiranega materiala. Znotrajcelioni antigenski peptidi, kot deli razgrajenih proteinov vseh metabolno aktivnih celic, se veoinoma predstavijo na molekulah poglavitnega kompleksa tkivne skladnosti I. razreda (MHC I, ang. major histocompatibility complex type I). Predstavljeni proteini na MHC I po vezavi na T celione receptorje aktivirajo citotoksioni T limfocitni (CD8+ limfocitni) imunski odziv. Na ta naoin organizem odstrani spremenjene celice, kot posledico maligne transformacije ali virusne okuabe. Zunajcelioni antigenski peptidi pa nastanejo po vstopu zunajcelionega materiala in se predstavljajo z MHC II le na antigen predstavitvenih celicah (APC). Na ta naoin se aktivira CD4+ T celioni imunski odziv (T celice pomagalke), ki lahko posreduje tudi imunski odziv s protitelesi oz. humoralni imunski odziv proti tem tujkom. Z izkoriooanjem predstavitve antigena preko endogene ali eksogene poti, lahko vplivamo na uoinkovito aktivacijo imunskega odziva. Za primerno aktivacijo imunskega sistema je potrebna: - prisotnost zadostne kolioine antigena APC, zlasti makrofagom in dendritionim celicam, - nadzorovana predstavitev antigenskih peptidov taronim imunskim celicam (T limfociti CD4+ in/ali CD8+), - proliferacija efektorskih celic kot so citotoksioni limfociti T (CTL) in plazmatke - ohranitev aktiviranega imunskega sistema daljoi oas (1). Nataoa Obermajer, mag. farm., Fakulteta za farmacijo, Univerza v Ljubljani, Aokeroeva 7, 1000 Ljubljana, Slovenija prof. dr. Janko Kos, univ. dipl. kem., Fakulteta za farmacijo, Univerza v Ljubljani, Aokeroeva 7, 1000 Ljubljana, Slovenija Institut Joaef Stefan, Jamova 39, 1000 Ljubljana, Slovenija prof. dr. Julijana Kristl, mag. farm. Fakulteta za farmacijo, Univerza v Ljubljani, Aokeroeva 7, 1000 Ljubljana, Slovenija farm vestn 2007; 58 39 Pregledni olanki - Review Articles Boljoa predstavitev antigenov, ki bi jo dosegli z uoinkovito dostavo antigenov fagocitnim APC, bi omogooila moonejoi imunski odziv in s tem uoinkovitejoe odstranjevanje okuaenih in rakavih celic (2). Zaradi sposobnosti makrofagov in dendritionih celic za privzemanje nanodelcev, so le-ti primerna taroa za ciljano zdravljenje, ki bi povzrooila uoinkovit imunski odziv. V primeru prekomernega celionega ali humoralnega imunskega odziva, ki nastopi pri raznih avtoimunskih obolenjih ter v primeru limfoproliferatornih bolezni, pa so primerna taroa zlasti limfociti. Zaradi specifionih limfocitnih povroinskih molekul lahko doseaemo ciljano dostavo z nanodelci kljub heterogeni porazdelitvi limfocitov v organizmu. V nadaljevanju bomo predstavili lastnosti nanodelcev kot dostavnih sistemov, naoine vgrajevanja klasionih in proteinskih uoinkovin, predstavili izdelavo tarono-specifionih nanodelcev ter znaoilnosti specifionega ciljanja posameznih populacij imunskih celic z nanodelci. 2 Lastnosti nanodelcev Nanodelci so med otevilnimi znanimi dostavnimi sistemi nanometrskih velikosti izredno privlaoni dostavni sistemi (3). So trdni koloidni delci velikosti 10-1000 nm. Zgrajeni so iz nosilnega ogrodja, v katerih je uoinkovina raztopljena ali dispergirana ali na katere je uoinkovina adsorbirana ali kovalentno vezana (4). Tovrstni dostavni sistemi se odlikujejo po izvrstni zmogljivosti vgradnje uoinkovine in omogooajo kontrolirano sproooanje uoinkovine kot tudi zaooito pred razgradnjo (5,6). Po intravenski aplikaciji se nanodelci kopioijo v tkivih mononuklearnega fagocitnega sistema ter tudi v tumorskem tkivu, kar je posledica tako imenovanega EPR (enhanced permeability and retention) uoinka, pri katerem se nanodelci zadraujejo v tkivih z ailjem s poveoano prepustnostjo (7). Z vgradnjo tarono-specifionih ligandov na njihovo povroino (aktivno ciljanje) pa doseaemo specifiono ciljanje v posamezne celice ali tkiva. 