Genetika sindroma policistiœnih jajœnikov Genetika sindroma policistiœnih jajœnikov – vloga mikrosatelitskega polimorfizma (TAAAA)n v genu SHBG Genetics of polycystic ovary syndrome – a role of microsatellite polymorphism (TAAAA)n in the SHBG gene Polonca Ferk, Teja Œelhar, Ksenija Gerĝak Povzetek Sindrom policistiœnih jajœnikov (PCOS) je kompleksna bolezen, z izrazito heterogeno kliniœno sliko in verjetnim genetskim ozadjem. Hiperandrogenizem je ena od kljuœnih fenotipskih znaœilnosti PCOS. Med ĝtevilnimi doslej predlaganimi kandidatnimi genetskimi polimorfizmi za PCOS je tudi mikrosatelitski polimorfizem (TAAAA)n v promotorju gena SHBG. Gen SHBG nosi zapis za specifiœni vezavni globulin za spolne hormone (SHBG), kateri vpliva na deleĉ bioloĝko razpoloĉljivih androgenov, navedeni polimorfizem pa uravnava ekspresijo gena SHBG. V naĝi raziskavi na 118 bolnicah s PCOS in 108 zdravih prostovoljkah smo ugotavljali morebitno povezavo polimorfizma (TAAAA)n SHBG s serumskimi koncentracijami SHBG ter tako posredno s samim razvojem PCOS. Obe skupini preiskovank sta se znaœilno razlikovali po svojem biokemijskem in kliniœnem profilu. Obravnavani polimorfizem se je izkazal za moœan napovedni dejavnik serumskih koncentracij SHBG; daljĝi aleli so verjetno povezani z niĉjimi serumskimi koncentracijami SHBG in s tem z veœjim tveganjem za razvoj hiperandrogenizma pri PCOS. Polimorfizem (TAAAA)n SHBG pa najbrĉ ni edini genetski dejavnik tveganja za razvoj celotnega spektra kliniœne slike PCOS, temveœ gre verjetno za vpliv specifiœne kombinacije veœ razliœnih genetskih polimorfizmov v povezavi z nekaterimi dejavniki iz okolja. Kljuœne besede: sindrom policistiœnih jajœnikov (PCOS), kandidatni geni za PCOS, polimorfizem (TAAAA)n v genu SHBG ABSTACT: Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a complex disease, with extremely heterogeneous clinical presentation and a possible genetic background. Hyperandrogenism is one of the key features in PCOS. Among numerous PCOS candidate genetic polymorphisms, the microsatellite polymorphism (TAAAA)n in the promoter of the SHBG gene has also been proposed. The SHBG gene encodes for specific sex hormone binding globulin (SHBG), which influences the proportion of bioavailable androgens, and the polymorphism regulates the SHBG gene's expression. In the present study on 118 PCOS women and 108 healthy volunteers, possible associations of the (TAAAA)n SHBG polymorphism with serum SHBG levels and with the development of PCOS were investigated. Both groups of patients differed significantly in their biochemical and clinical profiles. The polymorphism was ascertained to be a strong predictor for serum SHBG levels; longer alleles were associated with lower serum SHBG levels and thus with higher risks for hyperandrogenism in PCOS. Rather than the (TAAAA)n SHBG polymorphism as the only genetic susceptibility factor, a specific combination of several genetic polymorphisms modified by environmental factors might be involved in the development of the whole spectrum of PCOS clinical picture. Key words: polycystic ovary syndrome (PCOS), PCOS candidate genes, (TAAAA)n SHBG polymorphism 1 Uvod 1.1 Kliniœna slika sindroma policistiœnih jajœnikov Prva opredelitev sindroma policistiœnih jajœnikov (PCOS) sega v leto 1935, ko sta Stein in Leventhal opisala soœasno prisotnost morfoloĝko policistiœnih jajœnikov (PCO) in amenoreje. Danes vemo, da se PCOS kliniœno ne odraĉa samo z motnjami v delovanju jajœnikov in s tem v reproduktivnem zdravju ĉenske, temveœ da gre za kompleksno sistemsko bolezen, z izrazito heterogenim izraĉanjem (1). Glede na najnovejĝe diagnostiœne kriterije (2) morata biti za postavitev diagnoze PCOS pri ĉenski izpolnjena (vsaj) dva od naslednjih treh kriterijev: (i) kroniœne oligoovulatorne ali anovulatorne motnje menstruacijskega ciklusa, ki se izraĉajo z oligomenorejo ali amenorejo, ter vodijo v zmanjĝano plodnost oz. neplodnost; (ii) kliniœni hiperandrogenizem (œezmerna poraĝœenost po moĝkem tipu - t. i. hirzutizem, aknavost, pleĝavost po moĝkem tipu) in/ali patoloĝko zviĝane koncentracije androgenih hormonov v krvi (tj. biokemiœni hiperandrogenizem oz. hiperandrogenemija); (iii) PCO na ultrazvoku (3). Predhodno je potrebno izkljuœiti druge moĉne etiologije: dr. Polonca ferk, mag.farm., Katedra za kliniœno biokemijo, Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Aĝkerœeva 7, 1000 Ljubljana Teja Œelhar, mag.farm., Katedra za kliniœno biokemijo, Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Aĝkerœeva 7, 1000 Ljubljana prof.dr. Ksenija Gerĝak, dr.med., Ginekoloĝka klinika, Ĝlajmerjeva 3, 1525 Ljubljana farm vestn 2007; 58 21 Raziskovalni œlanek – Research article hiperprolaktinemijo, Cushingov sindrom, neklasiœno kongenitalno adrenalno hiperplazijo, akromegalijo ter prisotnost tumorjev, ki prekomerno izloœajo androgene. Druge znaœilnosti kliniœne slike PCOS so tudi poviĝano razmerje serumskih koncentracij luteinizirajoœega hormona (LH) in folikle stimulirajoœega hormona (FSH) (razmerje > 2), presnovne motnje (inzulinska rezistenca, glukozna intoleranca, dislipidemije), debelost (zlasti trebuĝna) (4). S prevalenco, ocenjeno na 5-10 % na razliœnih etniœnih populacijah, je PCOS verjetno najpogostejĝa endokrina motnja pri ĉenskah v rodnem obdobju, medtem ko ima PCO (ĝe) brez razvitih simptomov kar vsaka peta ĉenska v sploĝni populaciji. Poleg tega je PCOS vzrok za kar tri œetrtine vseh primerov anovulatorne neplodnosti, pokriva pa tudi kar 90 % vseh vzrokov hirzutizma (1). Dolgoroœne zdravstvene posledice bolnic s PCOS se odraĉajo predvsem z moœno poveœanim tveganjem za razvoj sladkorne bolezni tipa 2 (5) ter srœno-ĉilnih obolenj (6) v kasnejĝem ĉivljenjskem obdobju. 1.2 Patogeneza PCOS Na molekularnem nivoju so za PCOS znaœilne naslednje patofizioloĝke spremembe: (i) v biosintezi, metabolizmu in/ali delovanju androgenov, (ii) v izloœanju in/ali delovanju inzulina, (iii) na nivoju hipotalamiœno-hipofizne osi, (iv) v metabolizmu kortizola, (v) v metabolizmu lipidov, (vi) subkliniœni kroniœni vnetni procesi. Navedene biokemijske spremembe so medsebojno povezane (slika 1), izvor celotnega spektra motenj pa je najverjetneje v prekomerni biosintezi androgenov v jajœnikih (7). Glede na ekstremno fenotipsko raznolikost in kompleksnost kliniœne slike PCOS je razvoj tega sindroma zelo verjetno posledica kompleksnega medsebojnega vpliva veœ razliœnih dejavnikov tveganja: genetskih dejavnikov (specifiœne genotipske kombinacije) in/ali dejavnikov okolja (naœin prehranjevanja, telesna dejavnost). Govorimo o multifaktorski patogenezi, ki pa kljub ĝtevilnim raziskavam ostaja ĝe vedno v veliki meri nepojasnjena (1). 1.3 Hiperandrogenizem pri PCOS Na razvoj kliniœnega hiperandrogenizma pri bolnicah s PCOS vplivajo: (i) hiperandrogenemija, (ii) poveœan deleĉ bioloĝko razpoloĉljivih androgenov ter (iii) prekomerna odzivnost receptorja za androgene, zaradi œesar so uœinki androgenov lahko okrepljeni tudi v primeru njihovih normalnih krvnih koncentracij (1). Hiperandrogenemija je pri bolnicah s PCOS v najveœji meri posledica prekomerne biosinteze androgenov v jajœnikih, delno pa tudi v nadledviœni ĉlezi. Glede na to, da celice teke iz PCO ohranijo v Slika 1: Patogeneza sindroma policistiœnih jajœnikov: A-androstendion; ACTH-adrenokortikotropni hormon; AR-androgeni receptor; DHEA-dehidroepiandrosteron; DHEAS-dehidroepiandrosteron sulfat; GnRH-sprostitveni hormon za gonadotropine; LH-luteinizirajoœi hormon; PCO-policistiœni jajœniki; SHBG-vezavni globulin za spolne hormone; T-testosteron; ?-poviĝan, poveœan; ?-zniĉan, zmanjĝan; œrtkana œrta-ĝibek uœinek; znak + se nanaĝa na pozitiven, spodbujajoœ uœinek, znak - pa na negativen, zaviralni uœinek. Figure 1: Pathogenesis of polycystic ovary syndrome: A-androstendione; ACTH-adrenocorticotropic hormone; AR-androgen receptor; DHEA-dehydroepiandrosterone; DHEAS-dehydroepiandrosterone sulfate; GnRH-gonadotropin-releasing hormone; LH-luteinizing hormone; PCO-polycystic ovaries; SHBG-sex hormone-binding globulin; T-testosterone; ?-increased; ?-decreased; broken line indicates weak influence; + indicates stimulatory effect; - indicates inhibitory effect. 22 farm vestn 2007; 58 Genetika sindroma policistiœnih jajœnikov pogojih in vitro stabilen biokemijski in molekularni fenotip (8), lahko gre za intrinziœno motnjo na kateri od stopenj v procesu steroidogeneze. Nadalje je znano, da ima LH, katerega frekvenca in amplituda izloœanja sta pri bolnicah s PCOS poveœani, izrazito stimulirajoœi uœinek na biosintezo androgenov v jajœnikih. Steroidogenezo spodbuja tudi inzulin (ter inzulinu podobni rastni dejavniki), katerega koncentracije v krvi so pri ĉenskah s PCOS pogosto poviĝane. Uœinek inzulina je neposreden ali preko okrepitve uœinkov LH. Dodatni prispevek hiperinzulinemije h kliniœnemu hiperandrogenizmu je tudi preko zaviranja biosinteze vezavnega globulina za spolne hormone (SHBG) v jetrih, kar poslediœno vodi do viĝjih koncentracij prostih androgenov v krvi. Preseĉek androgenov v lokalnem okolju jajœnikov prizadene dozorevanje jajœnih foliklov, kar pripelje do anovulacije. Krog biokemijskih sprememb se sklene, ko hiperandrogenemija povratno spodbudi izloœanje gonadotropinov iz hipofize (slika 1) (1). Glede na najnovejĝo predpostavko naj bi se hiperandrogeni fenotip za PCOS programiral ĉe v predrojstnem obdobju, in sicer v primeru izpostavljenosti ploda preseĉku androgenov kot posledice lastnih (genetskih) dejavnikov tveganja in ne kot posledice metabolnih sprememb pri materi (9). 