Znanstvena razprava --------------------------~~ GDK: 165:174.1 Picea abies (083 .8) (063) Razvoj molekularne baze podatkov za smreko in možnost razlikovanja treh provenienc na podlagi molekularnih markerjev Development L~f mo/endar database for Nor way spru.ce and the possibility of distinguishing three provenances on the basis of molentlar nwrkers Marjana PUČKO\ Gregor BOŽIČ 2 , Hojka KRAIGHER 3 Izvleček: Pučko, M., Božič, G., Kraigher, H.: Razvoj molekularne baze podatkov za smreko in možnost razlikovanja treh provenienc na podlagi molekulam ih markerjev. Gozdarski vestnik 63/2005, št. 9. V slovenščini, z izvlečkom in povzetkom v angleščini, ci t. Lit. 26. Prevod v angleščino: avtorji. Lektura angleškega besedila Jana Oštir. Predstavljen je začetek razvoja molekularnih baz podatkov na primeru smreke s pomočjo STS in EST molekulam ih marker jev. Analizirali smo 3 provenience smreke (Leskov grm, Hrušica, Konačnik). Markerji so se izkazali kot potencialno primerni za razlikovanje provenienčnih območij vendar bi bilo potrebno z molekularnin1i analizami raziskati večje število vzorcev, da bi lahko potrdili obstoječo razmejitev provenienčnib območij na osnovi ekoloških kriterijev. Za boljšo moč razlikovanja med posameznimi proveniencami in identifikacijo posameznikov ter učinkovito kontrolo nad pridobivanjem gozdnega reproduk­ cijskega materiala bo potrebna nadgradnja baze z bolj polimorfniroi markerji. Ključne besede: smreka, Picea abies L. (Karst.), gozdni reprodukcijski material, molekularni markerji, molekularna baza podatkov Abstract: Pučko, M., Božič, G., Kraigher, H.: Development of molecula.r database for Nor way spruce and the possibility of distinguishing three provenances on the basis of molecular markers. Gozdarski vestnik, Vol . 63/2005, No. 9. In Slovene, with abstract and summary in English, lit. quot. 26. Translated into English by the authors. English language editing by Jana Oštir. The introductory development of molecular databases with STS and EST DNA marker s is presented on the example of 3 prov­ enances ofNorway spruce (Leskov grm, Hrušica, Konačnik). The selected DNA markers proved to be potentially suitable for the discrirnination of provenance regions. However, analyses of more samples are needed throughout Slovenia to confirm the existing ecologically based delineation of provenance regions. Expanding the database with the use of more polymorphic markers is necessary to increase the capability of discriminating between different provenances and individuals. Keywords: Norway spruce, Picen nbies L. (Karst.), forest reproductive material, molecular markers, molecular database 1 UVOD INTRODUCTION Krajevna populacija je množica osebkov iste drevesne vrste v nekem ekološko enotnem pros­ toru, ki s cvetenjem in semenenjem oblikujejo genetsko svojevrstnost kot rezultat prilagajanja danemu okolju. V gozdnem semenarstvu moramo upoštevati krajevne populacije z njihovo genetsko svojevrstnostjo, da se lahko izognemo napačnemu izboru porekla semena za dano rastišče. Zato je seme potrebno pridobivati iz ustreznih semenskih virov. Genetska variabilnost omogoča populaciji ekološko prilagodljivost na spremenjene razmere okolja in je tako pogoj za preživetje. Pri nabiranju semena je zato potrebno zajeti dovolj veliko genet­ sko variabilnost, kar zahteva nabiranje semena na GozdV 63 (2005) 9 večjem številu dreves in na večji gozdni površini. Velja splošna smernica, da naj bi se seme nabi­ ralo z najmanj 25 semenskih dreves, ki so med seboj zadosti oddaljena in domnevno nesorodna (SCHMIDT 2000). Število dreves, s katerih naj bi se seme pridobivalo v Sloveniji, je na podlagi strokovne ocene navedeno v odločbi za odobritev gozdnega semenskega objekta, izdani na podlagi Zakona o gozdnem reprodukcijskem materialu (2002), Pravilnika o seznamu