Originalni znanstveni œlanki - Scientific Articles Genetika laktozne intolerance odraslih in pogostost polimorfizma -13910C>T v slovenski populaciji Genetics of adult-type lactose intolerance and frequency of -13910C>T polymorphism in Slovenian population Nataĝa Karas Kuĉeliœki, Jana Lukaœ-Bajalo POVZETEK: Encim laktaza (EC 3.2.1.23) hidrolizira disaharid laktozo do galaktoze in glukoze. Normalno je aktivnost laktaze v otroĝtvu visoka, pri veœini odraslih pa moœno upade. Vendar pa nekatere osebe ohranijo visoko aktivnost laktaze tudi v odrasli dobi. Leta 2002 so odkrili polimor-fizem -13910C>T, ki se 100-odstotno ujema z visoko aktivnostjo laktaze v odrasli dobi. CC homozigoti imajo nizko, TT homozigoti in TC het-erozigoti pa visoko aktivnost laktaze v odrasli dobi. V slovenski populaciji ima 39 % oseb genotip CC, 61 % pa genotip CT ali TT. Najveœ je oseb z genotipom CT (51 %), najmanj pa homozigotnih TT oseb (10 %). Ujemanje med genotipom CC in znaki laktozne intolerance ni popolno. Pogostost znakov pri osebah z genotipom CC s starostjo naraĝœa. Kljuœne besede: laktoza, laktaza, laktozna intoleranca odraslih ABSTRACT: Enzyme lactose (EC 3.2.1.23) hydrolyzes disaccharide lactose to galactose and glucose. Neonatally, lactase activity is high, but drastically decreases in most adults. However, some adults maintain high lactase activity. In 2002 -13910C>T polymorphism was discovered, which correlates well to high lactase activity in adults. CC homozygotes have low, while TT homozygotes and CT heterozygotes have high lac-tase activity in adulthood. In Slovenian population there are 39 % of CC homozygotes and 61 % of CT heterozygotes and TT homozygotes. The most frequent is CT (51 %) and the least frequent is TT genotype (10 %). Correlation between CC genotype and symptoms of lactose intolerance is only partial. Incidence of symptoms in CC genotype persons increases with age. Key words: lactose, lactase, adult-type lactose intolerance 1 Uvod 1.1 Aktivnost encima laktaze je odvisna od starosti Laktaza (EC 3.2.1.23) oz. s polnim imenom laktaza–florizin hidrolaza (LPH) (EC 3.2.1.23, 3.2.1.62) je encim, ki hidrolizira dve vrsti disahari-dov. Disaharid laktozo hidrolizira v galaktozo in glukozo (b-galaktozi-dazna aktivnost), disaharid florizin pa v glukozo in floretin (b-glukozi-dazna aktivnost) (1, 2). Encim se pojavlja samo pri sesalcih, ne pa pri drugih vretenœarjih, saj je mleko, ki vsebuje velike koliœine laktoze, v obdobju po rojstvu pri sesalcih edini vir energije. Normalno imajo sesalci v otroĝtvu visoko aktivnost laktaze, ki pa pri odraslih sesalcih moœno upade. Ta obrazec velja tudi za veœino ljudi, vendar pa nekatere osebe ohranijo visoko aktivnost laktaze tudi v odrasli dobi. Velik deleĉ takih oseb so opazili v populacijah, ki se intenzivno ukvarjajo z ĉivinorejo (Severna Evropa, Subsaharska Afrika) in je bila sposobnost prebavljanja mleka v odrasli dobi kljuœnega pomena za preĉivetje v obdobjih pomanjkanja drugih virov hrane (1, 2). Predvidevajo, da je do moœnega pozitivnega izbora priĝlo pred 5.000 do 10.000 leti (2, 3). Izraz laktozna intoleranca se uporablja za normalno zniĉanje laktazne aktivnosti pri odraslih, kar pa ni vzrokoslovno pravilno, saj gre za popolnoma normalno in celo prevladujoœe stanje v globalni œloveĝki populaciji. Bolj primerna bi bila uporaba izraza