1.4 Genetika PCOS Glede na pojavljanje PCOS v druĉinah imajo genetski dejavniki verjetno pomembno vlogo v patogenezi tega sindroma. Kompleksnost kliniœne slike PCOS podpira predpostavko o oligogenskem genetskem modelu (10). Pod genetskimi dejavniki tveganja razumemo t. i. tvegane genetske polimorfizme, ki preko uravnavanja transkripcijske aktivnosti ciljnih genov, udeleĉenih v patogenetskih poteh pri PCOS, vplivajo na nivo izraĉanja teh genov. Doslej so ĉe za ĝtevilne genetske polimorfizme dokazali njihovo pomembno vlogo v patogenezi mnogih genetsko pogojenih bolezni pri œloveku, s klasiœnim primerom bolezni trinukleotidnih zaporedij. Tvegani genetski polimorfizmi so razliœnih tipov, najpogosteje polimorfizmi razliœnega ĝtevila tandemskih ponovitev (mikrosatelitski in minisatelitski polimorfizmi), v nekaterih primerih tudi polimorfizmi posameznih nukleotidov (11). Na osnovi rezultatov analiz genske povezanosti so bili predlagani ter nato z asociacijskimi ĝtudijami ("primer-kontrola") in testi vezavnega neravnovesja v druĉinah analizirani ĉe ĝtevilni kandidatni geni in genetski polimorfizmi za PCOS (1, 12, 13). Najobetavnejĝi kandidatni geni za PCOS so navedeni v preglednici 1. Kljub intenzivnim raziskavam genetskega ozadja PCOS in nekaterim obetajoœim rezultatom ostaja z genetskega staliĝœa velik deleĉ kompleksnega spektra patofizioloĝkih sprememb pri PCOS ĝe nepojasnjen. Doslej ĝe za nobenega od predlaganih genetskih dejavnikov niso uspeli nedvoumno dokazati njegove vloge v nastanku PCOS. Prihodnost odkrivanja genetskih vzrokov PCOS je: (i) v ĝtudijah na œim veœjem ĝtevilu preiskovank (velike multicentriœne ĝtudije) z natanœno opredeljenimi kriteriji za vkljuœitev v raziskavo, (ii) v uporabi statistiœnih metod, razvitih posebej za statistiœno obravnavo kompleksnih bolezni, kot je PCOS (14), (iii) v vrednotenju hkratnega vpliva veœ razliœnih kandidatnih genov na razvoj in posamezne fenotipske znaœilnosti PCOS ter (iv) v uporabi novih molekularno genetskih pristopov, med katerimi trenutno najveœ obeta tehnologija mikromreĉ (15-19). 1.5 Mikrosatelitski polimorfizem (TAAAA)n v promotorju gena SHBG Gen SHBG (kromosomska lokacija 17p13-p12) nosi zapis za SHBG specifiœen plazemski prenaĝalni glikoprotein za spolne hormone Serumske koncentracije SHBG vplivajo na bioloĝko razpoloĉljivost in poslediœno na bioloĝke uœinke androgenov: pri niĉji koncentracij SHBG v serumu je deleĉ prostih androgenov veœji in bioloĝki uœinki androgenov moœnejĝi. Na znaœilno raznolikost serumskih koncentracij SHBG med posamezniki vplivajo spol, starost, prehrambni hormonski, metabolni dejavniki, v najveœji meri pa verjetno genetski dejavniki (20). Zviĝane serumske koncentracije androgenov in inzulina zniĉujejo serumske koncentracije SHBG. Glede na rezultate dosedanjih ĝtudij so serumske koncentracije SHBG zniĉane (in s tem dostop prostih androgenov do tarœnih tkiv veœji) pri bolnicah s hiperandrogenizmom, pri bolnicah s PCOS ter pri posameznikih, ki imajo veœje tveganje za razvoj sladkorne bolezni tipa 2 in za razvoj srœno-ĉilnih obolenj (21) V neposredni bliĉini 5'- konca promotorja gena SHBG, znotraj zaporedja Alu, so nedavno odkrili mikrosatelitski polimorfizem Preglednica 1 : Kandidatni geni za PCOS Table 1: PCOS candidate genes 1) Geni, udeleĉeni v biosintezi, metabolizmu oz. delovanju androgenov • geni za steroidogene encime (npr. geni CYP11A, CYP17, CYP19, CYP21) • gen za androgeni receptor (gen AR) • gen za vezavni globulin za spolne hormone (gen SHBG) 2) Geni, udeleĉeni v izloœanju oz. delovanju inzulina • gen za inzulin (gen INS) • gen za inzulinski receptor (gen INSR) • geni za substrate na inzulinskem receptorju (gena IRS-1, IRS-2) • gen za kalpain 10 (gen CAPN10) • gen za inzulinu podoben rastni dejavnik 2 (gen IGF2) 3) Geni, udeleĉeni v sproĝœanju, uravnavanju oz. delovanju gonadotropinov • gen za luteinizirajoœi hormon (gen LH) • gen za receptor za LH • gen za folistatin 4) Geni, vkljuœeni v presnovne procese v maĝœobnem tkivu • gen za leptin • gen za receptor za leptin • gen PPAR? (angl. Peroxisome Proliferator-Activated Receptor ?) • gen za adiponektin • gen za inhibitor plazminogenskega aktivatorja 1 (gen PAI-1) 5) Drugi geni • gen za receptor za dejavnik tumorske nekroze (gen TNFR) gen za paraoksonazo (gen PON1) geni za razliœne interlevkine farm vestn 2007; 58 23 • • Raziskovalni œlanek – Research article (TAAAA)n, ki naj bi v povezavi z nekaterimi drugimi bliĉnjim genetskimi oznaœevalci uravnaval izraĉanje gena SHBG in