drevesnih vrst in 1 M.P. univ. dipl. inž. gozd. Gozdarski inštitut Slovenije, Večna pot 2, 1000 Ljubljana 2 Dr. G. B. Gozdarski inštitut Slovenije, Večna pot 2, 1000 Ljubljana 3 Doc. dr. H.K. Gozdarski inštitut Slovenije, Večna pot 2, 1000 Ljubljana 355 Pučko , M ., Božič , G., Kraigher, H.: Razvoj molekulam~ baze podatkov za smreko . umetnih križancev (2002), Pravilnika o pogojih za odobritev gozdnih semenskih objektov v kate­ gorijah "znano poreklo" in ''izbran" ter o seznamu gozdnih semenskih objektov (2003) in Pravilnika o določitvi provenienčnih območij (2003). Na podlagi Pravilnika o potrdilih in glavnih spričevalih za gozdni reprodukcijski material (2004) mora odgovorna strokovna oseba dobavitelja, ki spremlja pridobivanje reprodukcijskega materiala v gozdnem semenskem objektu, dnevno posredovati pooblaščeni osebi za nadzor (Gozdarski inštitut Slovenije - GIS) vzorec semenskega materiala od vsakega drevesa, s katerega se je semenski material pridobil in sicer za vrste iz rodu Picea po 1 storž na drevo. Ti vzorci postanejo del slovenske gozdne genske banke in so kot referenčni vzorci namenjeni za potrebe molekularne identifikac0e gozdnega reprodukcijskega materiala (GRL\1), sledljivosti GRM in genetske analize populacij. Podatki o DNA zapisu posameznih osebkov so shranjeni v molekularni bazi podatkov, katere skrbnik je GIS. Genetski markerji, kamor uvrščamo tudi mole­ kularne ali DNA markerje, so dedni polimorfni znaki, ki neposredno odražajo spremembe v zaporedju DNA na nuk.Jeotidni ravni ali posredno na ravni genske ekspresije (SCHUBERT et al. 2001). DNA markerji niso podvrženi vplivom okolja, so potencialno številčno neomejeni in predstavljajo objektivno mero variacije. Poleg možnosti identifikacije posameznikov omogočajo tudi vpogled v genetsko strukturo posameznih populacij in so pomembno orodje za preučevanje genetske diverzitete, migracijskih poti in odnosov med osebki znotraj in med populacijami. Hkrati omogočajo oceniti, ali je določena mešanica semena (partija), pridobljena iz odobrenega gozdnega semenskega objekta, tudi z genetskega Preglednica 1: Izvor in kratek opis vzorcev Table 1: Ori gin and short description of the sam ples vidika (nevarnost inbridinga) primerna za setev ali sadnjo v gozdovih. Zadosti polimorfni molekularni markerji omogočajo na podlagi pridobljenih referenčnih vzorcev s posameznih semenskih dreves identifi­ kacijo vira semena in števila dreves, ki prispevajo seme v posamezno partijo. Kot najboljši markerji za identifikacijo in analizo starševstva so se izkazali mikrosateliti (tandemske ponovitve DNA krajše od 150 bp z enoto ponovitve 1 do 6 bp). Obstajajo študije za hraste (DOW 1 ASHLEY 1996, LEXER etal.1999),jelko (CREMERetal. 2003) inkosta­ njeve kultivarje (BOTTA et al2004). Za smreko (Picea abies L. (Karst.)) je prišlo do pospešenega razvoja mikrosatelitov v zadnjih letih (SCOTTI et al. 2002a, SCOTTI et al. 2002b, BESNARD et al. 2003), vendar le-ti še niso bili uporabljeni za analize naravnih populacij smreke. V Sloveniji smo se poizkusno odločili za sistem izgradnje molekularne baze podatkov z STS (»sequence tag site« - kratka zaporedja DNA, ki so lahko prepoznavna in se nahajajo le na enem mestu v genomu) in EST (»expressed sequence tag«- poli­ morfizem izraženega kodirajočega genomskega zaporedja) markerji, ki so manj polimorfni od mikrosatelitov, vendar je njihova analiza eno­ stavnejša in ekonomsko ugodnejša. 