2.1 Vgrajevanje uoinkovin v nanodelce Vgradnja uoinkovine v ogrodje nanodelcev lahko poteka med samo izdelavo ali pa z adsorbcijo na ae formirane nanodelce. Pri prvi metodi lahko pride do kovalentne vezave med uoinkovino in polimerom. Pri adsorbciji uoinkovine pa je nastala interakcija med adsorbirano uoinkovino in nanodelcem lahko nestabilna, zlasti po vnosu pripravka v organizem (4). Uspeonost vgradnje uoinkovine v nanodelce je odvisna od kemione sestave polimera, molekulske mase, interakcij uoinkovina-polimer in prisotnosti funkcionalnih skupin (esterskih ali karboksilnih) (4,8). V nanodelce iz hidrofobnih polimerov (PLA - ang. polylactic acid, polimleona kislina; PLGA - ang. polylactic glycolic acid, poli(mleona glikolna) kislina) laaje vgrajujemo lipofilne uoinkovine. Vgradnja hidrofilnih uoinkovin predstavlja izziv predvsem zaradi uhajanja uoinkovine iz notranje v zunanjo vodno fazo. Kljub temu pa obstajajo otevilne moanosti optimizacije vgradnje hidrofilnih uoinkovin: izbira postopka izdelave, uporaba pomoanih snovi, ustrezna pH vrednost, neionizirana in ionizirana oblika uoinkovine, molekulska masa polimera. Alternativna moanost je kemijska vezava uoinkovine preko razgradljive vezi, ki naj bi omogooila boljoo vgradnjo uoinkovine ter njeno kontrolirano sproooanje (8). Slika 1: Vgradnja proteinske uoinkovine v nanodelce z dvojno emulzijsko metodo (A) in nanoprecipitacijo (B). Sonikacija polimera, raztopljenega v organski fazi v prisotnostni vodne raztopine proteina vodi v nastanek emulzije V/O. Sonikacija emulzije V/O v prisotnosti veoje kolioine zunanje vodne faze da emulzijo V/O/V2. Po ekstrakciji organskega topila nastanejo nanodelci (A). Pri injiciranju raztopine polimera v organski fazi v vodno fazo s proteinom, se zgodi nanoprecipitacija. Po odparitvi organskega topila se tvorijo nanodelci (B). Figure 1: Encapsulation of protein drug in nanoparticles by double-emulsion method (A) and nanoprecipitation (B). Sonication of polymer dissolved in organic phase in the presence of an aqueous protein solution leads to the formation of a W/O emulsion. Sonication of the W/O emulsion in the presence of outer aqueous phase gives a W/O/W2 emulsion. Nanoparticles arise after extraction of a liquid organic phase (A). When the solution of polymer in organic phase is injected into an aqueous solution with protein, the nanoprecipitation takes place after the solvent evaporation. The nanoparticles are formed after the solvent evaporation (B). Ena najobetavnejoih aplikacij nanodelcev je ciljana dostava peptidnih in proteinskih uoinkovin (9). Zaradi njihove hidrofilne narave je obioajna metoda priprave dvojna emulzijska metoda (10) ali nanoprecipitacija (slika 1). 2.2 Izdelava tarono specifionih nanodelcev Najveoja prednost nanodelcev kot dostavnih sistemov je, da jih lahko konjugiramo s specifionimi ligandi in doseaemo tarono ciljanje. Tarono specifione nanodelce lahko naredimo iz biopolimerov, na primer aelatine ali serumskega albumina (11), pegiliranih PLGA kopolimerov z vgrajenimi reaktivnimi funkcionalnimi skupinami. Nedavno so sintetizirali otevilne kopolimere z uvedbo biotina (12), reaktivnimi amino (13) ter sulfhidrilnimi skupinami (14), ki jih lahko uporabimo za pritrditev proteinskih uoinkovin v nedenaturirajooih pogojih (slika 2). farm vestn 2007; 58 Nanodelci: sodobni dostavni sistem za uoinkovine in antigene celicam imunskega sistema Slika 2: Struktura PEG-PLA kopolimera s funkcionalnimi skupinami. A-Biotin-PEG-PLA; B-maleinimido propionat PEG-PLA; C-maleinimid-PEG-PLA; D-sukcinimidil tartrat PEG-PLA; E-sukcinimidil sukcinat; F-aldehid-PEG-PLA. Figure 2: Structure of functionalized