vitro (22) in poslediœno vplival tudi na serumske koncentracije SHBG. Doslej so opisali ĝest alelnih razliœic (TAAAA)n SHBG, in sicer alelne razliœice s 6, 7, 8, 9, 10 in 11 ponovitvami TAAAA (23, 24) Namen naĝe raziskave je bil ugotoviti, ali mikrosatelitski polimorfizem (TAAAA)n v promotorju gena SHBG vpliva na serumske koncentracije SHBG ter na razvoj PCOS v slovenski populaciji preiskovank. S tem smo ĉeleli razĝiriti dosedanje znanje o genetskem ozadju hiperandrogenizma pri PCOS in dodati nov prispevek k razumevanju mehanizmov nastanka te bolezni 2 Materiali in metode 2.1 Preiskovanke V ĝtudijsko skupino smo vkljuœili 118 bolnic s potrjeno diagnozo PCOS (2). Vse bolnice so imele motnje menstruacijskega ciklusa (oligomenoreja ali amenoreja), PCO na ultrazvoku (3), razmerje serumskih koncentracij LH/FSH > 2 in vse so bile biokemiœno in/ali kliniœno hiperandrogene. Kliniœno smo hiperandrogenizem opredelil s prisotnostjo hirzutizma (indeks po Ferriman-Gallweyu a 8) in/ali aknavosti, biokemijsko pa z zviĝanimi serumskimi koncentracijam celokupnega testosterona (Tsk), dehidroepiandrosteron sulfata in/ali androstendiona. Pri bolnicah, ki so imele serumske koncentracije Tsk viĝje od 4,8 nmol/L, so bili s predhodno kliniœno obravnavo izkljuœen drugi moĉni vzroki hiperandrogenizma (3). Kontrolno skupino je sestavljalo 108 zdravih prostovoljk z izkljuœeno diagnozo PCOS. V polovici primerov so bile ĉenske v kontrolni skupin zdrave noseœnice, ki so spontano zanosile (dokazana plodnost), v drugi polovici primerov pa ĉenske, sicer vkljuœene v postopek oploditve z biomedicinsko pomoœjo, vendar izkljuœno zarad mehanskega vzroka neplodnosti ali zaradi neplodnosti moĝkega partnerja. Nobena od preiskovank v kontrolni skupini v preteklosti ni mela endokrinih in avtoimunskih bolezni ter operacij v medeniœnem predelu Vse preiskovanke so bile mlade ĉenske (starost primerljiva med obema skupinama), kavkazijske rase in med seboj niso bile v sorodu Obravnavane so bile v sklopu redne ambulantne dejavnosti, z rutinskimi postopki na Ginekoloĝki kliniki v Ljubljani, v letih 2002-2005. V raziskavi so sodelovale prostovoljno, na podlagi pisne privolitve, po predhodni seznanitvi z namenom odvzema krvi za genetsko analizo in s potekom dela naĝe raziskave Raziskavo je odobrila Komisija Republike Slovenije za medicinsko etiko (ĝt. 97/05/01). 2.2 Materiali in metode Biokemijske analize V serumskih vzorcih, odvzetih v zgodnji folikularni fazi menstruacijskega ciklusa oz. nakljuœno pri bolnicah z amenorejo, smo doloœali koncentracije SHBG in Tsk (opravljeno na Kliniœnem inĝtitutu za kliniœno kemijo in biokemijo v Ljubljani). Za merjenje koncentracij SHBG smo uporabili kemoluminiscenœno imunometriœno reakcijo (SHBG-Immulite; Diagnostic Products Corporation, Los Angeles, ZDA), za Tsk pa radioimunski test s trĉno dostopnim kompletom TESTO-CTK (DiaSorin, Saluggia, Italija). Koeficienti variacije znotraj posamezne serije ter med razliœnimi serijami so bili za oba analita v obmoœju med 3 % in 11 %. Za vse preiskovanke smo izraœunali indeks telesne mase (ITM) po sploĝni formuli: ITM = telesna masa [kg]/ (telesna viĝina)2 [m2]. Molekularno genetske metode Preiskovankam smo odvzeli po 5 ml periferne krvi v sterilne epruvete z 1/10 antikoagulanta EDTA. Genomsko DNA smo pri vseh preiskovankah izolirali iz levkocitov polne periferne krvi s pomoœjo trĉno dostopnega kompleta FlexiGene DNA kit 250 (Qiagen GmbH, Hilden, Nemœija), v skladu z navodili proizvajalca. Reakcijska raztopina za reakcijo PCR je v konœnem volumnu 15 µL vsebovala naslednje komponente v navedenih konœnih koncentracijah oz. koliœinah: 90 °C ng genomske DNA, 0,2 µM vsakega od zaœetnih oligonukleotidov (5'-GAA CTC GAG AGG CAG AGG CAG CAG TGA-3' in 5'-AGA AAT CAC CCA CTC CCT GA-3'), 0,2 mM vsakega od dNTP-jev, 1- kratni pufer za PCR (Perkin Elmer, Applied Biosystems, Foster City, ZDA), 1,5 mM MgCl2 ter 1 enoto encima polimeraze DNA AmpliTaq Gold™ (Perkin Elmer, Applied Biosystems, Foster City, ZDA). Reakcijski pogoji so bili sledeœi: zaœetni 10-minutni denaturaciji pri 95 °C je sledilo 30 ciklov s 45 sekund trajajoœo denaturacijo pri 94 °C, 45-sekundnim prileganjem zaœetnih oligonukleotidov pri 63 °C in podaljĝevanjem verige DNA 1 minuto pri 72 °C; zakljuœno podaljĝevanje na novo sintetizirane verige DNA pa je potekalo 7 minut pri 72 °C. Razliœno dolge produkte reakcije PCR smo loœevali z elektroforezo na trĉno dostopnih gelih SpreadexTM EL400 Mini v elektroforeznem aparatu SEA 2000 (Elchrom Scientific, Cham, Ĝvica), v skladu z navodili proizvajalca (pri 55 °C, 141 minut). Fragmente DNA smo obarvali z barvilom Syber Gold (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) in