2 METODE 2 METHODS Analizirali smo 3 provenience smreke, ki so pri­ padale izbranim gozdnim semenskim objektom na Mašunu (Leskov grm), Hrušici (Hrušica) in Pohorju (Konačnik). Za ekstrakcijo DNA iz klice posameznega semena, ki je pripadal določenemu drevesu, Provenienca Leskov grm Hrušica Konačnik Identifikacijska številka semenskega objekta 6.0131 6.0137 2.0173 Provenienčno območje Dinarsko Dinarsko Pohorsko Nadmorska višina 850-900 750-800 850-900 Izvor neavtohton (2. generacija) avtohton neznan Velikost vzorca 57 30 39 356 GozdV 63 (2005) 9 _______ P_ uc _ - l< _ o.:._, M -----'--.,_ B_ o_ žič , G., Kraigher. H.: Razvoj molekularne baze podatkov za smreko .. . smo uporabili DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Nemčija) z manjšimi modifikacijami protokola proizvajalca (dodatek PVP in aktivnega oglja). Za PCR-RFLP smo uporabili pare začetnih oligonukleotidov ali primerjev (temperatura vezave primerjev v °C) Sb17 (57), Sb42 (56), Sb51 (55), Sb58 (57), Sb70 (57) (PERRY 1 BOUSQUET 1998), PA0002 (55) and PA0055 (55) (SCHUBERT et al. 200 1) v kombinaciji z restrikcijskimi encimi Alui, Afai, Haeiii in Drai. PCR-RFLP produkte smo z gelsko elektroforezo ločili na 2% agaroznem gelu in jih opazovali v UV območju s pomočjo obarvanja z etidijevim bromidom. Za vsako provenienco smo izračunali najnižjo frekvenco alelov v demu, ki jih z vzorci dane velikosti zasledimo (GREGORIOUS 1980). Izra­ čunali smo frekvence alelov in genotipov, gensko diverziteto in fiksacijski indeks F 1 s. Hipotezo o naključnem združevanju gamet ( odklone od Hardy-Weinbergovega ravnotežja) smo preverili s Hardy-Weinbergovim eksaktnim testom po HALDANU ( 1954; ci t. po RAYMOND 1 ROUSSET 1995). Gre za verjetnostni test, v katerem je verjet­ nost opaženega vzorca uporabljena za definicijo območja zavrnitve hipo teze. Za testiranje ničelne hipoteze ob upoštevanju vseh lokusov znotraj populacije smo uporabili Fisherjevo metodo (GenePop). Stopnja genetske diferenciacije med proveniencami je bila kvantificirana kot Neijeva genetska razdalja (NEI 1972), ki je mera števila alelnih sprememb na loku s in temelji na frekvencah genov. Izračunali smo tudi genetsko razdaljo po WRIGHTU (1978). Izračunali smo oceno za verjetnost identitete P, 0 po formuli (PAETKAU et al. 1995): P,D = I_p,' + I_I_(2p,pJ kjer s~ P; in p.i 1 frekvence i-tih in j-tih alelov. Da bi preverili, ali lahko s pomočjo genetske razdalje določiš izvor neznanega vzorca (pri­ padnost domnevni provenienci), smo s pomočjo slučajnostnih števil za vsako provenienco simulirali po 3 vzorce, ki naj bi pripadali neznani partiji semena. Izračunali smo skupne genetske razdalje (NEl 1972, WRIGHT 1987) in uporabili UPGMA metodo (metoda nepondirane aritmetične sredine) za prikaz grupiranja vzorcev. GozdV 63 (2005) 9 Izračuni kazalcev za uporabo v populacijski genetiki so bili narejeni s programi TFPGA (MILLER 1997), GenePop (RAYMOND 1 RO US­ SET 1995) in Fstat (GOUDET 2002). 3 REZULTATI 3 RESULTS 3.1 Primernost izbranih molekularnih markerjev 3.1 Usefulness of selected molecular marker s Od sedmih uporabljenih markerjev jih je bilo za nadaljnjo analizo primernih S. Njihova povpre­ čna stopnja uspešnosti PCR je bila 0,90. Zaradi neuspešnega pomnoževanja kljub optimizaciji pogojev PCR (zniževanje temperature vezave primerjev, spremembe koncentracije reagentov) smo iz nadaljnje analize izključili lokus PA0002. Neuspešnost pomnoževanja je verjetno posledica izpada, vnosa ali zamenjave nukleotida na mestu vezave primerja. Lokus Sb42 smo iz obdelave podatkov izključili zaradi velikega števila hete­ rodupleksov, ki so se pojavljali na tem lok:usu. S kombinacijo preostalih S parov primerjev smo odkrili 3 7 različnih genotipov. Osebke brez določenega genotipa na enem lokusu smo pri določanju celotnega genotipa izločili. Preglednica 2: Verjetnost identitete P 1 D Table 2: Probability of identity Pm Prove- Leskov Hrušica Konačnik ni enca grm pro 0,023 0,018 0,013 Skupaj 0,018 Ocena verjetnosti identitete P 10 pove, kakšna je verjetnost da imata 2 naključno izbrana osebka identični genotip. S kombinacij o 5lokusov Sb 17, Sb51, Sb58 Sb70 in PA0055 je ta verjetnost za posamezno populacijo med 0,013 in 0,023. Vrednost 0,013 