lak-tozna persistenca za oznako ohranitve visoke laktazne aktivnosti v odrasli dobi, saj le-to stanje nastane z mutacijo v normalnem genotipu. Kljub temu se danes ponavadi uporablja izraz laktozna intoleranca, ker so se raziskave laktaze zaœele v severni Evropi, kjer prevladuje visoka aktivnost laktaze pri odraslih (4). dr. Nataĝa Karas Kuĉeliœki, mag. farm., prof. dr. Jana Lukaœ Bajalo, univ. dipl. kem.; Fakulteta za farmacijo, Aĝkerœeva 7, 1000 Ljubljana farm vestn 2005; 56 1 Originalni znanstveni œlanki - Scientific Articles Dolgo ni bilo jasno, kaj povzroœi zniĉanje laktazne aktivnosti pri odraslih. Ĝtudije leta 1966 in 1967 so pokazale, da je aktivnost encima odvisna izkljuœno od regulacije na genskem nivoju in da ni povezana s koliœino zauĉite laktoze (4, 5). Vendar pa na izraĉanje znakov laktozne intolerance lahko vplivajo tudi dejavniki okolja, kot so œrevesna flora posameznika, hormoni (tiroksin, kortizon), koliœina zauĉite laktoze in subjektivno doĉivljanje znakov (5). Leta 1985 so dokazali, da pride do zniĉanja encimske aktivnosti pri odraslih zaradi zmanjĝanja sinteze lak-taze (4). V devetdesetih letih pa so dokazali, da je sinteza laktaze zmanjĝana zaradi zmanjĝane transkripcije gena za laktazo (4, 6). Ugotovili so tudi, da HNF-1 (hepatocyte nuclear factor 1) stimulira transkripcijo gena za laktazo (7, 8). Pri praĝiœih se vezalno mesto HNF-1 nahaja v promotorski regiji gena LPH, pri œloveku pa vezalnega mesta ĝe niso naĝli. Predvidevajo, da bi se lahko nahajalo ĝe bolj navzgor od promotorske regije gena LPH (9). S HNF-1 sproĉeno transkripcijo stimulira produkt gena HOXC11 (Homeo Box C11) (10). Ta gen je œlan druĉine HOX genov, ki poleg SOX in PAX genov spadajo med razvojne gene. Ti geni se moœno izraĉajo v fetalnem razvoju in usmerjajo razvoj osebka. HOXC11 se izraĉa v tankem œrevesu, ledvicah in skeletnih miĝicah. Njegovo izraĉanje je najveœje v fetalnem tkivu (11). 1.2 Laktozna intoleranca odraslih Laktozna intoleranca odraslih je normalno zniĉanje aktivnosti laktaze v odrasli dobi na 5-10 % encimske aktivnosti v otroĝtvu. Znaki vkljuœu-jejo drisko, boleœine v trebuhu, napenjanje in slabost po zauĉitju veœjih koliœin mleka. Do driske pride zaradi zastajanja nerazgrajene laktoze v œrevesu. Laktoza zaradi svojega osmotskega uœinka povzroœi zadrĉevanje vode v œrevesu, kar ima za posledico tekoœe blato. Znaki se pojavijo v razliœnih populacijah pri razliœnih starostih, velike pa so tudi razlike med posamezniki. Tako se pri Afriœanih in Azijcih znaki pojavijo ĉe zgodaj v otroĝtvu (2-7 let), medtem ko se pri belcih ponavadi pojavijo v adolescenci. Pogostost laktozne intolerance je najviĝja v Aziji, kjer doseĉe skoraj 100 %. Visoka je tudi pri veœini Afriœanov (50-80 %), izjema so nekatera ĉivinorejska plemena v subsaharski Afriki. V Evropi niha pogostost od 2-5 % v Skandinaviji, do 70 % v juĉni Evropi. Veœina laktozno intolerantnih oseb doĉivi znake po zauĉitju 50 ali veœ gramov laktoze, vendar pa so pri nekaterih znaki odsotni tudi po zauĉitju zelo velikih koliœin laktoze. Vzrok za to je zaenkrat ĝe neznan. Osebe z laktozno intoleranco lahko brez teĉav uĉivajo jogurt, kjer je laktoza ĉe delno razgrajena s strani bakterijskih kultur. Tudi mleko z veœ maĝœobe naj bi povzroœalo manj teĉav kot manj mastno mleko. Vzrok za to je daljĝe zadrĉevanje mastnega mleka v prebavnem traktu. Prebava mleka pri laktozno intoler-antnih osebah se izboljĝa tudi, œe mleko zauĉijejo ob prisotnosti kakava ali trdne hrane, ki vsebuje veliko vlaknin (12). 