PEG-PLA. A-Biotin-PEG-PLA; B-maleinimido propionate; C-maleimide-PEG-PLA; D-succinimidyl tartrate PEG-PLA; E- succinimidyl succinate PEG-PLA; F-aldehyde-PEG-PLA Interakcija biotin-avidin je izredno moona (KD = 10-15 M) in zelo primerna za povezavo nanodelcev z biotiniliranimi protitelesi preko avidinskega vmesnika (15) oziroma za vezavo konjugatov avidin-protitelo na biotiniliran polimer nanodelcev (slika 3). Slika 3: Priprava imunonanodelcev na osnovi interakcije biotin-avidin. Figure 3: Manufacturing of immunonanoparticles via interaction biotin-avidin. 3 celic z nanodelci e imunskih 3.1 Specifiono ciljanje makrofagov z nanodelci Makrofagi so imunske celice, ki sluaijo prepoznavanju in odstranjevanju spremenjenih in starajooih celic, delcev ter invazivnih mikrobov in so sposobni endocitoze makromolekulskih ligandov preko otevilnih specializiranih receptorjev na plazemski membrani (16). Ciljana dostava uoinkovin makrofagom je zlasti pomembna v primeru infekcijskih bolezni, pri katerih makrofagi sluaijo kot mesto proliferacije znotrajcelionih mikrobov (npr. pri tuberkulozi, brucelozi, legionarski bolezni, listeriozi, salmonelozi) (17). Veoji vnos uoinkovin v makrofage doseaemo z vgrajevanjem uoinkovine v nanodelce, ki jih makrofagi fagocitirajo, kar znatno poveoa uoinkovitost delovanja. Tako so pri vezavi uoinkovin amfotericina B, primakina ter tudi pentamidina na nanodelce dosegli veojo uoinkovitost proti znotrajcelionemu patogenu Leishmania donovani in manjoo toksionost v celionih kulturah, kot v primeru raztopine (18, 19). Prednost ciljanega vnosa uoinkovin z nanodelci je zlasti posledica selektivnega celionega privzema in doseganja viojih koncentracij uoinkovin v makrofagih (20). Vlogo makrofagov so prouoevali v kokulturi makrofagne celione linije J774.A1 in M5076 celic retikularnega sarkoma, ki so ji dodali nanodelce z doksorubicinom (21). Dokazali so, da je citotoksioni uoinek doksorubicina (IC50) 5 krat veoji v kokulturi kot pa na samih celicah retikularnega sarkoma, in sicer tako v prosti obliki, kot vgrajenega v nanodelce. Kljub temu, da je prost ali v nanodelce vgrajen doksorubicin enako uoinkovit v sistemu in vitro, pa ni tudi in vivo, saj vgradnja v nanodelce povzrooi kopioenje v Küpfferjevih celicah in s tem manjoo tkivno distribucijo kot pri prostem doksorubicinu. Makrofagi torej sluaijo kot rezervoar uoinkovine po fagocitozi nanodelcev. Hkrati nanodelci povzrooijo aktivacijo makrofagov, respiratorni izbruh ter sproooanje citotoksionih dejavnikov iz makrofagov, kar uoinkuje sinergistiono doksorubicinu (21). Pomembna terapevtska taroa so tudi monociti in makrofagi v aterosklerotionih lezijah. Ko prepoznajo pookodbo, se aktivirajo in izraaajo specifione celione adhezijske molekule, ki omogooajo migracijo v intimo aile, kjer izlooajo vnetne citokine, kemokine in metaloproteaze matriksa, ki poslaboajo te lezije. Nanodelci predstavljajo obetaven pristop za modulacijo teh vnetnih procesov z dostavo anti-proliferativnih ter anti-remodelirajooih uoinkovin na mesto vnetja. Z vgradnjo paklitaksela, moone anti-neoplastione uoinkovine v albuminske nanodelce, so dosegli zmanjoanje rasti neointime po intravenski aplikaciji v kunce (22). Makrofagi v centralnem aivonem sistemu povzrooajo nevroinflamatorne bolezni in so pomembna taroa zlasti pri zdravljenju multiple skleroze (MS), vnetne bolezeni centralnega aivoevja. Pri eksperimentalnem alergijskem encefalomielitisu, ki sluai kot aivalski model MS, so pri podganah z odstranitvijo makrofagov uspeli prepreoiti kliniono manifestacijo bolezni (23). Znano je, da pri MS poveoana prehodnost hematoencefalne membrane omogooa prehod nanodelcev in so zato obetaven dostavni sistem za zdravljenje tovrstnih