pomeni, da v 987 primerih od 1.000 razločimo dve naključno izbrani drevesi iz populacije. Vrednost PID dobljena z izoen­ cimskimi genskimi markerji pri jelki z analizo 11 polimorfnih !okusov v Nemčiji je znašala 0,043 (CREMER et al. 2003). V raziskavi, ki je omogočila individualno identifikacijo kanadskih medvedov z analizo jedrnih mikrosatelitov,)Eblla ~57 Pucko, M .. Boi.ic. G., Kraigher, H.: RazvoJ molekularne baze podatkov za smreko 1 ---- - -- - o' 9 - ·- ·---- -- ---------····-· · ··--·~·-·· · -··- ·--- - - --- - - ----····- > 0,8 ------- - ... - - ---------- · -- --- ~ 0,7 __ ___ " ____ __ ____ ___ _ __ _ ~ 0,6 -+------- ....,_ _ _ _ _ g 0,5 --- - 111 Leskov grm o Hrušica 0,) > 0,4 r- ~ D Konačnik 1-- ~ 0,3 lL 0,2 O, 1 - r- O . - n 8817 - 1-- - 1 1 ' A1 ; A2; A1 A2 8851 SB58 1~ -- 1 ! -ro- ~ A1 1 A2 . A1 1 A2 8b70 PA0055 Ll 1 A1 1A21 A3 -------------------------------------~ Grafikon 1: Prikaz frekvence alelov na posameznem genskem lok usu za provenience smreke Leskov grm, Hrušica in Konačnik Gmp!J 1: Alle/e frequencies on individual gene loci for Norway spruce provenances Leskov grm, Hrušica and Konačnik vrednost Pm velikostnega reda 10· 7 (PAETKAU et al. 1995). Verjetnost identitete, dobljena s STS in EST markerji za preučevane populacije smreke v Sloveniji je previsoka, da bi lahko omogočila individualno identifikacijo osebkov. 3.2 Genetske analize provenienc 3.2 Genetic analyses of provenances Alelna ali genska frekvenca je mera pogostnosti določenega alela v populaciji. Od analiziranih lokusov se je za najbolj informativnega izkazal lokus Sbl7, kjer smo v provenienci Konačnik zasledili alel A3, ki ni bil prisoten v ostalih dveh proveniencah (grafikon 1). Ob predpostavki, da je populacija v Hardy-Weinbergovem (HW) ravnotežju, smo pri provenienci Leskov grm, ki jo predstavlja vzorec velikosti 57, z verjetnostjo 0,95 zasledili vse al ele, ki se v populaciji pojavljajo s frekvenco večjo ali enako 0,05, pri provenienci Hrušica s frekvenco večjo ali enako 0,09, pri pro­ venienci Konačnik pa 0,07. Sklepamo lahko, da je alel A3 značilen za provenienco Konačnik. Da bi to potrdili, bi bilo potrebno analizirati še nekaj provenienc iz istega provenienčnega območja. V primeru, da se alel A3 ne bi pojavil v nobeni od 358 ostalih provenienc, bi bil nedvoumen kazalec za provenienco Konačnik. Na podlagi frekvenc genotipov smo izračunali gensko diverziteto oziroma pričakovano heterozigot­ nost (H 1 ) glede na HW ravnotežje in jo primerjali z opaženo oziroma dejansko heterozigoznostjo (H 0 ), ki predstavlja število heterozigotovvvzorcu. Genska diverziteta pove, koliko variacije obstaja v populaciji in kako je le-ta razporejena. Opažena genska diver­ ziteta H 0 je bila najmanjša za lokus Sb70 (med 0,15 za provenienco Leskov grm in 0,28 za provenienco Konačnik) in največja za lokus Sb17 (0,44 za prove­ nienci Leskov grm in Hrušica in 0,51 za provenienco Konačnik), ki je tudi najbolj informativen. Preglednica 3: Prikaz koeficientov inbridinga (F 15 ) na petih genskih lokusih in skupaj za 3 vzorčene provenience smreke Table 3: Inbreeding coeficient (F 1 J at 5 gene laci and combined for 3 sampled Norway spruce provenances Leskov grm Hrušica Konačnik SB17 0,218 -0,448 -0,418 SB51 0,313 -0,273 0,199 SB58 0,007 -0,478 -0,022 Sb70 -0,078 -0,115 -0,188 PAOOSS -0,233 -0,132 -0,239 Skupaj 0,052 -0,308 -0,145 GozdV 63 (2005) 9 _ ___ _ _ _ Pu~~~ · M., Božič , G., Kraigher, H.: Razvoj molekularne baze podatkov za smreko _ _ 0,9 ~------------ 0,8 > -- - - ------ -- ---- --- _____________ __ " _ ___ _ o a. 0,7 ---!