rezultate preverili pod ultravijoliœno svetlobo. Na ĝtevilo ponovitev osnovnega motiva smo sklepali iz dolĉin pomnoĉenih fragmentov DNA, izmerjenih glede na oznaœevalec velikosti M3 (Elchrom Scientific, Cham, Ĝvica) ter glede na notranji standard. Slednjega smo predhodno pripravili z neposrednim sekveniranjem ĝestih razliœno dolgih produktov reakcije PCR, dolĉine 133 bp, 138 bp, 143 bp, 148 bp, 153 bp in 158 bp, kar ustreza ĝtevilu ponovitev TAAAA 6-11 (opravljeno v Laboratoriju za molekularno genetiko na Inĝtitutu za patologijo Medicinske fakultete v Ljubljani). Statistiœna analiza Test ?2 smo uporabili za statistiœno vrednotenje razlik v frekvencah alelov in genotipov med ĝtudijsko in kontrolno skupino preiskovank ter v primeru ugotavljanja Hardy-Weinbergovega ravnovesja. Za primerjavo povpreœnih vrednosti ITM, serumskih koncentracij Tsk in SHBG med dvema razliœnima skupinama preiskovank smo uporabili Studentov t-test, za primerjavo povpreœnih vrednosti serumskih koncentracij SHBG med tremi razliœnimi skupinami preiskovank pa test analize variance (ANOVA). Nelinearne povezave med posameznimi parametri smo opredelili s Spearmanovimi koeficienti korelacije, linearne povezave pa s Pearsonovimi koeficienti korelacije. Za napovedovanje serumskih koncentracij SHBG smo uporabili ustrezen linearni regresijski model, za napovedovanje statusa PCOS farm vestn 2007; 58 (prisotnost/odsotnost PCOS) pa ustrezno logistiœno regresijsko analizo. Vse statistiœne analize smo opravili z raœunalniĝkim programom za statistiœno analizo SPSS for Windows, verzija 12.0 (SPSS Inc., Illinois, ZDA). Merilo za statistiœno znaœilno razliœnost je bila vrednost p < 0,05. 3 Rezultati in razprava 3.1 Biokemijski in kliniœni profil preiskovank Bolnice s PCOS so imele v primerjavi s preiskovankami v kontrolni skupini znaœilno niĉje serumske koncentracije SHBG (p < 0,001). Znaœilno zniĉane serumske koncentracije SHBG pri ĉenskah s PCOS navajajo tudi v predhodnih ĝtudijah (23, 24). Nadalje so imele naĝe bolnice znaœilno viĝji ITM (p < 0,001) in znaœilne viĝje serumske koncentracije Tsk (p < 0,001), kar je potrditev znaœilnih lastnosti kliniœne slike PCOS. Rezultati so prikazani v preglednici 2. Vse ĉenske v kontrolni skupini so bile vitke (18 kg/m2 = ITM = 25 kg/m2), medtem ko je 13,6 % bolnic imelo telesno teĉo prekomerno (ITM > 25 kg/m2), preostale bolnice pa so bile vitke. Glede na predhodna kliniœna opaĉanja debelost pri bolnicah s PCOS znaœilno poslabĝa kliniœno sliko (1), kar smo s preverjanjem povezanosti ITM-ja s serumskimi koncentracijami Tsk in SHBG poskuĝali delno opredeliti tudi za naĝe preiskovanke. V skupini bolnic sta bila parametra ITM in serumske koncentracije Tsk znaœilno pozitivno korelirana (R = 0,276; p = 0,002), medtem ko serumske koncentracije SHBG v sploĝnem niso bile znaœilno povezane z ITM niti v ĝtudijski niti v kontrolni skupini. Iz slike 2 je razvidno, da se pri ITM v normalnem obmoœju serumske koncentracije SHBG v obeh skupinah gibljejo v relativno ĝirokem razponu, medtem ko smo pri bolnicah s prekomerno telesno teĉo opazili teĉnjo k niĉjim serumskim koncentracijam SHBG. Slednje opaĉanje, katerega zaradi premajhnega ĝtevila bolnic s prekomerno telesno teĉo sicer nismo mogli ustrezno statistiœno ovrednotiti, nasprotuje izsledkom predhodne ĝtudije na francoski populaciji bolnic s PCOS (s hirzutizmom) (24), v kateri sicer ugotavljajo znaœilno negativno korelacijo med serumskimi koncentracijami SHBG in ITM, vendar je le-ta omejena na vitke bolnice (z ITM < 25 kg/m2). Na osnovi zgornjih rezultatov ocenjujemo, da bi debelost pri naĝih bolnicah lahko bila pomemben dejavnik za poslabĝanje tako Preglednica 2: Povpreœne vrednosti (ħ SD) nekaterih parametrov v skupini bolnic s PCOS ter v kontrolni skupini preiskovank Table 2: Mean values (ħ SD) of some parameters in PCOS and control patients Bolnice Kontrole p SHBG (nmol/L) 44,4 ħ 19,1 61,0 ħ 14,7 < 0,001 Tsk (nmol/L) 3,0 ħ 1,3 1,2 ħ 0,4 < 0,001 ITM (kg/m2) 22,3 ħ 3,1 21,2 ħ 1,1 0,001 Genetika sindroma policistiœnih jajœnikov Slika 2: Odvisnost serumskih koncentracij SHBG od ITM Figure 2: Serum SHBG levels in relation to BMI biokemiœnega kot tudi kliniœnega hiperandrogenizma, vendar bi bilo za dokonœne zakljuœke v raziskavo potrebno vkljuœiti mnogo veœje ĝtevilo preiskovank. 