nevrolookih motenj v prihodnosti. Po endocitozi nanodelcev v makrofage, se le-ti prenesejo v lizosome, kjer se razgradijo in sprostijo uoinkovino. Da bi se izognili razgradnji uoinkovine v kislem okolju lizosoma so razvili nove strategije za dostavo uoinkovine v citoplazmo. Za destabilizacijo lizosomske membrane dodajajo v nanodelce kationske povroinsko aktivne snovi. Drugaoen pristop izkoriooa polimere s sposobnostjo ohranjanja pH vrednosti med 7.2 in 5.0, kot so polietilenimini (PEI) in imidazol- farm vestn 2007; 58 41 Pregledni olanki - Review Articles vsebujooi polimeri, ki lahko pufrajo endosom in potencialno inducirajo njegovo predrtje (24). Klasioni primer citoplazemske dostave je tudi uporaba pH oboutljivih polimerov. Le-ti ostanejo nespremenjeni pri nevtralnem in bazionem pH, v kislem okolju pa se razgradijo in destabilizirajo membrano lizosoma. Pri tem sprostijo svojo vsebino sprva v lizosom in nato v citoplazmo. Koncept citoplazemske dostave so izpopolnili s koenkapsulacijo listeriolizina O, ki permeabilizira membrano fagosoma za prehod nosilca. 3.2 Specifiono ciljanje limfocitov z nanodelci Limfociti so pomembne taroe za ciljano zdravljenje, zlasti v primeru njihove hiperproliferacije, ki je opazna pri avtoimunskih obolenjih, zavraoanju presadkov in levkemijah. Imunoterapija, ki jo omogooajo specifiona monoklonska protitelesa, usmerjena proti antigenskim oznaoevalcem na limfocitih, zagotavlja specifiono imunosupresijo in se uveljavlja kot obetavna alternativa klasionim uoinkovinam v hematologiji in onkologiji. Za zelo uoinkovito se je izkazala vgradnja citotoksionih uoinkovin v ogrodje nanodelcev z vezanimi protitelesi proti antigenom limfocitov. Prednost takonega pristopa predstavlja kombinacija specifionosti ter Leto odobritve Monoklonsko protitelo (zdravilo) Taroa zdravila Vrsta Indikacije 1986 Muromonab (Orthoclone OKT3®) CD3 na membrani limfocitov T mioje IgG2a zavrnitev presajenih organov 1997 Daclizumab (Zenepax®) receptor za IL-2 na aktiviranih limfocitih T (CD25) humanizirano IgG1 zavrnitev presajenih ledvic 1998 Rituksimab (Rituxan®) CD20 na membrani limfocitov B himerno IgG1 ne-Hodgkinov limfom 1998 Baziliksimab (Simulect®) receptor za IL-2 na aktiviranih limfocitih T (CD25) himerno IgG1 zavrnitev presajenih ledvic 2000 Gemtuzumab (Mylotarg®) CD33 na levkemijskih celicah humanizirano IgG4-toksin konjugat akutna mieloidna levkemija 2001 Alemtuzumab (MabCampath®) CD52 na limfocitih T in B humanizirano IgG1 kroniona limfocit-na levkemija 2002 90Y-ibritumomab (Zevalin®) CD20 na membrani limfocitov B mioje IgG1-radionuklid konjugat ne-Hodgkinov limfom 2003 131I-tositumimab (Bexxar®) CD20 na membrani limfocitov B mioje IgG1-radionuklid konjugat ne-Hodgkinov limfom 2003 Efalizumab (Raptiva®) LFA-1 antigen na levkocitih Humanizirano IgG terapija psoriaze 2004 Natalizumab (Tysabri®) a4 podenota a4b1 in a4b7 integrinov humanizirano IgG4 multipla skleroza 2005 / / / / Preglednica 1: Monoklonska protitelesa, usmerjena proti imunskim celicam, registrirana kot uoinkovine za kliniono uporabo pri Evropski agenciji za zdravila (EMEA). Table 1: Monoclonal antibodies against immune cells, approved by European Agency for the Evaluation of Medicinal Products (EMEA). znatno veoje dostave. Za ciljano dostavo uoinkovin limfocitnim celicam je bistvena izbira taronega antigena na limfocitih. Med monoklonskimi protitelesi, ki jih je Evropska agencija za zdravila odobrila za uporabo v terapevtske namene kot samostojne uoinkovine ali v obliki konjugatov s toksini, kemoterapevtiki ali radionuklidi, jih je 10 usmerjenih proti antigenom limfocitnih celic (Preglednica 1). Monoklonska protitelesa za ciljanje limfocitov Muromonab-CD3 se uporablja