---1 '1------------ - - · 1---- - -- - - - - , ~ 0,6 - ----------- ------ - ------- ----- - - ----1 1----- -· 1' 1 - - - - - ----- · c Q) O) 0,5- - - --- - - --11-1 1-- 1-----lt- - -- r-- - - 1 - • Leskov grm O Hrušica ro g 0,4 -'-- Q) > ~ Q) L... t- - - ------- -- - ---- 1- 1---------- - - 1--- O Konačnik · -·-···-··-·- 1----- 1----- f-- 1 1 1--- -· 1--- u.. 0,3 0,2 0,1 0,0 ~- ~ ~ ,tl- ~~- H -k, 11 1 12 b 133 i 11 112 : 22 11 1 12122 ~ 11 112,22 11 ,12,22 SB17 SB51 SB58 Sb70 PA0055 Grafikon 2: Prikaz frekvenc genotipov na posamezneih genskih lokusih za provenience smreke Leskov grm, Hrušica in Konačnik. Gra ph 2. Genotype frequency on individual gene loci Jor Nor way spruce provenances Leskov grm, Hrušica and Konačnik Fisherjev eksaktni test, s katerim smo testirali ničelno hipotezo o naključnem združevanju gamet (HW ravnotežje), je pokazal, da vzorčena provenienca Konačnik odstopa od HW ravno­ težja (p = 0,005), kar je posledica prisotnosti alela A3 na lokusu Sb17. Alel A3 se je pojavil le v enem osebku in sicer v homozigotnem stanju. Zaradi unikatnosti homozigota z alelom A3 smo identifikacijo tega osebka ponovili in dobili enak rezultat. Za ostale lokuse ničelne hipoteze pri tveganju 0,05 nismo mogli zavrniti. Odstop od HW ravnotežja je bil značilen tudi za lokus Sb51 pri provenienci Leskov grm (p :::: 0,024), vendar hipoteze o naključnem združevanju gamet ne moremo zavrniti (p = 0,247) ob upoštevanju rezultatov vseh štirih lokusov. Na podlagi heterozigotnosti smo izračunali F­ statistiko, ki je statistično orodje za oceno variacije v frekvencah genov. F 1 s ali koeficient inbridinga ocenjuje variacija v posameznikih relativno na variacij o v subpopulacijah. V primeru pozitivne vrednosti gre za pomanjkanje heterozigotov, kar nakazuje na oploditev med sorodniki. Koeficient inbridinga je povezan z medsebojno razdaljo dreves, s katerih se seme nabira, saj verjetnost, da so drevesa sorodna, pada z večanj em razdalje med GozdV 63 (2005) 9 semenskimi drevesi. Če je v semenskem sestoju in/ ali v semenski mešan ici prisoten večji primanjkljaj heterozigotov (inbriding), je potrebno pretehtati, ali je tak sestoj sploh primeren za semenski objekt in ali je partija primerna za nadaljnjo uporabo semena v gozdarstvu. Na podlagi analize petih lokusov skupaj vidimo, da je za semenska drevesa za provenienci Hru­ šica in Konačnik prisoten presežek (F 15 < O), za provenienco Leskov grm pa manjši primanjkljaj heterozigotov (F 1 s > O). Ker je primanjkljaj hete­ rozigotov blizu vrednosti O, je seme nabrana iz semenskih dreves primerno za nadaljnjo uporabo GRM. V primeru velikega F 1 s lahko posumimo, da je bilo seme nabrana z dreves, ki rastejo eden ob drugem (npr. šopi), ne pa z dreves, ki so med seboj oddaljena za 1 do 2 drevesni višini, kar velja za splošno smerni co pri pridobivanju GRM. 3.3 Razlikovanje posameznikov in provenienc 3.3 Differentiation of individuals and provenances Razlike med proveniencami smo kvantificirali z merilom genetske razdalje, ki povzame frek­ vence alelov v skupno mero diferenciacije za pare 3 5 9 _______ Pučko , M .. Božič , G .• l Hrušica) in provenienco Konačnik s pohorskega provenienčnega območja . Genetska razdalja, izračunana na podlagi upo­ rabljenih molekularnih markerjev, ni zadosti informativna, da bi na podlagi le te mogli trditi, GozdV 63 (2005) 9 da neznani vzorec izhaja iz provenience Leskov grm ali Hrušica, omogoča pa ugotovitev, da vzorec izvira iz dinarskega ali pohorskega pro­ venienčnega območja. Drevo, dobljene z uporabo UPGMA metode, prikaže rezultate v bolj pregledni grafični obliki (slika 2). Jasno ločimo dva grozda za dinarsko in pohorsko provenienčno območje, medtem ko ločitev med proveniencama Leskov grm in Hrušica ni zadosti jasna. 