1.3 Genetika laktozne intolerance odraslih Genetika laktozne intolerance oz. laktazne persistence je dokaj zapletena, saj ĝe vedno niso odkrili definitivne mutacije, ki je odgovorna za to stanje. Predvsem v zadnjih 2 letih pa je na tem podroœju priĝlo do znatnega napredka. Leta 1995 so v ĝtudiji Harvey et al. (13) odkrili 7 polimorfizmov v genu za laktazo ali v njegovi neposredni bliĉini, ki so kazali povezanost z visoko oz. nizko aktivnostjo laktaze pri odraslih. Ugotovili so, da se ti polimorfizmi vedno dedujejo skupaj oz. vezano, kar je pripeljalo do tvorbe sistema laktaznih haplotipov. V razliœnih kombinacijah so ti polimorfizmi tvorili 42 razliœnih haplotipov. Konœni sistem haplotipov je postavil Hollox s sodelavci leta 2001 (14). Ugotovili so, da laktazni haplotip sestavlja 11 polimorfizmov, ki se nahajajo v genu LPH ali v njegovi neposredni bliĉini. Veœinoma gre za substitucije enega baznega para z drugim, nekaj pa je delecij/insercij enega ali veœ baznih parov. Razliœne kombinacije teh 11 polimorfizmov tvorijo 42 haplotiov: A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L, M, N, O, P, Q, R, S, T, U, V, W, X, Y, Z, a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m, n, o in p. Najpogostejĝi haplotipi so A, B, C in U, ki so prisotni pri 45 %, 18 %, 15 % in 5 % svetovne populacije. Ostali haplotipi so zelo redki in imajo pogostost 2 % ali manj. Haplotip k so naĝli pri ĝimpanzih in naj bi bil izvirni haplotip iz katerega so z mutacijami in rekombinacijami nastali vsi ostali haplotipi. Preglednica 1 prikazuje sestavo 4 najpogostejĝih haplotipov A, B, C in U. Haplotip A je povezan s persistenco laktaze v odrasli dobi, vendar samo pri Evropejcih in ne pri Afriœanih in Azijcih (14). Haplotipi se razliœno porazdeljujejo pri razliœnih rasah in narodih (glej preglednico 2) (14). Preglednica 1: Sestava najpogostejĝih haplotipov A, B, C in U Table 1: The makeup of the most widespread haplotypes A, B, C and U C -985 T GG D A -946 C -942 TC -942/3 DD G -875 A A -678 G A8 -552/ -559 A9 C 485 int T G 666 A T 5579 C TG 6236/7 DD C A CT TC A A9 C GC TG TC A A8 C A T DD C A CT TC G A8 C GT TG C A C DD G A A9 CA TG 184 farm vestn 2005; 56 Genetika laktozne intolerance odraslih in pogostost polimorfizma -13910C>T v slovenski populaciji Haplotip Severna Juĉna Indija Evropa Evropa A 86 % 36 % 44 % B 6 % 32 % 22 % C 3 % 12 % 23 % U 0 % 0 %0 % persistenca 75 % 26 % 48 % laktaze Rusija Kitajska Japonska Bantu (Afrika) 44 % 47 % 37 % 10 % 21 % 10 % 10 % 0 % 15 % 9 % 15 % 31 % 1 % 17 % 24 % 7 % 37 % 6 % 10 % 13 % Preglednica 2: Pogostost laktaznih haplotipov v razliœnih populacijah Table 2: The frequency of lactase haplotypes in various populations Haplotip A je najpogostejĝi v severni Evropi in je tudi prevladujoœ hap-lotip v tej populaciji, kar se ujema z velikim deleĉem laktazno persis-tentnih oseb v tem delu sveta. V juĉni Evropi je haplotip A manj pogost, veœ pa je haplotipov B in C. To se ujema z veliko niĉjim odstotkom oseb z visoko aktivnostjo laktaze kot v severni Evropi. Rusija in Indija kaĉeta podobno stanje kot Evropa, kar je razumljivo, saj gre za kavkazijske populacije. Haplotipa U pri kavkazijcih