v terapiji za prepreoevanje zavrnitve presadkov. Humanizirano anti-CD3 monoklonsko protitelo (HuM291) je usmerjeno proti invariantni e verigi T celionega receptorja CD3 in inducira apoptozo selektivno v aktiviranih T limfocitih. Je v fazi klinionih testiranj za terapijo CD3+ T-celionih limfomov (25). Dokazali so, da vezava nanodelcev s pritrjenimi protitelesi proti CD3 antigenu na limfocitih T sproai tudi receptorsko posredovano endocitozo. V primeru, da je v nanodelcih vgrajena citotoksiona uoinkovina, imajo nanodelci, oznaoeni z anti-CD3 protitelesi, sinergistioni uoinek (15). Pri ne-Hodgkinovem limfomu je taroni antigen CD20, ki se nahaja na limfocitih B. CD20 je hidrofoben transmembranski protein, odgovoren za zaoetno aktivacijo celionega ciklusa ter celione diferenciacije. Antigen najdemo na povroini rakavih celic pri veo kot 90% celic B ne-Hodgkinovih limfomov. Po vezavi rituksimaba se preko Fc regije protitelesa aktivira imunski odgovor. Predpostavljen mehanizem delovanja je vezava komplementa s poslediono lizo celice (CDC, cell dependent cytotoxicity), ali pa pride do vezave Fc regije na receptor (FcR), ki se nahaja na celicah naravne imunosti in sledi odstranitev celice z aktivacijo celionih efektorskih sistemov (ADCC, antibody dependent cell cytotoxicity). V in vitro poskusih so tudi nakazali moanost, da vezava protiteles na CD20 sproai apoptotiono smrt celice. Na ta naoin je povzrooena smrt rakavih celic limfoma, vendar pa tudi normalnih limfocitov B. Beta sevanje 90Y-ibritumomaba in 131I-tositumimaba pa hkrati povzrooi pookodbe celic s tvorbo prostih radikalov v taronih in sosednjih celicah. Patentirali so radioimunoterapijo ne-Hodgkinovega limfoma, ki temelji na uporabi radionuklidnih nanodelcev, oznaoenih z monoklonskimi protitelesi. Osnovna strategija tovrstnega pristopa je poveoana dostava in kopioenje radionuklida na taronem mestu, kjer povzrooi terapevtsko sevanje. Gemtuzumab je protitelo proti CD33 antigenu in je povezan z molekulami kaliheamicina preko bifunkcionalnega povezovalca. Pri vezavi protitelesa na antigen se tvori kompleks, ki se internalizira, nato pa se v lizosomih mieloidne celice sprosti kaliheamicin, ki se veae na DNA v podrooju malega aleba. Posledica vezave je prekinitev dvojne vijaonice DNA in smrt celice. Vgradnja kaliheamicina v nanodelce, ki bi bili oznaoeni z anti-CD33 protitelesi bi poveoala citotoksioni uoinek, saj bi v nanodelce lahko vgradili znatno veo kaliheamicina napram 4-6 molekulam, ki se veaejo na eno molekulo protitelesa. 3.3 Dostava antigenov dendritionim celicam z nanodelci Dendritione celice so celice imunskega sistema v tkivih in so profesionalne APC, sposobne stimulacije naivnih T limfocitov pri primarnem imunskem odzivu. So moonejoe APC kot monociti in makrofagi ali limfociti B. To imunostimulatorno kapaciteto gre pripisati visoki ravni izraaanja MHC in kostimulatornih molekul (CD40, CD80 in farm vestn 2007; 58 Nanodelci: sodobni dostavni sistem za uoinkovine in antigene celicam imunskega sistema CD86), kot tudi njihovi sposobnosti produkcije citokinov IL-12 in IFN-a. Zatorej je sploono mnenje, da je tarono ciljanje dendritionih celic bistveno za razvoj uspeonega imunskega odgovora. Dendritione celice privzamejo raztopino proteinov, peptidov, celionih lizatov ter RNA in DNA, z namenom indukcije antigen-specifionega imunskega odziva, saj te spojine same ne zmorejo inducirati moonega in oirokega imunskega odziva, pao pa se morajo v APC razgraditi v imunogene peptide. Proteinske uoinkovine obioajno sproaijo mooan humoralni imunski odziv, vendar oibak T celioni citotoksioni odziv (CTL). Zatorej je potrebno uveljaviti nove strategije, ki bi izvale mooan celioni in tudi humoralni imunski