4 DISKUSIJA 4 DISCUSSION Molekularne baze podatkov omogočajo spremljavo genetske variabilnosti znotraj in med različnimi populacijami v času in prostoru. Z uporabo zadosti polimorfnili in informativnih marker jev so dober pripomoček pri nadzoru pridobivanja GRM. Na Gozdarskem inštitutu Slovenije smo se odločili za izgradnjo molekularne baze podatkov z uporabo STS in EST markerjev, ki jih za izgradnjo baze podatkov uporabljajo tudi na Bavarskem. Ti markerji omogočajo neposredno primerljivost genetske variabilnosti populacij in GRM, kar je potrebno v primeru proste trgovine z GRM. 361 _ ______ P _u_ č_ ko . M., Božič , G., Kraigher. H.: Razvoj molekulamebazepodatk _ o _ v_ za _s _ m _ re _k _ o_ .. _ . _ _ ___ _ Na podlagi ugotovitev analize treh populacij s sedmimi markerji smo ugotovili, da je pet markerjev potencialno primernih za osnovanje molekularne baze podatkov, v katero je potrebno vključiti dodatne DNA markerje, kot so mikro­ sateliti, ter nove EST in STS markerje za doseganje večje ločljivosti posameznikov in provenienc. Pomemben kazalec primernosti izbire semen­ skih dreves je koeficient inbridinga, ki v primeru pozitivne vrednosti nakazuje na oploditev med sorodniki. Inbriding lahko povzroči znatno zmanj­ šanje rastnosti prizadetih osebkov. Pri smreki so ugotovili, da parjenje med sorodstveno bolj oddaljenimi osebki zmanjša prirastek volumna debla za 7%, parjenje med bližnjimi sorodniki pa za 28% (ERIKSSON 1 EKBERG 2001). Zato je izbira semenskih dreves z zadostno medsebojno razdaljo nujna, pregled z genetskimi markerji pa nam omogoči potrditev primernosti semenskega materiala za uporabo v gozdarstvu. Za kvantifikacij o razlik med proveniencami 1 populacijami se je dobro izkazala genetska raz­ dalja. BOŽIČ et al. (2003) so na podlagi analize genetskih razdalj z izoencimskimi genskimi markerji pri smreki ugotovili, da je potrebno populacije osrednjega dinarskega fitogeograf­ skega območja ločevati od populacij alpskega fitogeografskega območja. Na podlagi analize 3 provenienc iz dveh provenienčnih območij smo z DNA markerji ugotovili, da se populacija iz pohorskega območja jasno loči od populacij iz dinarskega območja. Rezultati obeh raziskav tudi potrjujejo primernost razdelitve Slovenije na provenienčna območja oziroma delitev na dinarsko in nedinarsko (alpsko, pohorsko) območje. Za ostala provenienčna območja trenutno še ni na voljo podobnih genetskih raziskav. S simulacijo smo pokazali, da lahko dolo­ čeno partijo semena uvrstimo v provenienčno območje, ne moremo pa ločiti dveh partij, ki pripadata dvema proveniencama znotraj istega provenienčnega območja. DNA markerji, ki bi omogočili analizo dodatnih lokusov, bi povečali moč razlikovanja med posameznimi provenien­ cami. Zato bomo izgradnjo baze nadaljevali z uporabo novih EST markerjev in mikrosatelitov, ki naj bi zaradi večje polimorfnosti omogočili tudi 362 identifikacijo posameznih osebkov in tako nepo­ sreden nadzor nad številom dreves, ki prispevajo seme v posamezno partijo. Zaradi ohranjanja prilagoditvenega potenciala populacij gozdnih drevesnih vrst v prihodnosti je nujno zagotoviti široko genetsko osnovo GRM:. Molekularne baze omogočajo oceno genetske variabilnosti v naravnih populacijah in sprem­ ljavo primernosti GRM za nadaljnjo uporabo v gozdarstvu. Za popolno učinkovitost trenutne baze molekularnih podatkov pa je le-to potrebno razširiti z uporabo dodatnih DNA markerjev in analizo večjega števila populacij. 5 POVZETEK Molekularne baze podatkov omogočajo spremljavo genetske variabilnosti znotraj in med različnimi populacijami v času in prostoru. Z uporabo zadosti polimorfnih in informativnih markerjev so dober pripomoček pri nadzoru pridobivanja GRM. Na GIS smo se odločili za izgradnjo molekularne baze podatkov z uporabo STS in EST markerjev. Genetski profil osebkov je bil določen s PCR­ RFLP z vizualizacijo na agaroznem gelu s pari primerjev Sbl7, SbSl, Sb58, Sb70 in PAOOSS v kombinaciji z restrikcijskimi encimi Alui, Afal, Haeiii in Dra I. Referenčne vzorce, ki predstavljajo posamezno provenienco, smo opisali z genetskimi kazalci (frekvenca alelov, frekvenca genotipov, verjetnost