ni, je pa zelo pogost pri Azijcih, ki pa so skoraj 100 % laktozno intolerantni. Populacije v subsaharski Afriki so najbolj haplotipsko heterogene, kar kaĉe na to, da se je Homo Sapiens razvil v Afriki in se od tam v veœ valovih razselil v Evropo in Azijo. Za manjĝo raznolikost haplotipov v neafriĝkih populacijah je torej odgovoren genetski odmik. V severni Evropi pa naj bi z razvojem ĉivinoreje pred 10.000 leti priĝlo do moœne pozitivne selekcije za A haplotip, ki je povezan z laktazno persisten-co. Ker je A haplotip povezan s persistenco samo pri Evropejcih, pomeni, da je mutacija odgovorna za persistenco nastala ĝele po odselitvi H. Sapiens v Evropo. Iz preglednice 2 je tudi razvidno, da je v neevropskih populacijah velik deleĉ oseb z A haplotipom laktozno intolerantnih. Vse to kaĉe na to, da opisani polimorfizmi ne morejo biti vzrok za persistenco laktaze v odrasli dobi, temveœ so samo oznaœeval-ski polimorfizmi, ki se pogosto dedujejo vezano z vzroœno mutacijo (14). Leta 2002 pa so odkrili polimorfizem -13910C>T, ki se 100-odstotno ujema s persistenco laktaze v odrasli dobi. Gre za spremembo C v T na mestu 13910 bp navzgor od iniciacijskega kodona ATG gena za laktazo. Alel C je povezan z nizko, alel T pa z visoko aktivnostjo lak-taze v odrasli dobi. Tako imajo homozigoti CC laktozno intoleranco, homozigoti TT in heterozigoti CT pa laktazno persistenco (15). Homozigoti CC imajo pribliĉno 10 % aktivnosti laktaze homozigotov TT, heterozigoti CT imajo v povpreœju niĉje aktivnosti kot TT, vendar pa se aktivnosti za TT in CT prekrivajo. Aktivnosti laktaze za CC osebe so od 4 do 9 U/g, za CT od 13-49 U/g in za TT 18-87 U/g. Pri het-erozigotih CT se alel T izraĉa 11,5-krat bolj kot alel C in predstavlja 92 % mRNA laktaze (16). Polimorfizem -13910C>T se nahaja v 13. intronu gena MCM6 (Minichromosome maintenence 6), v regiji, ki kaĉe homologijo z LINE (long interspersed nuclear element). MCM6 se nahaja poleg gena LPH, njegov produkt je regulator celiœnega cikla. MCM6 verjetno ni funkcionalno povezan z laktazo, gre le za prekrivanje regulatorne regije gena LPH s koncem transkripcijske regije MCM6 gena (17). -13910C>T vpliva na vezalno mesto transkripcijskega faktorja AP-2. Le-ta verjetno vpliva na razvojno-specifiœno regulacijo laktaze prek cis-transkripci-jskega efekta. Natanœen mehanizem delovanja ĝe ni znan (2). V ĝtudiji Poulter et al. iz leta 2003 (18) so ugotavljali ujemanje polimor-fizma -13910C>T s haplotipi. Ugotovili so, da je pri vseh haplotipih razen A na mestu –13910 vedno prisoten C, kar se ujema z ugotovitvijo, da so vsi haplotipi razen A povezani z laktozno intoleranco. Pri Evropejcih je bil pri haplotipu A na mestu –13910 v veliki veœini primerov prisoten T, kar potrjuje povezanost haplotipa A z laktazno persistenco. Pri ostalih rasah pa je bil v veœjem ĝtevilu primerov na mestu –13910 v haplotipu A prisoten C, kar kaĉe na to, da haplotip A lahko povezujemo z laktazno persistenco samo pri Evropejcih, alel T pa je povezan s persistenco tudi pri drugih rasah (18). Iz tega sklepamo, da je doloœanje polimorfizma -13910C>T boljĝe diagnos-tiœno orodje kot doloœanje haplotipov. Videti je, da je -13910C>T nastal pozneje kot polimorfizmi, ki definirajo haplotip A in je odliœen kandidat za vzroœni polimorfizem za laktazno persistenco. Vendar pa so pred kratkim ugotovili, da