odziv. Nanodelci so zlasti zanimivi kot stabilni dostavni sistem antigenov (26) za aktivacijo T celiono posredovanega imunskega odziva (27), saj omogooajo tako kontrolirano dostavo, kot tudi zaooito antigena. Lahko uravnavajo posamezne imunske odzive, vljuono s poveoanim odzivom CTL (28). Dendritione celice, stimulirane z nanodelci z majhnimi kolioinami antigena, lahko sproaijo moono T- celiono proliferacijo in indukcijo IFN-g. Sam uoinek nanodelcev na dozorevanje dendritionih celic pa je majhen. Privzem biorazgradljivih PLGA delcev je pri dendritionih celicah skoraj tako uoinkovit kot pri visoko fagocitnih makrofagih in je odvisen od velikosti delcev, funkcionalnih skupin na povroini in zeta potenciala (29). Nezrele dendritione celice moono privzemajo antigen, vendar pa se privzem zmanjoa po dozorevanju in migraciji dendritionih celic v sekundarne limfatione organe. Tako nezrele kot zrele dendritione celice privzemajo uoinkoviteje z antigenom napolnjene nanodelce ter prazne nanodelce, ne pa tudi samih antigenov (slika 4). Eksogeni antigeni vstopijo v celice preko receptorsko posredovane endocitoze ali pinocitoze, nanodelci pa s fagocitozo (30). Slika 4: Fagocitoza PLGA nanodelca (bela puooica) v dendritione celice. SEM posnetki kaaejo dendritiono celico (levo), privzem nanodelca (sredina) in ovijanje membrane okoli delca (desno). Merilo = 1 µm (38). Figure 4: Phagocytosis of PLGA nanoparticle (white arrow) by dendritic cells. Scanning electron microscope photomicrographs show dendritic cell (left), uptake of nanoparticle (middle) and wrapping up of cell membrane (right). Bar = 1 µm (38). Poveoana fagocitoza nanodelcev z antigenom lahko povzrooi preobremenitev endosomov in pride do odpuooanja antigena v citosol, kjer se veae na sintetizirane MHC I molekule in se predstavlja CD8+ citotoksionim T limfocitom (navzkriana predstavitev). Torej lahko dendritione celice predstavljajo proteine, dostavljene z nanodelci preko MHC I in II molekul in sproaijo CD8+ in CD4+ imunski odziv, kar je bistveno pri sproaanju uoinkovitega imunskega sistema pri tumorskih obolenjih in infekcijskih boleznih. V tem pomenu so dendritione celice pomembna taroa za dostavo cepiv z nanodelci, saj uoinkovita dostava bodisi proteinov ali genskega materiala po predstavitvi na MHC molekulah omogooa uoinkovit imunski odziv. Profilaktiono cepivo, ki ga sestavlja neaktivni HIV-1-konkanavalin A, imobiliziran na nanodelcih (HIV-ND), so dali miokam. HIV-ND so fagocitirale dendritione celice v pljuoih in sproaile mooan protitelesni imunski odziv v genitalnem predelu ter specifioni citotoksioni imunski odziv v vranici (31). Dendritione celice vsebujejo otevilne povroinske molekule, ki jih lahko koristimo za ciljano dostavo s tarono specifionimi nanodelci. Znani primeri povroinskih molekul so: CD1a (MHC-II), ki je antigen predstavitvena molekula, CD86, CD80 in CD40 so kostimulatorne molekule, CD83 je oznaoevalec dozorevanja, CCR7 je kemokinski receptor, vkljuoen v transport zrelih dendritionih celic v T celiono podrooje bezgavk. Dodatek nanodelcev tudi spremeni raven izraaanja razlionih povroinskih molekul dendritionih celic, kar dodatno poveoa ciljano dostavo (32). 