identitete P 10 , odklon od HW ravnotežja, genska diverziteta, fiksacijski indeks F 15 , genetska razdalja). S slučajnostnimi števili smo simulirali vzorce, ki naj bi pripadali partiji semena in s pomočjo genetskih razdalj ugotavljali pripadnost vzorcev partij referenčnim vzorcem. Za najbolj informativnega se je izkazallokus Sbl7. Odklon od HW ravnotežja je bil priso­ ten v provenienci Konačnik zaradi prisotnosti homozigota z unikatnim alelom. Presežek hete­ rozigotov je bil opažen pri proveniencah Hrušica in Konačnik, majhen deficit pa pri provenienci Leskov grm. Genetska razdalja med dinarskima proveniencama je bila manjša kot med njima in pohorsko provenienco. S pomočjo simulira­ nih vzorcev treh provenienc smo ugotovili, da lahko vzorec iz partije povežemo z dinarskim ali pohorskim provenienčnim območjem ne pa s provenienco samo. GozdV 63 (2005) 9 Pučko. M .. Božič. G., Kraigher, H. : Razvoj molekularne baze podatkov za smreko ... Zaradi ohranjanja prilagoditvenega potenciala populacij gozdnih drevesnih vrst v prihodnosti je nujno zagotoviti široko genetsko osnovo GRL\1. Molekularne baze omogočajo oceno genetske variabilnosti v naravnih populacijah in sprem­ ljavo primernosti GRM za nadaljnjo uporabo v gozdarstvu. Za popolno učinkovitost trenutne baze molekularnih podatkov pa je le-to potrebno razširiti z uporabo dodatnih DNA markerjev in analizo večjega števila populacij. 6 SUMMARY Molecular databases enable the monitoring of gene­ tie variability within and among different popu­ lations in time and space. The use of informative polymorphic marke rs is a good tool for controlling forest reproductive material (FRM) acquisition. At the Slovenian Forestry Institute we decided to establish a molecular database for Norway spruce with the use of STS and EST markers. PCR-RFLP (Sbl7, Sb5l, Sb58, Sb70 and PA0055 in combination with restriction enzymes Alui, Afal, Haeiii in Dral) with agarose gel elec­ trophoresis was used to determine the genetic profile of individuals in the reference samples. Allele and genotype frequencies, probability of identi ty, deviations from Hardy-Weinberg (HW) equilibrium, gene diversity, F 15 and genetic distan­ ces were calculated. With the help of random numbers seedlot samples were simulated to see whether genetic distances could be used to link the seedlot sample to the reference samples and thus determine their origin. Sb 17 turn ed out to be most informative of the examined loci. Deviations from the HW equilibrium were present in the Konačnik pro­ venance due to one homozygote with a unique allele. An excess ofheterozygotes was present in the Hrušica and Konačnik samples, while' a small deficit was no ted for the Leskov grm sample. The genetic distance for samples belonging to the same provenance region was smaller than the genetic distance of these two samples from the Pohorje provenance region sample. Simulations showed that seedlot samples could be linked to the Dinaric or to the Pohorje provenance region but not to an individual provenance - based on the data from five loci. GozdV 63 (2005) 9 A broad genetic base of FRM is necessary to safeguard the adaptation potentia1 of a spe­ des. Molecular databases enable evaluation of genetic variability in natural populations and suitability of FRM. For our database to become fully operational, additional polymorphic loci and a large number of populations shall need to be examined. 7 VIRI 7 REFERENCES BESNARD, G. 1 ACERE, V 1 FAIVRE-RAMPANT, P. 1 FAVRE, J . M. 1 JEANDROZ, S., 2003. A set of cross­ spccies amplifying microsatellite markers developed from DNA sequence databanks in Picea (Pinaceae).­ Molecular Ecology Notes, 3, s. 380-383. BOTTA, R. 1 TORELLO MARIONI, D. 1 BOUNOUS, G., 2004. Molecular markers and certification. -V: Proceedings from the Workshop Biotechnologia Foresta!, Global biotechnology forum, Concepcion, Chile, 2.