navedeni polimorfizem verjetno ni odgovoren za laktazno persistenco v nekaterih ĉivinorejskih plemenih v subsaharski Afriki, saj je v teh populacijah T alel zelo redek in ne more razloĉiti visokega deleĉa laktazno persistentnih oseb (19). Zato bi bilo treba preiskati ĝirĝe obmoœje navzgor od gena LPH. Genotipizacija je najzanesljivejĝi naœin diagnostike laktozne intolerance, saj s to metodo lahko odkrijemo tudi tiste laktozno intolerantne osebe, ki nimajo znakov. Hkrati pa lahko izloœimo osebe z drugimi boleznimi, ki povzroœajo moteno delovanje disaharidaz. S tem prepreœimo nepotrebno umaknitev mleka iz prehrane in omogoœimo zdravljenje morebitnih resnih obolenj. Ker so polimorfizem -13910C>T, ki se pri Evropejcih popolnoma ujema z laktazno persis-tenco odkrili ĝele pred kratkim, pa se genotipizacije ĝe ne uporablja za rutinsko diagnostiko, temveœ samo v raziskovalne namene. Polimorfizem -13910C>T doloœimo s PCR in RFLP, lahko pa uporabimo tudi sekveniranje. V sledeœi ĝtudiji smo prviœ doloœili pogostost laktozne intolerance v slovenski populaciji z metodo genotipizacije. 2 Materiali in metode 2.1 Preiskovanci V raziskavi je sodelovalo 172 zdravih prostovoljcev. Povpreœna starost preiskovancev je bila 32,9 leta ħ 9,6 let. Sestava po spolu je bila: 83 (48 %) ĉensk in 89 (52 %) moĝkih. Vsem preiskovancem je bilo odvzeto dvakrat po 3 ml krvi v sterilne epruvete, ki so vsebovale antikoagulant K-EDTA. Ob odvzemu krvi so preiskovanci izpolnili vpraĝalnik o uĉivanju mleka in mleœnih izdelkov ter o znakih laktozne intolerance. Vsi preiskovanci so podpisali obveĝœeni pristanek. Ĝtudijo je odobrila tudi Medicinska etiœna komisija Slovenije. farm vestn 2005; 56 Originalni znanstveni œlanki - Scientific Articles 2.2 Materiali in metode Za izolacijo DNK iz venske krvi smo uporabili FlexiGene DNA Kit (QIA-GEN). Polimorfizem -13910C>T smo doloœili s polimerazno veriĉno reakcijo (PCR) in z analizo polimorfizmov dolĉin restrikcijskih fragmentov (RFLP). Uspeĝnost PCR in rezultate restrikcije smo ovrednotili z agarozno gelsko elektroforezo. PCR: V reakcijsko zmes za en vzorec s skupnim volumnom 25 µl smo dodali 14,9 µl vode, 2,5 µl 10 x PCR pufra (Perkin Elmer), 2,5 µl 2,5 mM raztopine dNTP (Perkin Elmer), 2 µl 25 mM raztopine MgCl2 (Perkin Elmer), 1 µl 5 µM raztopine F oligonukleotidnega zaœetnika 5`-GGA TGC ACT GCT GTG ATG AG-3`(QIAGEN Operon GmbH), 1 µl 5 µM raztopine R oligonukleotidnega zaœetnika 5`- CCC ACT GAC CTA TCC TCG TG-3`(QIAGEN Operon GmbH), 0,1 µl raztopine DNK polimeraze AmpliTaq GoldTM (5 U/ µl, Perkin Elmer) in 1 µl raztopine DNK. Pogoji PCR so bili: 1 x 95°C 12 minut, 36 x 94°C 30 sekund, 58,5°C 30 sekund in 72°C 1 minuta, 1 x 72°C 7 minut, 1 x 4°C vsaj 6 minut. Produkt PCR je bil 448 baznih parov dolg odsek DNK. RFLP: V reakcijsko zmes za en vzorec s skupnim volumnom 15 µl smo dodali 8,60 µl vode, 1,5 µl restrikcijskega pufra NEBuffer 4 (50 Mm K-acetat, 20 mM Tris acetat, 10 mM Mg-acetat, 1 mM ditiotreitol, pH = 7,9, New England Biolabs), 0,15 µl raztopine acetliranega govejega serumskega albumina (BSA) (100 µg/ml, New England Biolabs), 0,75 µl raztopine restrikcijskega encima Bsm FI (2 U/µl, New England Biolabs) in 4 µl raztopine produkta PCR. Zmes smo inkubirali v vodni kopeli œez noœ na 65°C. Restrikcijski encim Bsm FI selektivno prepozna zaporedje 5`…GGGAC(N)10 …3` v