4 Zakljuoek Tarono specifioni nanodelci so dostavni sistemi izbora za zdravilne uoinkovine in antigene celicam imunskega sistema v primeru otevilnih imunskih pomanjkljivosti, kot so imunska obolenja ter boleznim, kjer je imunski sistem kompromitiran in ne nudi ustreznega odziva, kot so rakava obolenja, virusne infekcije ter infekcije z znotrajcelionimi patogeni. Sproaijo aeljen imunski odziv po predelavi antigena v antigen predstavitvenih celicah. Dostava antigenov APC z nanodelci sproai celovit efektorski imunski odziv, in sicer mooan protitelesni imunski odziv in poveoanje odziva citotoksionih limfocitov proti antigenom, ki so bili vgrajeni v nanodelce. V tem smislu razvijajo nanodelce za vakcine, ki omogooajo znatno vioje odzive, kot jih nudijo trenutno uporabljane adjuvantne spojine (alum, QuilA, monofosforil lipid A). Glede na nastajanje protiteles so odzivi primerljivi imunizaciji s kompletnim Freundovim adjuvansom in pri CD8+ celionem odzivu primerljivi ex vivo pulzirajooi imunizaciji dendritionih celic. Po drugi strani pa tolerogene dendritione celice sproaijo odziv regulatornih T limfocitov ter imunske tolerance in so terapevtska taroa v primeru avtoimunih obolenj ter pri zavraoanju presadkov. V primeru zdravljenja prekomernega celionega ali humoralnega imunskega odziva (avtoimunska obolenja ali zavraoanje presajenih organov) pa so zlasti limfociti primerna taroa za nanodelce. Na podlagi specifionih limfocitnih povroinskih molekul lahko doseaemo ciljano dostavo kljub neenakomerni porazdelitvi teh celic v organizmu, vgradnja uoinkovin v nanodelce pa omogooa dostavo veojih kolioin uoinkovine in s tem moonejoi terapevtski odziv. Prihodnost tega izredno hitro razvijajooega podrooja obeta izboljoanje nanodelcev kot nosilnih sistemov. Razen vloge nosilca lahko dosegajo tudi ciljanje dolooenih tkiv, celic in organel. Uporaba polimernih nanodelcev kot nosilcev uoinkovin je ae dobro raziskana. Razvoj nanodelcev za ciljano dostavo uoinkovine s pomoojo vezanih ligandov, je v teku. Preuoevanje nanodelcev, ki bi dosegali tako farm vestn 2007; 58 Pregledni olanki - Review Articles dostavo uoinkovine, ciljanje, kot tudi diagnostioni ali terapevtski odziv, pa je oele na zasnovnem nivoju, vendar obstaja velika verjetnost za njihov uspeoen razvoj in uporabo. Literatura 1. Pardoll DM. Spinning molecular immunology into successful immunotherapy. Nat Rev Immunol 2002, 2: 227-238. 2. Ochseinbein AF. Principles of tumor Immunosurveillance and implications for immunotherapy. Cancer Gene Ther 2002, 124: 12398-12399. 3. Cegnar M, Kristl J, Kos J. Oblikovanje nanodelcev s proteini. Farm Vest 2003, 54: 37-46. 4. Kreuter J. Evaluation of nanoparticles as drug-delivery systems. I. Preparation methods. Pharm Acta Helv 1983, 58: 196-209. 5. Li JK, Wang N, Wu XS. A novel biodegradable system based on gelatin nanoparticles and poly(lactic-co-glycolic acid) microspheres for protein and peptide drug delivery. J Pharm Sci 1997, 86: 891-5. 6. Jelinkova M, Strohalm J, Plocova D, Subr V, Stasny M, Ulbrich K, Richova B. Targeting of human and mouse T-lymphocytes by monoclonal antibody-hpma copolymer-doxorubicin conjugates directed against different T-cell surface antigens. J Control Release 1998, 52: 253-70. 7. Maeda H, Wu J, Sawa T, Matsumura Y, Hori K. Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review. J Conrol Release 2000, 65: 271-84. 8. Govender T, Riley T, Ehtezazi T, Garnett MC, Stolnik S, Illum L, Davis SS. Defining the drug incorporation properties of PLA-PEG nanoparticles. Int J Pharm 2000, 199: 95-110. 9. Cegnar M, Kos J, Kristl J. Cystatin incorporated in poly-(lactide-co-glycolide) nanoparticles: development and fundamental studies on preservation of its activity. Eur J Pharm Sci 2004, 22: 357-364. 10. Li Y, Pei Y, Zhang X, Gu Z, Zhou Z, Yuan W et al. PEGylated PLGA nanoparticles as protein carriers: synthesis, preparation and biodistribution in rats. J Control Release 2001, 71: 203-211. 11. Weber C, Reiss S, Langer K. Preparation of surface modified protein nanoparticles by introduction of sulfhydryl groups. Int J Pharm 2000, 211: 67-78. 12. Salem AK, Cannizzaro SM, Davies MC, Tendler SJ, Roberts CJ, Williams PM, et al. Synthesis and characterisation of a degradable poly(lactic acid)-poly(ethylene glycol) copolymer with biotinylated end groups. Biomacromolecules 2001, 2: 575-580. 