-5. 3. 2004, s. 63-73 BOŽIČ, G. 1 KONNERT, M. 1 ZUPANČIČ, M. 1 KRAIGHER, H., 2003. Genetska diferenciacija avtohtonih populacij smreke (Picea abies (L) Karst.) v Sloveniji, ugotovljena z analizo izoencimov.- Zbornik gozdarstva in lesarstva, 71, s. 19-40 CREMER, E. 1 LIEPELT, K. 1 ZIEGENHAGEN, B. 1 HUSSENDORFER, E., 2003. Microsatellite and isozyme markers for seed source identification .in silver fir.- Forest Genetics, 10, 3, s. 165-170. DOW, B.D. 1 ASHLEY, M.V., 1996. Microsatellite analysis of seed dispersal and paren ta ge of saplings in bur o ak, Quercus macrocarpa.- Mol Ecol, 5, s. 615-627 GREGORIOUS, H.R., 1980. The probability oflosing an allele when diploid genotypes are sampled. Biometrics 36:632-652 ERIKSSON, G. 1 EKBERG, I., 2001. An Introduction to Forest Genetics. Uppsala, SLU Repro, 166 s. GOUDET, J., 2002. Fstat, verzija 2.9.3.2. URL: http:// wwv;2.unil.ch/izea/softwares/fstat.html KONNERT, M. 2004. Molekularne baze na Bavarskem, ASP Teisendorf, Teisendorf, Nemčija (1.4.2004) LEXER, C. 1 HEINZE, B. 1 STEINKELLNER, H. 1 KAMPFER, S. 1 ZIEGENHAGEN, B. 1 GLOSSL, J., 1999. Micro satellite analysis of maternal half-sib families of Quercus rob ur, pedunculate o ak: detection of seed contaminations and inference of the seed parents from the offspring.- Theor Appl Genet, 99, s. 185-191. MILLER, M.P., 1997. Tools for population genetic analysis. Department ofBiological Sciences, Northern Arizona University, Flagstaff, Arizona (verzija 1.3). 363 ___ ____ P _učko, M .. Božič. G., Kraigher, H.: Razvoj molekularne baze podatkov .za smreko .. _ . ____ __ _ NEl, M., 1972. Genetic distance between populations. - Am. Nat. 106:283-292 PAETKAU, D. 1 CALVERT, W 1 STIRLING, I. 1 STROBECK, C., 1995. Microsatellite analysis of population structure in Canadian polar bears.­ Molecular Ecology, 4, s. 347-354. PERRY, D. J. 1 BOUSQUET, J., 1998. Sequence-Tagged­ Site (STS) Markers of Arbitrary Genes: Development, Characterisation and Analysis of Linkage in Black Spruce.- Gene tie s, 149, s. 1089-1098. Pravilnik o določitvi provenienčnih območij.- Ur.l. RS. 72/2003. Pravilnik o pogojih za odobritev gozdnih semenskih objektov v kategorijah "znano poreklo" in "izbran': ter o seznamu gozdnih semenskih objektov.- Ur.l. RS 91/2003. Pravilnik o potrdilih in glavnih spričevalih za gozdni reprodukcijski material.- Ur.l. RS 19/2004. Pravilnik o seznamu drevesnih vrst in umetnih križancev.­ Ur.l. RS 83/2002. RAYMOND, M. 1 ROUSSET, F., 1995. GENEPOP: population genetics software for exact tests and ecumenicism. J. Heredity, 86:248-249 (verzija 3.4) SCHMIDT, L., 2000. Genetic implications of seed handling.- ln: Guide to Handling of Tropical and 364 Subtropical Forest Seed, Danina Forest Seed Centre. s. 511 SCHUBERT, R. 1 MUELLER-STARCK. G. 1 RIEGEL, R., 200 l . Development of EST-PCR markers and monitoring their intrapopulational genetic variation in Picea abies (L.) Karst.- Theor Appl Genet, 103, s. 1223-1231. SCOTTI, I. 1 MAGNI, F. 1 PAGLIA, G. / MORGANTE, M., 2002b. Trinucleotide microsatellites in Norway spruce (Picea abies) : their features and the development of molecular markers.- Theor Appl Genet, 106, s. 40-50. SCOTTI, l. 1 PAGLIA, G. 1 MAGNI, F. 1 MORGANTE, M., 2002a. Efficient development of dinucleotide microsatellite markers in Norway spruce (Picea abies Karst.) through dot-blot selection.- Theor Appl Ge net, 104, s. 1035-l 041. WEIR, B.S . 1 COCKERHAM, C.C., 1984. Estimating F-statistics for the analysis of population structure. Evolution 38:1358-1370 WRIGHT, S. 1978. Evolution and the Genetics of Populations. Vol. 4: VariabHity within and among Natural Populations. Chicago: University of Chicago Press Zakon o gozdnem reprodukcijskem materialu.- Ur.l. RS 58/2002, 45/2004. GozdV 63 (2005) 9