3.2 Molekularno genetska analiza polimorfizma (TAAAA)n v genu SHBG Pri naĝih preiskovankah smo ugotovili prisotnost alelov SHBG s 6, 7, 8, 9, 10 in 11 ponovitvami TAAAA ter 18 razliœnih (od 21 moĉnih) genotipov (TAAAA)n SHBG (preglednica 3). Genotipske frekvence v obeh skupinah preiskovank so bile v Hardy-Weinbergovem ravnovesju. Primer rezultata molekularno genetske analize polimorfizma (TAAAA)n v genu SHBG je prikazan na sliki 3. Slika 3: Primer identifikacije genotipov (TAAAA)n SHBG: Slikano pod ultravijoliœno svetlobo (254 nm) po elektroforezni loœitvi produktov PCR na gelih SpreadexTM EL400 Mini in barvanju z barvilom Syber Gold (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ); genotipi SHBG so oznaœeni kot ĝtevilo ponovitev TAAAA na obeh alelih SHBG; M3-oznaœevalec velikosti (Elchrom Scientific, Cham, Ĝvica). Figure 3: An example of the (TAAAA)n SHBG genotype identification: The picture was taken under the ultraviolet light (254 nm) after the electrophoresis of PCR products on SpreadexTM EL400 Mini gels and after the staining with Syber Gold dye (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ); the genotypes are designated as the number of TAAAA repeats on both of the two SHBG alleles. M3-marker (Elchrom Scientific, Cham, Switzerland). farm vestn 2007; 58 25 Raziskovalni œlanek – Research article Preglednica 3: Frekvence alelov in genotipov (TAAAA)n SHBG v skupini bolnic s PCOS ter v kontrolni skupini preiskovank: Aleli so oznaœeni s 6-11, kar ustreza ĝtevilu ponovitev TAAAA. Table 3: The (TAAAA)n SHBG allele and genotype frequencies in PCOS and control group of patients: The alleles are designated as 6-11, indicating the number of TAAAA repeats. Frekvence alelov (TAAA)n SHBG (%) 6 7 8 9 10 11 PCOS 27,1 4,9 31,1 27,1 9,8 0 Kontrole 31,4 6,4 30,9 20,4 9,1 1,8 Frekvence genotipov (TAAA)n SHBG (%) 6/6 6/7 6/8 6/9 6/10 6/11 7/8 7/9 7/10 7/11 8/8 8/9 8/10 8/11 9/9 9/10 9/11 10/10 PCOS 7,3 5,7 18,7 10,6 6,5 0 3,3 2,4 0,8 0 10,6 13 5,7 0 11,4 4,9 0 0,8 Kontrole 10,9 4,5 18,2 12,7 4,5 0,9 3,6 0,9 2,7 0,9 10 14,5 4,5 0,9 3,6 4,5 0,9 0,9 Medtem ko je v skupini zdravih preiskovank prisotnih veœ krajĝih alelov SHBG (alelov s 6 in 7 ponovitvami TAAAA), je v skupini bolnic prisotnih veœ daljĝih alelov SHBG (alelov z 8, 9 in 10 ponovitvami TAAAA), vendar pa med obema skupinama preiskovank razlika v porazdelitvi posameznih alelov ni dosegla statistiœne znaœilnosti (p = 0,169). Glede na pomanjkanje informacij v zvezi s tem, kateri od obeh alelov SHBG v paru se prednostno izraĉa (25-27), smo naredili logistiœno regresijo z napovednima parametroma SHBGk (ĝtevilo ponovitev TAAAA na krajĝem od obeh alelov SHBG v paru) in SHBGd (ĝtevilo ponovitev TAAAA na daljĝem od obeh alelov SHBG v paru) ter statusom PCOS (prisotnost oz. odsotnost PCOS) kot izidom. Pokazalo se je, da parametra SHBGk in SHBGd nista znaœilna za PCOS (p = 0,225 za SHBGk in p = 0,860 za SHBGd). Ob primerjavi porazdelitev povpreœnih vrednosti ĝtevila ponovitev za vsak posamezen genotip (par alelov) (SHBGp) med ĝtudijsko in kontrolno skupino preiskovank prav tako nismo ugotovili statistiœno pomembnih razlik (p = 0,628). Sklepamo, da navedeni polimorfizem ni kljuœen dejavnik tveganja za sam razvoj PCOS oz. je njegov vpliv preĝibek, da bi ga lahko zaznali pri naĝi velikosti vzorca preiskovank. Za razliko od naĝih rezultatov pa navajajo znaœilno veœjo frekvenco alelov oz. genotipov SHBG z veœ kot 8 ponovitvami TAAAA za 185 Grkinj s PCOS (23). 3.3 Vpliv polimorfizma (TAAAA)n v genu SHBG na serumske koncentracije SHBG Tako v ĝtudijski kot tudi v kontrolni skupini preiskovank je bila korelacija med serumskimi koncentracijami SHBG in genetskim parametrom SHBGp statistiœno znaœilno negativna (p < 0,001 za obe skupini preiskovank). Linearna regresija s serumskimi koncentracijami SHBG kot odvisno spremenljivko, genetskim parametrom SHBGp kot napovednim parametrom in ITM kot moĉnim moteœim dejavnikom je pokazala, da tako pri bolnicah s PCOS kot tudi v kontrolni skupini preiskovank analizirani genetski parameter z visoko znaœilnostjo napoveduje serumske koncentracije SHBG (p < 0,001 v obeh skupinah); natanœneje, genotipi SHBG z veœjim ĝtevilom ponovitev TAAAA na obeh alelih znaœilno napovedujejo niĉje serumske koncentracije SHBG. Z uporabljenim regresijskim modelom smo uspeli pojasniti kar 55,3 % (prilagojena vrednost R2) raznolikosti v serumskih koncentracijah SHBG v skupini bolnic ter 33,1 % v kontrolni 26 farm vestn 2007; 58 skupini. Rezultate o znaœilnem negativno koreliranem odnosu med polimorfizmom (TAAAA)n SHBG in serumskimi koncentracijami SHBG pri bolnicah s PCOS navajajo tudi v ĝtudiji, v katero so bile vkljuœene 303 Francozinje s hirzutizmom, med katerimi je bilo 154 bolnic s PCOS (24), ter za 185 Grkinj s PCOS (23). Zanimivo je, da so rezultati naĝe ĝtudije in doslej objavljenih ĝtudij in vivo v nasprotju z rezultati ĝtudije in vitro na œloveĝkih hepatoblastomskih celicah HepG2; v slednji so namreœ ugotovili, da imajo konstrukti SHBG s 6 ponovitvami znaœilno manjĝo transkripcijsko