DNK in cepi DNK 10 baznih parov navzdol od prepoznavne sekvence, tako da nastanejo lepljivi konci. Zamenjava nukleotida C z nukleotidom T na mestu -13910 je uvedla novo dodatno mesto delovanja Bsm Fl. Pri agarozni gelski elektroforezi restrikcijskih produktov sta pri homozigotih CC na gelu vidni dve lisi (351 in 97 bp), pri homozigotih TT pa naj bi bile vidne tri lise (253, 98 in 97 bp), vendar se na agarozi odseka 98 in 97 bp vidita kot ena lisa. Heterozigoti CT imajo torej 4 lise (351, 253, 98 in 97 bp), na agarozi pa so vidne 3 (slika 1). Genotip posameznika smo tako doloœili glede na prisotnost oz. odsotnost odsekov 351 bp in 253 bp. Vpraĝalnik: Preiskovanci so izpolnili vpraĝalnik o prisotnosti oz. odsotnosti kliniœnih znakov laktozne intolerance. Poleg tega so opisali pogostost uĉivanja mleka in nekaterih mleœnih izdelkov. Njihove odgovore smo sorazmerno toœkovali, kjer bolj pogostem uĉivanju pripiĝemo veœje ĝtevilo toœk. Podatke smo obdelali s t-testom, upoĝte-vajoœ homogenost oz. nehomogenost variance. farm vestn 2005; 56 3 Rezultati in razprava V skupini zdravih preiskovancev je imelo 39 % oseb genotip CC, ki je povezan z nizko aktivnostjo laktaze v odrasli dobi. 61 % preiskovancev je imelo ohranjeno visoko aktivnost laktaze v odrasli dobi oz. genotip CT ali TT. Najveœ je bilo oseb z genotipom CT (51 %), najmanj pa homozigotnih TT oseb (10 %). Rezultati ĝtudije so prikazani v preglednici 3. Polimorfizem -13910C>T se porazdeljuje po Hardy-Weinbergovem ravnoteĉju, p = 0,699 (c2-test). Preglednica 3: Pogostost genotipov CC, CT in TT , ter alelska frekvenca (AF) alelov C in T v zdravi slovenski populaciji Table 3: The frequency of CC, CT and TT genotypes, and the allelic frequency (AF) of C and T alleles in the healthy Slovenian population Genotip Ĝtevilo oseb n = 172 Odstotek oseb CC 67 39 % CT 87 51 % TT 18 10 % Pogostost posameznih laktaznih genotipov v slovenski populaciji smo primerjali z rezultati drugih podobnih ĝtudij (preglednica 4). Iz preglednice 4 je razvidno, da je deleĉ laktozno intolerantnih oseb v slovenski populaciji viĝji kot v nekaterih severno in zahodno evropskih populacijah (Finska, Nemœija) ter niĉji kot v populacijah afriĝkega izvora. Zelo nizek deleĉ laktozno intolerantnih oseb so ugotovili pri belcih iz ameriĝke zvezne drĉave Utah, kjer je veœina prebivalcev skandinavskega izvora. Porazdelitev genotipov v slovenski populaciji je najbolj podobna porazdelitvi v finski in nemĝki populaciji, kjer prav tako prevladuje genotip CT, vendar je v slovenski populaciji CC genotip veliko bolj pogost kot genotip TT, v finski in nemĝki populaciji pa je ravno obratno. Deleĉ oseb z visoko laktazno aktivnostjo (61 %) je v slovenski populaciji niĉji kot v severni Evropi (75 %), vendar viĝji kot v juĉni Evropi (26 %) (14). Videti je, da je slovenska populacija po deleĉu oseb z visoko laktazno aktivnostjo bliĉje severni kot juĉni Evropi. Odgovore preiskovancev o prisotnosti znakov laktozne intolerance smo primerjali z njihovim dejanskim LPH genotipom. Znaki so bili prisotni pri 10 % vseh preiskovancev. Od oseb, ki so trdile, da imajo znake laktozne intolerance, jih je dejansko imelo genotip CC le 63 %, Slika 1: Agarozna gelska elektroforeza produktov RFLP pri doloœanju polimorfizma -13910C>T; Okrajĝave: M = oznaœevalec, PCR = nere-stringiran produkt PCR, 88ko, 