13. Tessmar J, Mikos A, Gopferich A. Amine-reactive biodegradable diblock copolymers. Biomacromolecules 2002, 3: 194-200. 14. Olivier JC, Huertas R, Lee HJ, Calon F, Pardridge WM. Synthesis of pegylated immunonanoparticles. Pharm Res 2002, 19: 1137-1143. 15. Dinauer N, Balthasar S, Weber C, Kreuter J, Langer K, von Briesen H. Selective targeting of antibody-conjugated nanoparticles to leukemic cells and primary T-lymphocytes. 2005, 26: 5898-5906. 16. Gordon S. The macrophage. Bioessays 1995, 17: 977-986. 17. Poznansky M, Juliano RL. Biological approaches to the controlled delivery of drugs: a critical review. Pharmacol Rev 1984, 26: 277-336. 18. Espuelas MS, Legrand P, Loiseau PM, Bories C, Barratt G, Irache JM. In vitro antileishmanial activity of amphotericin B loaded in poly(epsilon-caprolactone) nanospheres. J Drug Target 2002, 10: 593-599. 19. Deniau M, Durand R, Bories C, Paul M, Astier A, Couvreur P, Houin R. In vitro study of leichmanicidal agents with drug carriers. Ann Parasitol Hum Comp 1993, 68: 34-37. 20. Alving CR. Macrophages as targets for delivery of liposomes encapsulated antimicrobial agents. Adv Drug Del Rev 1988, 2: 107-28. 21. Soma CE, Dubernet C, Barratt G, Benita S, Couvreur P. Investigation of the role of macrophages on the cytotoxicity of doxorubicin-loaded nanoparticles on M5076 cells in vitro. J Control Release 2000, 68: 283-289. 22. Kolodgie FD, John M, Khurana C, Farb A, Wilson PS, Acampado E, Desai N, Soon-Shiong P, Virmani R. Sustained reduction of in-stent neointimal growth with the use of a novel systemic nanoparticle paclitaxel. Circulation 2002, 106: 1195-1198. 23. Huitinga I, van Rooijen N, de Groot CJA, Uitdehaag BMJ, Dijkstra CD. Suppression of experimental allergic encephalomyelitis in Lewis rats after elimination of macrophages. J Exp Med 1990, 172: 1025-33. 24. Pack DW, Putnam D, Langer R. Design of imidazole-containing endosomolytic biopolimers for gene delivery. Biotechnol Bioeng 2000, 67: 217-23. 25. Waldmann TA, Levy R, Coller BS. Emerging therapies: specturm of applications of monoclonal antibody therapy. Hematology (Am Soc Hematol Educ Program) 2000, 394-408. 26. Raychaudhuri S, Rock KL. Fully mobilizing host defense: building better vaccines. Nat Biotechnol 1998, 16: 1025-31. 27. Wang X, Uto T, Sato K, Ide K, Agaki T, Okamoto M, Kaneko T, Akashi M, Baba M. Potent activation of antigen-specific T-cells by antigen loaded nanoparticles. Immunol Lett 2005, 98:123-130. 28. Banchereau J, Briere F, Caux C, Davoust J, Lebecque S, Liu YJ, Palendran B, Palucka K. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol 2000, 18: 767-811. 29. Thiele L, Rothen-Rutishauser B, Jilek S, Wunderli-Allenspach H, Merckle HP, Walter E. Evaluation of particle uptake in human blood monocyte-derived cells in vitro. Does Phagocytosis activity of dendritic cells measure up with macrophages? J Control Release 2001, 76: 59-71. 30. Lutsiak ME, Robinson DR, Coester C, Kwon GS, Samuel J. Analysis of poly(DL-lactic-co-glycolic acid) nanosphere uptake by human dendritic cells and macrophages in vitro. Pharm Res 2002, 19: 1480-7. 31. Kawamura M, Wang X, Uto T, Sato K, Ueno M, Akagi K, Hiraishi K, Matsuyama T, Akashi M, Baba M. Induction of dendritic cell-mediated immune responses against HIV-1 by antigen-capturing nanospheres in mice. J Med Virol 2005, 76: 7-15. 32. Diwan M, Elamanchili P, Lane H, Gainer A, Samuel J. Biodegradable nanoparticle mediated antigen delivery to human blood derived dendritic cells for induction of primary T cell responses. J Drug Targeting 2003, 11: 495-507. farm vestn 2007; 58