aktivnost kot konstrukti s 7-10 ponovitvami TAAAA (22). V nadaljevanju smo zaradi pomanjkljivih podatkov glede prednostnega izraĉanja alelov (TAAAA)n SHBG (26-28) ter zaradi relativno nizkih frekvenc pojavljanja nekaterih genotipov obravnavali le homozigotne genotipe z relativno visoko pojavnostjo: tj. genotipe 6/6, 8/8 in 9/9. Frekvenca genotipa 6/6 je bila v skupini bolnic s PCOS Slika 4: Serumske koncentracije SHBG v odvisnosti od homozigotnega genotipa (TAAAA)n SHBG: Genotipi so zapisani kot ĝtevilo ponovitev TAAAA na obeh alelih SHBG. Figure 4: Serum SHBG levels in relation to the (TAAAA)n SHBG homozygous genotypes: The genotypes are designated as the number of TAAAA repeats on both of the two SHBG alleles. opazno niĉja, frekvenca genotipa 8/8 primerljiva in frekvenca genotipa 9/9 opazno viĝja v primerjavi z ustreznimi frekvencami v kontroln skupini (preglednica 3). Za obe skupini preiskovank je odvisnost serumskih koncentracij SHBG od homozigotnega genotipa (TAAAA)n SHBG prikazana na sliki 4. V primeru genotipa 6/6 v serumskih koncentracijah SHBG ni bilo znaœilnih razlik med bolnicami s PCOS in ĉenskami iz kontrolne skupine (p = 0,756), medtem ko je bila razlika znaœilna v primeru genotipov 8/8 (p < 0,001) in 9/9 (p < 0,001) Sklepamo lahko, da na serumske koncentracije SHBG pri PCOS v primeru genotipov z daljĝimi aleli poleg genotipa v znatni meri vplivajo ĝe drugi patogenetski dejavniki. Nadalje smo opazili, da so bile znotraj obeh skupin preiskovank razlike v serumskih koncentracijah SHBG med genotipi 6/6, 8/8 in 9/9 visoko znaœilne (p < 0,001 za obe skupini), in sicer v primeru genotipa 6/6 znaœilno viĝje glede na genotipa 8/8 in 9/9, med genotipoma 8/8 in 9/9 pa primerljive. Dejanski vpliv alelov SHBG z 8 ponovitvami TAAAA na serumske koncentracije SHBG bi lahko prikrila razliœica D327N v eksonu 8 gena SHBG, ki je v moœnem vezavnem neravnovesju z alelom (TAAAA)8 in za katero so ugotovili, da znaœilno podaljĝa bioloĝko razpolovno dobo SHBG v serumu (24) 4 Sklep V raziskavi na specifiœnem vzorcu slovenskih bolnic s PCOS ugotavljamo, da je mikrosatelitski polimorfizem (TAAAA)n v promotorju gena SHBG pomemben napovedni dejavnik serumskih koncentracij SHBG; daljĝi aleli so povezani z niĉjimi serumskimi koncentracijam SHBG in s tem z veœjim tveganjem za razvoj hiperandrogenizma pri PCOS. Œeprav je vpliv obravnavanega polimorfizma na serumske koncentracije SHBG znaœilno moœnejĝi pri bolnicah, je izraĉen tudi pri zdravih ĉenskah v kontrolni skupini. Sklepamo, da polimorfizem (TAAAA)n SHBG ni edini genetski dejavnik tveganja za razvoj kliniœne slike PCOS, temveœ da gre najverjetneje za vpliv specifiœne kombinacije veœ razliœnih genetskih polimorfizmov v povezavi z nekaterimi dejavniki iz okolja. Uspeĝno odkritje genetskih vzrokov PCOS obeta v prihodnosti vpeljavo novih diagnostiœnih in terapevtskih pristopov, moĉnost genetskega svetovanja in s tem izboljĝanje celostne obravnave bolnic s PCOS, ĝe zlasti moĉnost doloœanja individualnega profila genetskih dejavnikov tveganja in s tem prilagoditev kliniœne obravnave za vsako bolnico posebej (28). Za vse ĉenske v tej skupini je znaœilen urejen menstruacijski ciklus s hkratno odstotnostjo kliniœnih in biokemijskih znakov hiperandrogenizma ter z odstotnostjo PCO 5 Seznam okrajĝav PCOS sindrom policistiœnih jajœnikov (angl. PolyCystic Ovary Syndrome) PCO policistiœni jajœniki (le morfoloĝko) (angl. PolyCystic Ovaries) SHBG vezavni globulin za spolne hormone (angl. Sex Hormone - Binding Globulin) LH luteinizirajoœi hormon FSH folikle stimulirajoœi hormon Tsk celokupni testosteron ITM indeks telesne mase Genetika sindroma policistiœnih jajœnikov DNA deoksiribonukleinska kislina (angl. DeoxyriboNucleic Acid) PCR veriĉna reakcija s polimerazo (angl. Polymerase Chain Reaction) dNTP deoksiribonukleotid trifosfat (angl. DeoxyriboNucleotide TriPhosphate) A, C, T, G adenin, citozin, timin, gvanin EDTA etilendiamintetraocetna kislina (angl. EthyleneDiamineTetraacetic Acid) M molarna koncentracija SHBG oznaka za gen, ki nosi zapis za vezavni globulin za spolne hormone SHBGk ĝtevilo ponovitev TAAAA na krajĝem od obeh alelov SHBG v paru SHBGd ĝtevilo ponovitev TAAAA na daljĝem od obeh alelov SHBG v paru SHBGp povpreœno ĝtevilo ponovitev za posamezen genotip (par alelov) SHBG 6 Literatura 1) Fratantonio E, Vicari E, Pafumi C, Calogero AE. Genetics of polycystic ovarian syndrome. Reprod Biomed Online 2005; 10: 713-720. 2) The Rotterdam ESHRE/ASRM-Sponsored PCOS Consensus Workshop Group. Revised 2003 consensus on diagnostic criteria and long-term health risks related to polycystic ovary syndrome. Fertil Steril 2004; 81: 19–25. 