91ko, 95ko = homozigoti CC, 87ko, 89ko, 90ko, 92ko, 93ko, 94ko, 96ko, 97ko, 98ko = heterozigoti CT, 99ko = homozigot TT. Figure 1: Determination of 13910C>T polymorphism by RFLP and agarose gel electrophoresis; Abbreviations: M = marker, PCR = uncut PCR product, 88ko, 91ko, 95ko = CC homozygotes, 87ko, 89ko, 90ko, 92ko, 93ko, 94ko, 96ko, 97ko, 98ko = CT heterozygotes, 99ko = TT homozygote.. Genetika laktozne intolerance odraslih in pogostost polimorfizma -13910C>T v slovenski populaciji Preglednica 4: Pogostost posameznih laktaznih genotipov v razliœnih populacijah (15) Table 4: The frequency of lactase genotypes in various populations (15) populacija n % CC oseb % CT oseb % TT oseb Finska 938 18,1 47,5 34,3 USA (Utah) 92 7,6 35,9 56,5 Ameriœani afriĝkega izvora 96 79,2 15,6 5,2 Nemœija 187 21,4 49,7 28,9 Slovenija 172 39 51 10 ostali pa so imeli genotip CT ali TT. Samo 16 % oseb z genotipom CC je imelo znake laktozne intolerance. Tudi 6 % CT in TT oseb je trdilo, da ima znake laktozne intolerance, vendar le-te verjetno lahko pripiĝe-mo kakim drugim stanjem s podobnimi znaki. c2-test je pokazal, da je v skupini oseb z genotipom CC znaœilno veœ oseb z znaki laktozne intolerance kot v skupini z genotipom CT in TT, p = 0,027. Vendar pa dejstvo, da ujemanje med genotipom CC in znaki ni popolno nakazuje, da diagnosti-ciranje laktozne intolerance samo na osnovi kliniœnih znakov ni zanesljivo. Dokazali smo tudi, da je izraĉanje znakov pri CC osebah odvisno tudi od starosti. Povpreœna starost v skupini CC oseb z znaki je bila 37 ħ 11 let, v skupini CC oseb brez znakov pa 31 ħ 8 let, kar je t-test pokazal kot mejno znaœilno, p = 0,056. To pomeni, da pogostost znakov lak-tozne intolerance pri osebah z genotipom CC s starostjo naraĝœa. Osebe z genotipom CC in osebe z genotipom CT ali TT se med seboj ne razlikujejo po pogostosti uĉivanja mleka in mleœnih izdelkov. Ker pa je imelo le 16 % oseb z genotipom CC veœje teĉave pri uĉivanju mleka, smo primerjali samo CC osebe z znaki in CT/TT osebe. Ugotovili smo, da je razlika v pogostosti uĉivanja polnomastnega in manj mastnega mleka med tema dvema skupinama veœja (œeprav ne statistiœno znaœilna), kot œe primerjamo vse CC osebe s CT/TT osebami. Poraba jogurta je bila v vseh navedenih skupinah podobna, saj prebava le-tega ni v toliki meri povezana z laktazo. Rezultati so prikazani v preglednici 5. Preglednica 5: Pogostost uĉivanja mleka in jogurta pri osebah z razliœnimi genotipi in fenotipi Table 5: The frequency of milk and yogurt consumption in subjects with different genotypes and phenotypes Polnomastno mleko Mleko z manj maĝœobe jogurt CC osebe s simptomi 6,7 (p = 0,318) 6,9 (p = 0,165) 10,6 (p = 0,469) Vse CC osebe 12,1 (p = 0,910) 12,9 (p = 0,763) 14,4 (p = 0,678) CT in TT osebe 11,8 13,6 13,6 4 Sklep Na osnovi rezultatov naĝe ĝtudije lahko sklepamo, da ima v zdravi slovenski populaciji 39 % oseb genotip CC, ki je povezan z nizko aktivnostjo laktaze v odrasli dobi, 61 % pa ima ohranjeno visoko aktivnost laktaze v odrasli dobi oz. genotip CT ali TT. Najveœ je bilo oseb z genotipom CT (51 %), najmanj pa homozigotnih TT oseb (10 %). Slovenska populacija je po deleĉu oseb z visoko laktazno aktivnostjo bliĉje severni kot juĉni Evropi. Ujemanje med genotipom CC in znaki laktozne intolerance ni popolno. Incidenca simptomov pri osebah z genotipom CC s starostjo naraĝœa. 