3) Balen A, Conway GS, Homburg R, Legro RS. Polycystic ovary syndrome: a guide to clinical management; Defining the polycystic ovary syndrome. Taylor & Francis group, 2005: 7-22. 4) Conway GS, Honour JW, Jacobs HS. Heterogeneity of the polycystic ovary syndrome: clinical, endocrine and ultrasound features in 556 patients. Clin Endocrinol 1989; 30: 459–470. 5) Legro RS, Kunselman A, Dodson WC, Dunaif A. Prevalence and predictors of risk for type 2 diabetes mellitus and impaired glucose tolerance in polycystic ovary syndrome: a prospective, controlled study in 254 affected women. J Clin Endocrinol Metab 1999; 84: 165-169. 6) Orio F Jr, Palomba S, Spinelli L et al. The cardiovascular risk of young women with polycystic ovary syndrome: an observational, analytical, prospective case-control study. J Clin Endocrinol Metab 2004; 89: 3696-3701. Erratum in: J Clin Endocrinol Metab 2004; 89: 5621. 7) Strauss JF 3rd. Some new thoughts on the pathophysiology and genetics of polycystic ovary syndrome. Ann N Y Acad Sci 2003; 997: 42-48. 8) Gharani N, Waterworth DM, Batty S et al. Association of the steroid synthesis gene CYP11a with polycystic ovary syndrome and hyperandrogenism. Hum Mol Genet 1997; 6: 397-402. 9) Developmental origin of polycystic ovary syndrome- a hypothesis. J Endocrinol 2002; 174: 1-5. 10) Genetics of ovarian disorders: polycystic ovary syndrome. Rev Endocr Metab Disord 2004; 5: 69-76. 11) Strachan T, Read AP. Human Molecular Genetics; Instability of the human genome: mutation and DNA repair. Garland Science (Taylor & Francis Group), 2003: 316-349. 12) Amato P, Simpson JL. The genetics of polycystic ovary syndrome. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol 2004; 18: 707-718. farm vestn 2007; 58 27 Raziskovalni œlanek – Research article 13) Urbanek M, Legro RS, Driscoll DA et al. Thirty-seven candidate genes for polycystic ovary syndrome: strongest evidence for linkage is with follistatin. Proc Natl Acad Sci 1999; 96: 8573-8578. 14) Spielman RS, Ewens WJ. The TDT and other family-based tests for linkage disequilibrium and association. Am J Hum Genet 1996; 59: 983-989. 15) Wood JR, Nelson VL, Ho C et al. The molecular phenotype of polycystic ovary syndrome (PCOS) theca cells and new candidate PCOS genes defined by microarray analysis. J Biol Chem 2003; 278: 26380-26390. 16) Diao FY, Xu M, Hu Y et al. The molecular characteristics of polycystic ovary syndrome (PCOS) ovary defined by human ovary cDNA microarray. J Mol Endocrinol 2004; 33: 59-72. 17) Jansen E, Laven JS, Dommerholt HB et al. Abnormal gene expression profiles in human ovaries from polycystic ovary syndrome patients. Mol Endocrinol 2004; 18: 3050-3063. 18) Wood JR, Ho CK, Nelson-Degrave VL et al. The molecular signature of polycystic ovary syndrome (PCOS) theca cells defined by gene expression profiling. J Reprod Immunol 2004; 63: 51-60. 19) Oksjoki S, Soderstrom M, Inki P et al. Molecular profiling of polycystic ovaries for markers of cell invasion and matrix turnover. Fertil Steril 2005; 83: 937-944. 20) Ukkola O, Rankinen T, Gagnon J et al. A genome-wide linkage scan for steroids and SHBG levels in black and white families: the HERITAGE Family Study. J Clin Endocrinol Metab 2002; 87: 3708-3720. 21) OMIM*182205. On Line Mendelian Inheritance in Man (OMIM): http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=OMIM 22) Hogeveen KN, Talikka M, Hammond GL. Human sex hormone-binding globulin promoter activity is influenced by a (TAAAA)n repeat element within an Alu sequence. J Biol Chem 2001; 276: 36383-36390. 23) Xita N, Tsatsoulis A, Chatzikyriakidou A, Georgiou I. Association of the (TAAAA)n repeat polymorphism in the sex hormone-binding globulin (SHBG) gene with polycystic ovary syndrome and relation to SHBG serum levels. J Clin Endocrinol Metab 2003; 88: 5976–5980. 24) Cousin P, Calemard-Michel L, Lejeune H et al. Influence of SHBG gene pentanucleotide TAAAA repeat and D327N polymorphism on serum sex hormone-binding globulin concentration in hirsute women. J Clin Endocrinol Metab 2004; 89: 917-924. 25) Hogeveen KN, Cousin P, Pugeat M et al. Human sex hormone-binding globulin variants associated with hyperandrogenism and ovarian dysfunction. J Clin Invest 2002; 109: 973-981. 26) Hilpert J, Vorum H, Burmeister R et al. Efficient eukaryotic expression system for authentic human sex hormone-binding globulin. Biochem J 2001; 360: 609-615. 27) Jänne M, Deol HK, Power SGA et al. Human sex hormone-binding globulin gene expression in transgenic mice. Mol Endocrinol 1998; 12: 123-136. 28) Franks S. Genetic and environmental origins of obesity relevant to reproduction. Reprod Biomed Online 2006; 12: 526-531. farm vestn 2007; 58