5 Literatura 1. Swallow DM, Poulter M, Hollox EJ. Intolerance to lactose and other dietary sugars. Drug Metabolism and Disposition 2001; 29(4): 513-516. 2. OMIM*603202. On Line Mendelian Inheritance in Man (OMIM): http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=OMIM 3. Bersaglieri T, Sabeti PC, Patterson N et al. Genetic signatures of strong recent positive selection at the lactase gene. Am J Hum Genet 2004; 74: 1111-1120. 4. OMIM#223100. On Line Mendelian Inheritance in Man (OMIM): http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=OMIM 5. Montgomery RK, Büller HA, Rings EHHM et al. Lactose intolerance and the genetic regulation of intestinal lactase-phlorizin hydrolase. The FASEB Journal 1991; 5: 2824-2832. 6. Wang Y, Harvey CB, Hollox EJ et al. The genetically programmed down-regulation of lactase in children. Gastroenterology 1998; 114: 1230-1236. 7. Troelsen JT, Olsen J, Noren O et al. A novel intestinal trans-factor (NF-LPH1) interacts with the lactase-phlorizin hydrolase promoter and co-varies with the enzymatic activity. J Biol Chem 1992; 267(28): 20407-20411. 8. Troelsen JT, Olsen J, Mitchelmore C et al. Two intestinal specific nuclear gactors binding to the lactase-phlorizin hydrolase and sucrase-isomaltase promoters are functionally related oligomeric molecules. FEBS Letters 1994: 342: 297-301. 9. Spodsberg N, Troelsen JT, Carlsson P et al. Transcriptional regulation of pig lactase-phlorizin hydrolase: Involvement of HNF-1 and FREACs. Gastroenterology 1999; 116: 842-854. 10. Mitchelmore C, Troelsen JT, Sjöström H et al. The HOXC11 homeodomain protein interacts with the lactase-phlorizin hydrolase promoter and stimulates HNF1a-dependent transcription. J Biol Chem 1998; 273(21): 13297-13306. 11. OMIM*605559. On Line Mendelian Inheritance in Man (OMIM): http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=OMIM 12. McBean LD, Miller GD. Allaying fears and fallacies about lactose intolerance. Journal of the American Dietetic Association 1998; 98(6): 671-676. 13. Harvey CB, Pratt WS, Islam I et al. DNA polymorphisms in the lactase gene. Eur J Hum Genet 1995; 3: 27-41. 14. Hollox EJ, Poulter M, Zvarik M et al. Lactase haplotype diversity in the Old World. Am J Hum Genet 2001; 68: 160-172. 15. Enattah NS, Sahi T, Savilahti E et al. Identification of a variant associated with adult-type hypolactasia. Nature genetics 2002; 30: 233-237. 16. Kuokkanen M, Enattah NS, Oksanen A et al. Transcriptional regulation of the lactase-phlorizin hydrolase gene by polymorphisms associated with adult-type hypolactasia. Gut 2003; 52: 647-652. 17. Harvey CB, Wang Y, Darmoul D et al. Characterisation of a homologue of a yeast cell division cycle gene, MCM6, located adjacent to the 5’ end of the lactase gene on chromosome 2q21. FEBS Letters 1996; 398: 135-140. 18. Poulter M, Hollox E, Harvey CB et al. The causal element for the lactase persistence/non-pesistence polymorphism is located in a 1 Mb region of linkage disequilibrium in Europeans. Ann Hum Genet 2003; 67: 298-311. 19. Mulcare CA, Weale ME, Jones AL et al. The T allele of a single-nucleotide polymorphism 13,9 kb upstream of the lactase gene (LCT) (C-13,9 kb T) does not predict or cause the lactose-persistence phenotype in Africans. Am J Hum Genet 2004; 74: 1102-1110. farm vestn 2005; 56